本发明属于茄尼醇提取
技术领域：
，具体涉及一种提高废次烟草中茄尼醇溶浸的金属-酶制剂共催化方法。
背景技术：
：茄尼醇是三倍半萜醇，天然存于烟叶（总重的0.3％～3％）、马铃薯叶（约为1.5%左右）、桑叶（约0.1%）等中，具有较强的抗癌生物活性，常作为药物合成的重要原料，应用于：①合成泛醌类化合物如辅酶q10；②合成治疗肿瘤药物；③合成抗溃疡药物；④合成治疗心脑血管病药物；⑤合成抗艾滋病毒药物，具有广阔的应用前景。现有茄尼醇提取技术主要有溶剂萃取法、超临界萃取法、聚合态共沉淀法、鲜法匀浆萃取法以及分子蒸馏技术等，或多或少能有效降解木质纤维素促进天然茄尼醇的溶出，但强酸（碱）、高温（压）等工艺条件不仅导致高能耗、高污染，而且易使茄尼醇发生加成、氧化、脱氢及分子重排反应等，降低资源利用率。因此，研究提高茄尼醇的提取方法，具有非常重要的意义。现有提取茄尼醇的方法，如2014年10月1日公开的公开号为cn104072336a的“一种提取茄尼醇的工艺”，公开的方法是以废次烟叶为原料，采用超临界层析法，利用超临界二氧化碳的良好选择性和树脂的选择性，经原料预处理、一级萃取、二级萃取、三级萃取、洗脱后重结晶、过滤和干燥，获得茄尼醇。其中，一级萃取为粗提，利用超临界二氧化碳溶浸废次烟叶中所有组分，原料填充率为80%，萃取温度为65-75℃；二级萃取利用萃取釜中吸附剂（分子筛、三氧化二铝或活性炭）完成脱蜡、脱脂和除杂，温度为60-70℃；三级萃取利用具有选择性的色谱硅胶或树脂完成茄尼醇的吸附，并采用乙酸乙酯或石油醚洗脱，获纯度为95%的茄尼醇。该方法的主要缺点是：（1）该方法利用利用超临界二氧化碳溶浸烟叶中茄尼醇，但同时也增强了烟叶中其他组分的溶出，因溶出组分的多样性加大了杂质去除难度，故采取三级萃取工序，进而增加生产设备，加大生产成本；（2）该方法三级萃取各阶段采取不同功能的吸附剂，增加生产原料，增加生产成本；（3）该方法二级萃取中采用具有吸附功能的分子筛、三氧化二铝或活性炭为吸附剂，虽完成脱蜡、脱脂和除杂，但也会吸附茄尼醇，减少三级萃取中茄尼醇的提取率，减低生产产量；（4）该方法生产需使用超临界技术，且过程中萃取温度高于60℃，不仅需要特殊的生产设备，还需外加热源设备，进一步增加生产成本。技术实现要素：本发明的目的是，针对现有提取茄尼醇方法的不足，提供一种提高废次烟草中茄尼醇溶浸的金属-酶制剂共催化方法，具有反应条件温和、操作步骤少且简单、茄尼醇溶浸充分且杂质少、生产能耗和成本低等特点。本发明的机理是：本发明以废次烟草为原料，选用工程酶（木聚糖酶：纤维素酶：漆酶）作为催化活化木质纤维素的酶制剂、锰系催化剂为酶制剂的激活剂，通过木聚糖酶和漆酶降解烟草中桎梏纤维素的木质素，增加纤维素酶对纤维素的水解作用，通过金属催化剂提高酶制剂的催化活性，增强阻碍茄尼醇溶出的烟草植物纤维组织的水解程度，提高植物组织通透性，减小茄尼醇传质阻力，增大茄尼醇提取率。二者协同催化水解烟草植物纤维组织，因酶的专一性，减少烟叶中其他活性成分的溶出，同时避免化学活化剂酸、碱的使用量，减少了茄尼醇生产安全隐患，避免酸碱使用加大对环境造成的二次污染，有利于环境保护，实现废次烟草资源化再利用。实现发明目的的技术方案是：一种提高废次烟草中茄尼醇溶浸的金属-酶制剂共催化方法，以废次烟草为原料，经原料预处理、金属-酶制剂共催化反应、超声波协同处理、茄尼醇产品制备得到产品。所述方法的具体步骤如下：（1）原料预处理以烟草固体废弃物（包括废次烟叶、烟梗、烟草加工过程中的下脚料及提取烟草总天然产物的烟渣等）为原料。先将原料用水清洗干净后，放置于烘箱中，先在85～110℃的烘箱中烘30～90min，再经粉碎机粉碎后、并过20～120目筛，未过筛的原料返回粉碎机中再粉碎，收集过筛原料（即为预处理后的原料）。