硫酸乙酰肝素的制作方法

发明领域本发明涉及硫酸乙酰肝素，具体地但不仅限于，涉及结合tgfβ1的硫酸乙酰肝素。发明背景糖胺聚糖是复杂的，线性的，高电荷的碳水化合物，其与多种蛋白质相互作用以调节其功能；它们通常被合成为与核心蛋白相连接。gag分为非硫酸化的(ha)和硫酸化的(cs，ds，ks，肝素和hs)。在gag中，由于基于其结构域内的特定序列而与靶蛋白相互作用的能力，硫酸乙酰肝素(hs)家族是特别感兴趣的。这一家族(肝素和hs)由重复的具有可变模式的n-和o-硫酸化的糖醛酸-(1→4)-d-葡糖胺二糖亚基组成。例如，肝素的抗凝血活性需要具有独特五糖排列的葡糖胺残基的3-o-硫酸化(lindahlu，backstromg，hookm，thunbergl，franssonla，linkera.structureoftheantithrombin-bindingsiteinheparinprocnatlacadsciusa.1979；76：3198-202.)。对于ecm蛋白，独特的硫酸化模式也是显而易见的；结合fn的强力的肝素结合变体具有特别高的电荷，需要7至8个n-硫酸化二糖，并且具有比通常更大的结构域(>14个残基)(falconedj，salisburybgj.fibronectinstimulatesmacrophageuptakeoflow-densitylipoprotein-heparin-collagencomplexesarteriosclerosis.1988；8:263-73.；mahalingamy,gallagherjt,couchmanjr.cellularadhesionresponsestotheheparin-binding(hepii)domainoffibronectinrequireheparansulfatewithspecificproperties.jbiolchem.2007；282:3221-30)。然而，hs通过具有由未硫酸化na结构域分开的高度硫酸化的ns结构域与这样的硫酸化肝素不同；这样的配置提供了用于选择性结合蛋白的独特排列，而没有肝素的副作用(gandhins，mancerarl.thestructureofglycosaminoglycansandtheirinteractionswithproteins.chembioldrugdes.2008；72:455-82.).hs的二糖组成可以使用肝素黄杆菌(flavobacteriumheparinium)酶类肝素酶i、ii和iii切割糖苷键，通过一系列酶裂解来阐明(venkataramang,shriverz,ramanr,sasisekharanr.sequencingcomplexpolysaccharides.science.1999；286:537-42.；desaiur,wanghm,linhardtrj.specificitystudiesontheheparinlyasesfromflavobacterium-heparinumbiochemistry.1993；32:8140-5.；shriverz,sundaramm,venkataramang,fareedj,linhardtr,biemannk,等，cleavageoftheantithrombiniiibindingsiteinheparinbyheparinasesanditsimplicationinthegenerationoflowmolecularweightheparin.procnatlacadsciusa.2000；97:10365-70)。当所有3种肝素酶组合使用时，可能使得超过90％的肝素或hs解聚(karamanosnk,vankyp,tzanakakisgn,tsegenidist,hjerpea.ion-pairhigh-performanceliquidchromatographyfordeterminingdisaccharidecompositioninheparinandheparansulphate.jchromatogra.1997；765:169-79.；vyniosdh,karamanosnk,tsiganoscp.advancesinanalysisofglycosaminoglycans:itsapplicationfortheassessmentofphysiologicalandpathologicalstatesofconnectivetissues.jchromatogrb.2002；781:21-38.)。所得的二糖混合物可以通过与已知的二糖标准品进行比较利用以下方式进行分析：page(hampsonin,gallagherjt.separationofradiolabeledglycosaminoglycanoligosaccharidesbypolyacrylamide-gelelectrophoresisbiochemj.1984；221:697-705.),sax-hplc(skidmoremaa,yatese和turnbullje.labellingheparansulfatesaccharideswithchromophore,fluorescenceandmasstagforhplcandmsseparations.methodsinmolecularbiology.2009；534:157-69.)