本发明属于本发明涉及一种生物柴油生产用催化剂的制备方法。
背景技术：
目前生物柴油全部是用化学法生产，即用动物、植物油脂和甲醇或乙醇等低碳醇在碱性催化剂下，在高温下，转酯化生成甲酯或乙酯。化学法合成生物柴油有以下缺点：工艺复杂，醇必须过量，后续必须有相应的醇回收装置；能耗高，色泽深，由于脂肪中不饱和脂肪酸在高温下容易变质，酯化产物难于回收，成本高；生成过程有废碱液排放。
为解决上述问题，人们开始研究用生物酶法合成生物柴油，即动植物油脂和低碳醇通过脂肪酶进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯及乙酯。相对于化学法，酶法合成生物柴油具有条件温和、醇用量小，无污染物排放等优点，其中，酶及酶固定化成本较高成为酶法生产生物柴油仍不能工业化的重要原因。
脂肪酶通常是被固定于不溶性的固体载体上，这有利于提高脂肪酶的热稳定性、使用稳定性、结构稳定性，从而降低其使用成本。 另一方面，固定化载体也是影响固定化脂肪酶性能的一个重要的因素。目前报道较多的固定化载体为膜状物，如静电纺丝膜、中空纤维膜等，还有不少微观结构规整的纳米多孔材料，如 二氧化硅、碳酸钙、碳纳米管、氧化铝等， 但这类无机材料本身 、生物相容性较差，固定化的过程易引起蛋白构象的改变，在对其的修饰改性中又容易带入新的影响脂肪酶构象的因素，因此还需进一步改善。
技术实现要素：
本发明提供了一种生物柴油生产用催化剂的制备方法，该制备方法是使用丝瓜络为载体，通过物理吸附和共价耦合实现脂肪酶的固定化。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是这样的，一种生物柴油生产用催化剂的制备方法，包括如下步骤：
1）将正常生长成熟后的植物丝瓜果实，经过自然风干或烘干后，切割成1～5cm长的圆柱状体，除去表皮以及孔隙内部的丝瓜种子，得到圆柱状体丝瓜络；
2）将圆柱状体丝瓜络置于脂肪酶溶液中，在20-50 ℃下浸泡8-24小时，同时加入步骤2）的活化剂溶液，所述的活化剂为N,N-二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺与丁炔二酸二甲酯混合物，三者的物质的量比为1:0.5~2:0.05-0.2；
3）将上述载有脂肪酶的丝瓜络干燥后即得。
经文献研究以及发明人通过扫描电镜以及红外光谱等分析等测试手段的多方面因素的论证，发现：处理后的丝瓜络表面粗糙，有孔状结构，表面富含羧基、羟基等活性基团， 因这些性质的存在，使其可作为固定化脂肪酶的天然载体，因而，本发明在通过利用物理吸附将脂肪酶固定于丝瓜络孔状结构内外，同时还通过活性剂的加入，促使脂肪酶的羧基与丝瓜络表面的羧基、羟基共价耦合实现脂肪酶的固定化。
其中，所述的活化剂溶液是将活化剂与溶剂二甲亚砜混合而成，其中，活化剂的体积浓度为5-10%，活化剂溶液的加入体积与丝瓜络质量比为1:10-100 ml/g 。
优选地，脂肪酶溶液的浓度为1-10mg/mL。
有益效果：
1. 丝瓜络在固定化过程中能稳定脂肪酶的活性结构，另外由于丝瓜络的疏水性，能够避免水在载体表面过多的积累，从而为脂肪酶提供一个良好的微环境使固定化脂肪酶保持高活性。
2. 丝瓜络为多孔的结构，表面富含羧基、羟基等活性基团，可固载大量脂肪酶，因而脂肪酶的固载量高，其中部分通过脂肪酶通过共价结合固定在丝瓜络表面，因而固定化脂肪酶的稳定性好，且可循环使用次数多，循环使用10次后，固定化脂肪酶的酶活仍然能保持60%以上，提高了脂肪酶的利用率, 降低了因脂肪酶所致的产品成本。
3、处理方法简单，条件要求温和，易于实现。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，这些实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
在下述的实施例中，所述的脂肪酶溶液由Sigma或阿拉丁公司购买猪胰腺的冻干脂肪酶粉采用pH=7.0磷酸缓冲溶液配置而成。具体步骤为将一定量猪胰脂肪酶干粉溶于50mL 的磷酸缓冲液中，上述磷酸缓冲液浓度为0. 025-0.500mo1/ L，pH 值为7.5，4℃低温下搅拌均匀，在10000r/min 转速下离心10 min，然后取上清液贮于冰箱内备用。
实施例1
1）将正常生长成熟后的植物丝瓜果实，经过自然风干或烘干后，切割成3cm长的圆柱状体，除去表皮以及孔隙内部的丝瓜种子，得到圆柱状体丝瓜络；
2) 将N,N-二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺与丁炔二酸二甲酯以物质的量比为1:0.5：0.5混合后，加入至二甲亚砜中，配成浓度为5V%的活化剂溶液；
3）将100g圆柱状体丝瓜络置于100ml的4mg/mL脂肪酶溶液中，在20-50 ℃下浸泡8-24小时，同时加入步骤2）的1ml活化剂溶液，
3）将上述载有脂肪酶的丝瓜络置于室温下自然干燥后即得。
检测所述产品中胰脂肪酶的固载量为54.3 mg/g；所述的固定化脂肪酶的酶活为3739 U/g；固定化脂肪酶的酶活回收率为152%；
将一定量的菜籽油和甲醇置于圆底烧瓶中，菜籽油和甲醇的总加入量摩尔比为1:4，其中甲醇分三次加入，再加入相当于菜籽油质量10-20%的水和10-20% 正己烷的有机溶剂，混合均，然后将该混合物加入至反应器内，在实施1中的固定化脂肪酶作用下进行反应，控制反应温度为40℃，反应时间为14-24 h，将上述固定化脂肪酶在酯化反应后回收连续重复使用8次, 固定化脂肪酶的活性保持率位62.4%。
实施例2
1）将正常生长成熟后的植物丝瓜果实，经过自然风干或烘干后，切割成2cm长的圆柱状体，除去表皮以及孔隙内部的丝瓜种子，得到圆柱状体丝瓜络；
2) 将N,N-二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺与丁炔二酸二甲酯以物质的量比为1: 2.0: 0.2混合后，加入至二甲亚砜中，配成浓度为10V%的活化剂溶液；
3）将100g圆柱状体丝瓜络置于100ml10mg/mL脂肪酶溶液中，在20-50 ℃下浸泡8-24小时，同时加入步骤2）的10ml活化剂溶液，
3）将上述载有脂肪酶的丝瓜络置于室温下自然干燥后即得。
检测所述产品中胰脂肪酶的固载量为95mg/g；固定化脂肪酶的酶活为3939 U/g；固定化脂肪酶的酶活回收率为148%；
将一定量的菜籽油和甲醇置于圆底烧瓶中，菜籽油和甲醇的总加入量摩尔比为1:4，其中甲醇分三次加入，再加入相当于菜籽油质量10-20%的水和10-20% 正己烷的有机溶剂，混合均，然后将该混合物加入至反应器内，在实施2中的固定化脂肪酶作用下进行反应，控制反应温度为40℃，反应时间为14-24 h，将上述固定化脂肪酶在酯化反应后回收连续重复使用8次, 固定化脂肪酶的活性保持率大于65.0%。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。