（2）金属-酶制剂共催化反应第（1）步骤完成后，先按照第（1）步处理后的原料质量(g)∶催化剂质量(g)∶水的体积(ml)之比为1∶0.0125～0.075∶5～15的比例，在第（1）步预处理后的原料中，加入催化剂及水，搅拌均匀后，再用硫酸或氢氧化钠稀溶液调节体系的ph值为4～8，然后将调节ph值后的混合液放置于摇床中，在水浴温度为20～45℃下进行酶解活化4～8h，用抽滤泵进行抽滤，分别收集滤液和滤渣。收集的滤液为含有茄尼醇的水相提取液；收集的滤渣为经催化剂催化活化后的烟草基料。所述的催化剂为金属和复配酶的金属-酶制剂，其投加量之比为金属催化剂（g）∶酶制剂（g）=1:1.6～10；所述的金属为锰锌铁氧体（mn0.3zn0.2fe0.5ox）或mn2+或fe3+；所述酶制剂为酶活比为木聚糖酶：纤维素酶：漆酶=2～14∶23～47∶51～64的复配酶。（3）超声波协同处理第（2）步骤完成后，先将第（2）步收集的滤渣，即烟草基料转入到浸提容器中，再按照第（1）步骤预处理后原料的质量(g)∶复合萃取剂溶液的体积(ml)之比为1∶8～12的比例，在浸提容器中加入复合萃取剂溶液，搅拌混合均匀，并在超声波功率100～200w、温度30～55℃条件下进行超声波处理5～40min后，用抽滤机进行抽滤，分别收集滤液和滤渣。对收集的滤渣作为制备吸附材料的原料；将收集的滤液转入离心机中，在离心转速为3000～4000r/min条件下，进行离心分离10～40min后，分别收集离心清液（即为含茄尼醇的提取液）和离心渣。对收集的离心渣转入第（2）步中滤渣，作为制备吸附材料的原料；对收集的离心清液通过高效液相色谱法测定茄尼醇的浓度，即按高效液相色谱法的流动相乙醇∶甲醇的体积比为1∶4～9的比例，在流速为0.6～1.2ml/min，柱温20～30℃条件下，测定收集的离心清液中的茄尼醇质量浓度及溶出率。茄尼醇溶出率为92.00～98.70%，溶出率提高15.00～24.90%。所述的复合萃取剂溶液为乙醇∶甲醇的质量浓度比为1∶1～9的乙醇和甲醇的混合液。（4）茄尼醇产品制备第（3）步骤完成后，先将第（3）步收集的离心清液放置于在旋转蒸发器中，在真空压强为0.1～0.6mpa、温度为30～60℃下，进行减压浓缩至粘稠状得茄尼醇粗制品。然后，按照茄尼醇粗制品的质量(g)∶复合提取剂溶液的体积(ml)之比为1∶3～6的比例，在浸提容器中加入茄尼醇粗品和复合萃取剂溶液，混合溶解均匀。最后，通过旋转蒸发器，在真空压强为0.1～0.6mpa、温度为30～60℃下，进行减压浓缩重复2～4次，制得茄尼醇产品。茄尼醇提取率达90.0～97.5%，纯度高达91.0～94.0%%。本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果：（1）本发明选用金属催化剂和复配酶作为催化活化木质纤维素的协同活化剂，提高茄尼醇的提取率。再经金属-酶制剂协同催化降解烟草木质纤维素，能提高酶制剂的生物活性，进而提高烟草内部通透性，减少茄尼醇溶出传质阻力，促使茄尼醇溶浸充分，因此，本发明方法所得茄尼醇溶出率为98.64%，比超声醇提法提高24.90%，其提取率可达97.3%。（2）本发明用金属-酶制剂代替传统化学活化剂酸碱浸提茄尼醇和烟碱，减少酸碱等化学试剂对茄尼醇生物活性的破坏，其浸提液中干扰组分较少，生物活性保留完备，能确保产品质量。用酶代替活化剂酸碱，同时避免了生产过程中酸碱对生产设备的腐蚀而缩短生产设备使用寿命，有利于环境保护，又降低生产成本。