一种葛仙米的培养方法及培养装置与流程

本发明属于藻类生物培养领域，涉及到葛仙米的培养方法及培养装置。

背景技术：

葛仙米(nostocsphaeroideskützing)是一种多细胞蓝藻，属于念珠藻，学名为拟球状念珠藻。葛仙米是一种可以食用蓝藻，因晋朝的道教理论学家、医学家和炼丹家葛洪的名字及其经历而命名，本草纲目中还记载其有治疗夜盲症、脱肛等疾病的功效。野生葛仙米还有丰富的蛋白质、胞外多糖以及各种微量元素，其蛋白质含量高达52％且其氨基酸种类齐全，还总糖含量20％左右的(其中生物活性的多糖高达8％-12％)，因此其能广泛的应用到食品、医药和保健等领域；现在有很多学者对其多糖和脂肪酸进行了研究，发现其多糖具有抗氧化活性、抗病毒和抗菌活性和增强机体免疫力等功效，其脂肪酸还对心脏病有一定治疗效果。因其特殊的生长环境，所以野生葛仙米只存在中国的少数山区的水稻田里。但由于现代农业的发展所带来的化肥和农药的滥用，而导致野生葛仙米的产量急剧减少，已经无法达到人们的应用要求，因此人工培养是必然趋势。对于人工培养葛仙米，如何增大葛仙米生物量，如何降低其培养的成本是其未来产业化、市场化的主要屏障。

目前葛仙米的培养方法主要为液体浸没法，典型的光生物反应器有开放式跑道池以及玻璃平板式生物反应器。浸没法是将藻浸没在大量的培养液中，通过搅拌设备或循环设备或曝气设备，使培养液持续处于循环运动状态，使每个葛仙米细胞能够均匀地接受光照、吸收co2以及使葛仙米细胞不沉积在反应器底部。然而，该培养方法和装置有一个共同缺点就是能耗大、生物量低(葛仙米的细胞干重仅为0.4g/l)，且光利用效率低、空间利用率低、耗水量大，易于被机械搅拌件的剪切力损坏细胞结构(高速搅拌时)，其中以能耗大、光利用效率低、耗水多、空间利用率低以及易于被搅拌叶片损坏细胞结构为其主要弊端。

因此，传统的浸没法培养微藻，其单位成本高是业界所公认的难题，也是产业化亟需解决的问题。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种葛仙米培养方法，用以解决目前葛仙米培养中存在的单位成本高的问题。

本发明的第二个目的在于提供一种适合所述培养方法的培养装置。

为实现上述目的，本发明首先提供一种微藻培养方法，其是将微藻于薄层培养液中静置培养，使所述微藻能够直接利用薄层培养液表面吸收的co2。

其中，所述培养液的厚度可以是1mm～20mm，优选培养液的厚度为2mm～10mm。

基于此，本发明进一步提供一种葛仙米的培养方法，其是将葛仙米于薄层培养液中静置培养，使所述葛仙米能够直接利用薄层培养液表面吸收的co2。其中，所述培养液的厚度是葛仙米粒径范围的1～4倍，葛仙米干种的粒径是0.4mm左右，葛仙米的鲜粒的直径大约是1.0mm～5mm之间。所述培养液的厚度可以是1mm～20mm，优选培养液的厚度为2mm～10mm。

其中，所述静置培养的环境温度可以是20-28℃。

其中，所述静置培养的光强度可以是2～526μmol·m^-2·s^-1,更优选为16.9～274.6μmol·m^-2·s^-1。

其中，所述静置培养的培养基可以是无氮元素的bg11液体培养基。

其中，所述静置培养的环境湿度范围可以是80-99％。

其中，葛仙米接种量可以是0.1-0.9g/l。

进一步，本发明提供一种适合上述微藻静置培养的层叠式微藻薄层培养装置，其包括多个层叠式分布的培养平板，所述培养平板包括底板和围绕底板与底板紧密相连的围堰，所述围堰的最低处高度为1mm-20mm，上下相邻两培养平板之间间隔一预定距离。

其中，上下相邻两培养平板之间具有支撑部件，支撑部件使上下相邻培养平板之间形成所述的预定距离。

其中，所述支撑部件可分别与上下相邻两培养平板的围堰或底板相连接。

支撑部件可以是一套固定支撑系统，例如支撑架或者支撑柱等，将培养板连接成培养板矩阵，或者采用悬吊系统使培养板连接成培养板矩阵。例如在本发明的一实施方式中所述支撑部件为支撑柱。

其中，上下相邻两培养平板底板与底板之间的间距为5～30mm。

其中，所述培养平板的底板和/或围堰的材料优选为透明材料，包括但不限于以下透明材料：玻璃、gpps、abs、苯乙烯丙烯腈、pvc、pmma、聚碳酸脂或聚苯乙烯。

其中，所述支撑部件的材料优选为透明或透光材料。

其中，所述培养平板可以是一体成型的。

其中，所述培养平板与所述支撑部件可以是一体成型的。

其中，所述培养平板的底板材料可以是平板玻璃，所述培养平板的围堰材料可以是透明胶条。

其中，在所述薄层培养装置的至少一个侧面还可设置有光源。

本发明采用薄层静态培养方法，由于培养液的厚度足够小，因此不需要搅拌混合等均质化操作，也不需要向培养液内通入co2，仍然能够保证培养液内藻细胞可以较为均匀地获得光照，并且能够气体交换，从培养液的液面获得藻细胞光合作用所需要的co2和排放对光合作用产生抑制的o2。因此，本发明的培养方法具有节约能耗，降低培养成本的优势。发明人突破传统的用大容量器皿进行的浸没式培养方法，本发明是首次引入薄层、静态培养的处理方式，其实质是介于浸没法和半干法之间的一种新型培养方法。

本发明的培养装置，可以实现高密度层叠，每层之间具有间隙，可供光线传播至较远的距离，因此，在光线可及的范围内都能培养葛仙米。如此便直接增大了单位面积光源的生物质产量。又因为薄层、静态式培养，因此节省供碳、搅拌等能耗。

附图说明

图1是本发明培养装置的一个示意图(主视图)。

图2是本发明培养装置的培养平板示意图。

图3是本发明培养装置的另一个示意图(侧视图)。

图4a是本发明一种实施方式的俯视图，用面积为120mm*60mm的培养片在1㎡光源下培养，光源高1m，宽1m，培养平板共7排，与光源垂直。

图4b是传统培养方式中的跑道池示意图(俯视图)，跑道池表面积为2.5m²。

图4c是传统培养方式中金鱼池式反应器示意图(立体图)，其长宽高分别为55cm、20cm和45cm。

图5是本发明葛仙米培养，距离光源不同远近情况下测得的光强度值及葛仙米细胞干重。

图中：1培养平板，11底板，12围堰，2支撑部件，3光源。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细说明，但不应理解为对本发明的限制。

本发明提供的葛仙米培养方法，其是将葛仙米于薄层培养液中静置培养，使所述葛仙米能够直接利用薄层培养液表面吸收的co2。

培养液厚度以不高于20mm为宜，优选1.5-10mm，更优选2～10mm，可以为大约1mm、大约2mm、大约3mm、大约4mm、大约5mm，7mm、10mm或所述任意值之间的范围。培养液厚度过大，通过培养液表面与空气交互获得的co2则不足以支持葛仙米的持续培养，且光能量损失较多，液面以下的藻种无法吸收足够的光强。另外，培养液厚度过小，例如低于0.3mm，一方面由于培养液太薄，一些长得粒径较大的鲜葛仙米的局部可能会被裸露到培养液之外影响生长，且水分的挥发不利于培养，同时培养量减少，也不经济。

当然，以上是基于常规培养条件进行的。如果通过提高co2浓度、改善光照条件等措施，培养液的厚度可以有所增加。

由于本发明的方法中培养基的厚度足够小，使得葛仙米细胞能够通过气体交换从培养液的液面直接获得光合作用所需要的co2和并排放对光合作用产生抑制的o2，因此不需要向培养液进行通气操作。此外，不需要搅拌混合等均质化操作，仍然能够保证培养液内的葛仙米细胞可以较为均匀地获得光照。

藻体收获和干燥是藻类培养的重要步骤，其能耗大，效率低。然而，根据本发明的方法，使用薄层液体培养基静态培养葛仙米，在藻生长至成熟的时候(一般大约8-12天)，培养基通常被消耗掉大部分。此时，细胞干重已达较高比值，非常有利于藻体收获、干燥。在本发明的培养液厚度范围内(1mm-10mm)，可以根据葛仙米接种量、光强、湿度和温度等因素对培养基的厚度进行调整，使得培养基的量恰好可供藻生长到成熟期而不会有过多的富余。此外，由于藻体一直处于薄层培养液中，较不易生霉菌。