（3）本发明采用的烟草固体废弃物经酶（纤维素酶或木质素或纤维素酶和木质素酶复配酶）催化活化条件在20～40℃最佳，酶解时间仅为7.5小时，反应条件温和，操作简单，且提取茄尼醇使用的有机溶剂为甲醇和乙醇，减少高温或大量有毒有机溶剂提取茄尼醇的生产安全隐患，减少生产过程中环境治理成本的同时，提高生产安全性能，又降低能耗。（4）本发明方法的原料来源广，废物利用充分，生产成本低，操作简单，方法绿色环保。本发明方法可广泛应用于固体烟草废弃物为原料提制茄尼醇，也可广泛应用于从固体烟草废弃物中烟碱、果胶、纤维素的提取。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进一步说明。实施例1一种提高废次烟草中茄尼醇溶浸的金属-酶制剂共催化方法的具体步骤如下：（1）原料预处理将40g废弃的烟叶洗净，晾干后，放置于烘箱中，在100℃的烘箱中烘30min后取出，经粉碎机粉碎后过60目的分子筛筛分，得到粒径小于60目的烟叶，用塑料袋分装，备用。（2）金属-酶制剂共催化反应第（1）步骤完成后，先按照第（1）步处理后的原料质量(g)∶催化剂质量(g)∶水的体积(ml)之比为1∶0.035∶10的比例，在第（1）步预处理后的原料中，加入催化剂及水，搅拌均匀后，再用硫酸或氢氧化钠稀溶液调节体系的ph值为7，然后将调节ph值后的混合液放置于摇床中，在水浴温度为45℃下进行酶解活化7.5h，用抽滤泵进行抽滤，分别收集滤液和滤渣。收集的滤液为含有茄尼醇的水相提取液；收集的滤渣为经催化剂催化活化后的烟草基料。所述的催化剂为金属和复配酶的金属-酶制剂，其投加量之比为金属催化剂（g）∶酶制剂（g）=1:5；所述的金属为锰锌铁氧体mn0.3zn0.2fe0.5ox；所述酶制剂为酶活比为木聚糖酶：纤维素酶：漆酶=14∶23∶63的复配酶。（3）超声波协同处理第（2）步骤完成后，先将第（2）步收集的滤渣，即烟草基料转入到浸提容器中，再按照第（1）步骤预处理后原料的质量(g)∶复合萃取剂溶液的体积(ml)之比为1∶10的比例，在浸提容器中加入复合萃取剂溶液，搅拌混合均匀，并在超声波功率200w、温度50℃条件下进行超声波处理25min后，用抽滤机进行抽滤，分别收集滤液和滤渣。对收集的滤渣作为制备吸附材料的原料；将收集的滤液转入离心机中，在离心转速为4000r/min条件下，进行离心分离15min后，分别收集离心清液（即为含茄尼醇的提取液）和离心渣。对收集的离心渣转入第（2）步中滤渣，作为制备吸附材料的原料；对收集的离心清液通过高效液相色谱法测定茄尼醇的浓度，即按高效液相色谱法的流动相乙醇∶甲醇的体积比为1∶6的比例，在流速为0.8ml/min，柱温25℃条件下，测定收集的离心清液中的茄尼醇质量浓度及溶出率。茄尼醇溶出率为98.64%，溶出率提高24.9%。所述的复合萃取剂溶液为乙醇∶甲醇的质量浓度比为1∶5.5的乙醇和甲醇的混合液。（4）茄尼醇产品制备第（3）步骤完成后，先将第（3）步收集的离心清液放置于在旋转蒸发器中，在真空压强为0.2mpa、温度为45℃下，进行减压浓缩至粘稠状得茄尼醇粗制品。然后，按照茄尼醇粗制品的质量(g)∶复合提取剂溶液的体积(ml)之比为1∶5的比例，在浸提容器中加入茄尼醇粗品和复合萃取剂溶液，混合溶解均匀。最后，通过旋转蒸发器，在真空压强为0.2mpa、温度为45℃下，进行减压浓缩重复3次，制得茄尼醇产品。茄尼醇提取率达97.3%，纯度高达93.5%。实施例2一种提高废次烟草中茄尼醇溶浸的金属-酶制剂共催化方法的方法，同实施例1，其中：第（1）步中，选用烟草目数为20目，烘箱温度为85℃，烘干时间为90min。第（2）步中，烟草固体废弃物的质量(g)∶催化剂质量(g)∶水的体积(ml)之比为1∶0.0125∶5的比例。