在一些实施方式中，所述葛仙米培养方法中使用的温度为20-28℃。在一些实施方式中，所述葛仙米培养中使用的光强为2-526μmol·m^-2·s^-1。在一些实施方式中，所述葛仙米培养中使用的培养基是无氮元素的bg11液体培养基。在一些实施方式中，所述葛仙米培养中的环境湿度范围是80-99％。在一些实施方式中，所述葛仙米培养中，葛仙米接种量可以是0.1-0.9g/l。

本发明的葛仙米培养方法采用薄层静态培养的方式，其实质是介于浸没法和半干法之间的一种新型葛仙米培养方法，如上所述，具有节约能耗，降低培养成本，减少霉菌、可有效控制其他敌害浮游动植物爆发式污染风险的优势。

本发明提供的一种适合上述葛仙米静置培养的层叠式葛仙米薄层培养装置，其包括多个层叠式分布的培养平板，所述培养平板包括底板和围绕底板与底板紧密相连的围堰，所述围堰的最低处高度为1mm-20mm，上下相邻两培养平板之间间隔一预定距离。

由于采用薄层培养，因此培养平板所承受的重量相对较低，因此可以更为轻薄，从而可以提高培养平板的透明度，有利于光的穿透。并且，由于各层培养板之间有间隙，围堰亦为透明材质，因此光可以从侧面进入到培养平板的上面和底面，使得其中培养的葛仙米受光更充分和均匀，大大提高了光源的利用效率。

所述培养平板的长度例如可以是10cm-10m，宽度例如可以是5cm-1m。厚度可以是0.5mm～2.0mm，根据材料的不同，厚度可以进行调整。各培养平白在竖直方向上层叠布置，使结构集成化，单位占地空间的有效培养面积最大化。

所述围堰可以是垂直于底板，或者与底板成一定程度的倾角。例如，为了便于收获葛仙米，可以将至少一侧或一部分围堰与底板呈大于90°的倾角(即围堰向外侧倾斜)，例如呈135°角。此外，围堰与底板结合部位可以是圆角，这样可以防止形成收获死角或清洁死角。

围堰的高度可以相同，也可以不同。围堰高出底板的距离可以是1-20mm，优选是2mm～10mm，可以为大约1mm、大约2mm、大约3mm、大约4mm、大约5mm，7mm、10mm，或所述任意值之间的范围。

围堰与底板可以单独制作再结合到一起或者是一体成型。这些均可以根据制备难度及成本因素作出适当调整。

形成培养平板的底板和围堰材料可以为玻璃或透光率高的塑料，如gpps，透明abs，as(苯乙烯丙烯腈)，pvc、pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)，pc(聚碳酸脂)，ps(聚苯乙烯)等。围堰与底板的材料可以相同也可以不同，例如可以用其它透明材料，如胶条、玻璃胶等。

各培养平板之间的间距根据光源布置、葛仙米的培养和收获要求来确定。例如，可以为5mm-30mm。

在上下相邻两培养平板之间具有支撑部件，支撑部件使上下相邻培养平板之间形成所述的预定距离。所述支撑部件可分别与上下相邻两培养平板的围堰或底板相连接。支撑部件可以是一套固定支撑系统，例如支撑架或者支撑柱等，将培养板连接成培养板矩阵，或者采用悬吊系统使培养板连接成培养板矩阵。例如在本发明的一些实施方式中所述支撑部件为支撑柱。在另一些实施例中，不采用支撑部件，而是采用一种具有若干个栅格的支架，将这些若干个平板玻璃制成的培养平板分别搁置在这些支架上，各培养平板之间保持一定间距。该支架配置有调平系统，可平稳地立在地面，而各个栅格也设有调平结构，可抵消误因差引起的培养平板表面不水平的问题。

所述培养平板与所述支撑部件可以是一体成型的，也可以单独制备再组合到一起。例如，支撑部件为支撑柱，可以将支撑部件固定安装在相应培养平板的底部，或者是一体成型的方式，形成包含培养平板和支撑部件的单元，再组成层叠的培养装置。

此外，所述培养装置还可包括若干排所述层叠的培养平板，形成培养阵列，从而实现大规模培养。

另外，本发明葛仙米培养装置还可进一步包括培养液滴注系统，包括滴注头、培养液箱、连接滴注头及培养液箱的管道，控制滴注开启或关闭的控制电路，感应培养平板中培养液液位的传感器等，传感器将液位信号发送给控制电路，控制电路根据液位信号控制滴注系统的开启或关闭。当然，通常而言通过本发明初始设置的培养厚度及相关培养条件，可以不使用该滴注系统。

在使用本发明葛仙米培养装置培养葛仙米时，可以将所述培养装置置于具有温度调节系统、湿度调节系统以及光照系统的温室中，通过温室提供相对恒定的温度、湿度以及光照条件等等，避免培养基过快挥发，使葛仙米始终处于适宜的生长环境。

由于本发明是介于传统浸没式和半干式之间的一种薄层、静态、高密度层叠的培养方式，其中培养基的厚度可根据培养的藻的类型和生活习性、以及环境因素等、根据经验值，事先计算和预估，环境湿度可人为控制，使当葛仙米培养到达收获时，细胞干重比重已经处于相对较高的范围，给后期收获节省能耗。而且本发明的培养装置中藻尚且处于薄薄的培养液中，较不易生霉菌，也可以将敌害污染控制在局部范围内。

假定每个平板层的自身厚度为1.5mm，而支撑柱的高度约5～20mm，液厚为2.5mm；那么在1m高度空间下可以叠起45～153层，若在每一层平板的围堰内上培养葛仙米，则1m高度范围内能够养殖的生物量相当可观的，经实验计算可达到细胞干重1608g/m³，光照面积生产率高达10.7g·m^-2·d^-1(干物质)，单位质量的葛仙米的能耗约560kj/g。

实施例1层叠式葛仙米薄层培养装置

如图1所示，在本例中所述培养装置包括多个层叠式分布的培养平板1，培养平板1(图2)包括底板11和围绕底板11与底板11紧密相连的围堰12，围堰12高于底板11约1-20mm，底板11与围堰12形成葛仙米的培养空间，上下相邻两培养平板1之间间隔一预定距离。

在上下相邻两培养平板1之间具有支撑部件2，支撑部件2使上下相邻培养平板1之间形成所述的预定距离。本例中支撑部件2为支撑柱。上下两相邻培养平板1由多个支撑柱支撑，每个支撑柱的顶端与底端分别与两培养平板1的底板11相接。

支撑柱的形状、材料、数量、间距以及布置方式可以不限制，只需支撑柱具有一定强度，足够支撑在上面堆叠的培养板及培养板内的培养液。支撑柱采用透明材质，如玻璃、亚克力、pc等材质。支撑柱可具有任何适宜的形状，包括但不限制于圆柱形、圆管形、方形、长条形等。

如图3所示，在所述培养装置的一侧具有光源3，与一般的光源设置于培养系统的上侧或顶部不同，本例中的光源3是设置在培养装置的侧面，与培养平板1垂直。

由于本发明采用薄层培养，因此培养平板所承受的重量相对较低，因此可以更为轻薄，从而可以提高培养平板的透明度，有利于光的穿过。并且，由于各层培养板之间有间隙，围堰亦为透明材质，因此光可以从侧面进入到培养平板的上面和底面，使得其中培养的葛仙米受光更充分和均匀，大大提高了光源的利用效率。

实施例2葛仙米薄层静置培养及与传统培养方式的比较

为了显示本发明的培养方法和培养装置的有益技术效果，以下以“单位面积光源产率”“单位质量藻粉耗能”“成本”“单位光源面积耗水量”四个与产业化效益直接相关的因素来考察，并以实验进行了验证。

实验组：

如图4a所示，采用实施例1所述的薄层培养装置及培养方式，左侧为长度为1m、高度为1m的光源3，光强274.6μmol·m^-2·s^-1。右侧为培养平板阵列，培养平板为玻璃材质，规格为120mm*60mm，玻璃厚度为1.5mm。围堰的高度为2.5mm(培养液厚)。每个培养平板可容纳的藻液量为18ml(120mm*60mm*2.5mm)。支撑柱高度为10mm。在垂直方向上层叠至1m。环境温度控制25度左右，相对湿度80％-99％。培养液为无氮元素的bg11液体培养基初始接种干重为0.3g/l。整个环境在一个完全遮蔽自然光的情况下做实验，排除自然光的干扰。

在培养之初，经光强检测仪检测，靠近灯源第1排至第7排，培养基表面的光强为图5。从图5可以看出，由于层叠的平板之间有支撑柱，层与层之间存在大量细小的间距，光线总可以通过层间的间隙往右侧连续传递过去，且越远的地方光强越弱。(下图从左到右依次是第7排、第6排……第1排培养基表面的光强值)