采用盐酸溶液调节体系的ph值为4，酶解水浴温度为25℃。酶解活化烟草基料8h。所述的金属-酶制剂投加量之比为金属催化剂（g）∶酶制剂（g）=1:1.6；所述酶制剂为酶活比为木聚糖酶：纤维素酶：漆酶=2∶47∶51的复配酶。第（3）步中，预处理后的烟草固体废弃物的质量∶复合萃取剂溶液体积比为1:8，复合萃取剂乙醇∶甲醇的体积比例为1∶1。超声波功率为200w、超声温度为30℃，超声时间为5min；滤液离心转数为4000r/min，离心时间为25min。高效液相色谱法流动相乙醇和甲醇的体积比例为1∶9，流速为1.2ml/min，柱温为30℃。茄尼醇溶出率为92.03%，溶出率提高16.56%。第（4）步中，抽滤真空压强为0.6mpa、浓缩温度为60℃。茄尼醇粗制品的质量(g)∶复合提取剂溶液的体积(ml)之比为1∶3。茄尼醇提取率达95.9%，纯度达91.5%。实施例3一种提高废次烟草中茄尼醇溶浸的金属-酶制剂共催化方法的方法，同实施例1，其中：第（1）步中，选用烟草目数为120目，烘箱温度为110℃，烘干时间为30min。第（2）步中，烟草固体废弃物的质量(g)∶催化剂质量(g)∶水的体积(ml)之比为1∶0.075∶15的比例。采用盐酸溶液调节体系的ph值为6，水浴温度为45℃。酶解活化烟草基料4h。所述的金属-酶制剂投加量之比为金属催化剂（g）∶酶制剂（g）=1:10；所述酶制剂为酶活比为木聚糖酶：纤维素酶：漆酶=2∶34∶64的复配酶。第（3）步中，预处理后的烟草固体废弃物的质量∶复合萃取剂溶液体积比为1:12，复合萃取剂乙醇∶甲醇的体积比例为1∶9。超声波功率为100w、超声温度为55℃，超声时间为40min；滤液离心转数为3000r/min，离心时间为10min。高效液相色谱法流动相乙醇和甲醇的体积比例为1∶4，流速为0.6ml/min，柱温为20℃。茄尼醇溶出率为95.30%，溶出率提高20.7%。第（4）步中，抽滤真空压强为0.1mpa、浓缩温度为30℃。茄尼醇粗制品的质量(g)∶复合提取剂溶液的体积(ml)之比为1∶6。茄尼醇提取率达93.2%，纯度达92.0%。实验结果1、采用实施例1的方法与其他方法溶浸茄尼醇的比较表1提制茄尼醇产品与复配酶催化水解以及超声醇提方法的比较方法浓度（mg/ml）溶浸率（%）溶浸提高率（%）提取率（%）纯度（%）有机溶剂使用量（ml）反应温度（℃）浸提时间（min）金属-酶制剂解工艺0.179498.6424.9097.3093.50204530复配酶催化水解0.168792.7617.4992.8091.0204530超声醇提0.143578.95__78.9575.605050、加热50从上述实验知：本发明采用金属-酶共催化活化处理烟草固体废弃物制备活性炭，当投加与固体烟叶废弃物质量比为1：0.035的酶（木聚糖酶：纤维素酶：漆酶酶活比为14∶23∶63），加入水体积比为1：10，在水浴近室温条件下45℃，酶解时间为7.5h，经复合提取剂协同超声处理可制得茄尼醇产品，同时可获得附产物烟碱。其中烟草酶解活化基料质量(g)∶复合提取剂溶液体积(ml)之比为1:10，复合提取剂乙醇：甲醇的体积比例为1∶5.5，超声波功率为200w、超声温度为50℃，超声浸提时间为25min。该方法茄尼醇溶出充分，其溶浸率为98.64%，比超声醇提方法提高24.90%。该方法酶代替酸碱活化剂，制备条件温和，不仅避免酸碱对生产设备的腐蚀，而且减少高温制备产品的生产安全隐患，操作简单，茄尼醇产品提取率和纯度高，且生物活性完备，同时减少生产过程中酸碱及有害有机物对环境造成的二次污染，有利于环境保护，降低生产成本。当前第1页12