而经观察，第1排的玻璃片由于接近光源，生长状况最好，越远离光源灯板生长状况越差，第7和6排的生长情况最差。待培养11天之后进行收获，收获时，根据不同排数分别进行统计藻生物总量，生长情况如图5的柱状图。从中可以看的是，第6和7排的藻虽然干重较小，但由于光线可以达到该处，因此该处的葛仙米依然可以获得光源并生长。(上图从左到右依次是第7排、第6排……第1排收集的生物量(纵坐标))

将上述模型中所有平板层收获的藻合计一起，总量为145.2g。培养液总体积v＝(1000/100)×7×18ml×(1000/11.5)＝90.3l，则计算平均收获的藻干重密度为1.608g/l。

对照组1：

采用金鱼缸培养室内培养(图4c)室内培养。培养条件如下：培养光强为120-250μmol·m^-2·s^-1，培养温度为25℃，用气泵通入气体，通气量为0.1-1l/min，接种密度为0.1g/l(干重)。

对照组2：

采用金鱼缸(图4c)在室外进行培养。培养条件如下：培养温度为室外环境温度，培养光强为自然光，用气泵通入气体，通气量为0.1-1l/min，接种密度为0.02g/l(干重)。

对照组3：

采用开放式跑道池室外培养(图4b)。培养条件如下：培养温度为室外环境温度，培养光强为自然光，0.75kw的搅拌机电动搅拌，接种密度为0.05-0.13g/l(干重)。

对于跑道池而言，其培养液位较高，而光在水中衰减极快，所以导致光线难以穿透到跑道池的底部，且跑到池要不断使用搅拌泵搅拌循环。

对于玻璃缸也同样需能耗驱动搅拌装置，同时1㎡强度为274.6μmol·m^-2·s^-1光源的右侧发出的光线仅能供一个金鱼缸中葛仙米的生长【同样是在不考虑自然光的情况下】，再往右侧排布的金鱼缸已经无法获得有效光源了，因此这两种反应器均对光能的利用率较低。即整个环境在一个完全遮蔽自然光的情况下做实验，排除自然光干扰。1㎡的光源照射传统的平板容器型反应器的一个侧面，平板容器侧面为1㎡，宽度为20cm，光线穿过20cm藻液后的光强剧烈减弱(测定光能损失率达到95％以上)，光强度无法供藻正常生长，导致1㎡的光源仅能直接照射排在最近的第一排金鱼缸培养容器。(如图4c)。

试验结果及结论：

按照上述实验组和对照组的模型，将本发明的薄层、高密度层叠培养装置与传统的平板型容器比较如下(均以1㎡强度为274.6μmol·m^-2·s^-1光源为参考对象)：

由以上可知本发明薄层培养方法，在单位面积光源产率、能耗成本以及耗水量等方面，均显著优于传统的培养方式。

此外，由于本发明培养方法和装置是以静态的方式培养，期间无需供高压co2实现气浮式搅拌，也无需循环泵、搅拌桨等均质化等能耗设备，且本发明方法收获的藻已处于半湿状态，减少收获后浓缩的能耗。

此外，按照实验组的培养方式及条件，在接种密度为0.1g/l，0.3g/l，0.6g/l，0.9g/l时本发明单位面积光源产率分别为6.8g·m^-2·d^-1，10.7g·m^-2·d^-1，8.05g·m^-2·d^-1、8.3g·m^-2·d^-1。由结果可知接种密度0.3g/l时单位面积光源产率最高，但是其他接种密度的单位面积的产率依然较传统的平板型容器要高很多。因而目前得到的结果是接种密度为0.1-0.9g/l时，能耗的利用效率较高。

此外，若按照实验组的培养方式及条件，接种密度0.3g/l，培养液厚分别为1mm、1.5mm、2mm、3mm、5mm、7mm、10mm、15mm、20mm时，层间距为25mm时的本发明单位面积光源产率分别为4.47g·m^-2·d^-1、4.86g·m^-2·d^-1、5.21g·m^-2·d^-1、7.79g·m^-2·d^-1、9.60g·m^-2·d^-1、8.33g·m^-2·d^-1、5.85g·m^-2·d^-1、5.09g·m^-2·d^-1、3.87g·m^-2·d^-1；其中培养液的厚度为2mm到10mm时，葛仙米对光的利用效率较高。