，或高度敏感的毛细管电泳(ce)(lamarif,militsopouloum,gioldassix,karamanosnk.capillaryelectrophoresis:asuperiorminiaturizedtoolforanalysisofthemono-,di-,andoligosaccharideconstituentsofglycanmoietiesinproteoglycans.freseniusjanalchem.2001；371:157-67.；karamanosnk,vankyp,tzanakakisgn,hjerpea.highperformancecapillaryelectrophoresismethodtocharacterizeheparinandheparansulfatedisaccharides.electrophoresis.1996；17:391-5.；sudhalterj,folkmanj,svahncm,bergendalk,damorepa.importanceofsize,sulfation,andanticoagulantactivityinthepotentiationofacidicfibroblastgrowth-factorbyheparinjbiolchem.1989；264:6892-7.；militsopouloum,lamarifn,hjerpea,karamanosnk.determinationoftwelveheparin-andheparansulfate-deriveddisaccharidesas2-aminoacridonederivativesbycapillaryzoneelectrophoresisusingultravioletandlaser-inducedfluorescencedetection.electrophoresis.2002；23:1104-9)。发明概述本发明涉及一种硫酸乙酰肝素，以及由所述的硫酸乙酰肝素组成的硫酸乙酰肝素制剂。此种硫酸乙酰肝素称为hs16。hs16是指一类新的结构和功能相关的分离的硫酸乙酰肝素。已发现hs16结合tgfβ1，增强tgfβ1的热稳定性并增强tgfβ1信号转导并因此促进间充质干细胞的软骨形成分化。在本发明的一个方面，提供了硫酸乙酰肝素hs16。hs16可以以分离的形式或基本纯化的形式提供。这可包括提供一种组合物，其中硫酸乙酰肝素成分为至少80％hs16，更优选以下之一：至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在优选实施方案中，hs16能够与具有以下氨基酸序列的肽或多肽结合：rkdlgwkwihepkgyh(seqidno:1)。所述的肽可以在该序列的一端或两端具有一个或多个额外的氨基酸。例如，肽可以在该序列的一端或两端具有任意1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或更多个氨基酸。在其它实施方案中，所述的多肽是tgfβ1蛋白。在一些实施方案中，hs16与具有seqidno：1的氨基酸序列或由seqidno：1的氨基酸序列组成的肽结合，或以小于100μm，更优选小于50μm，40μm，30μm，20μm，10μm，1μm，500nm，100nm，50nm，10nm或1nm的kd与tgfβ1蛋白结合。hs16可根据本文所述的发明人的方法获得，鉴定，分离或富集，所述方法可包括以下步骤：(i)提供固体支持物，所述固体支持物具有附着于其上的多肽分子，其中所述多肽包含具有氨基酸序列rkdlgwkwihepkgyh的肝素结合结构域；(ii)使所述多肽分子与包含糖胺聚糖的混合物接触，从而形成多肽-糖胺聚糖复合物；(iii)使多肽-糖胺聚糖复合物与混合物的剩余部分分离；(iv)使糖胺聚糖从多肽-糖胺聚糖复合物解离；(v)收集所述解离的糖胺聚糖。任选地，该方法可以进一步包括大小分级步骤，例如，在步骤(iv)或(v)之后。大小分级可用于除去小于选定阈值的硫酸乙酰肝素链，例如，dp4，dp6，dp8，dp10，dp12，dp14，dp16，dp18，dp20，dp22或dp24中之一。在本发明人的方法中，所述混合物可以包含从市售来源获得的糖胺聚糖。一种合适的来源是硫酸乙酰肝素级分，例如，市售的硫酸肝素。一种合适的硫酸乙酰肝素级分可以在从猪肠粘膜分离肝素的过程中获得，另一种是来自猪粘膜的硫酸乙酰肝素[hspm](例如来自celsuslaboratoriesinc.——有时称为“celsushs”)。其它合适的硫酸乙酰肝素来源包括来自任何哺乳动物(人或非人)，特别是肾，肺或肠粘膜的硫酸乙酰肝素。在一些实施方案中，硫酸乙酰肝素来自猪(猪的)或牛(牛的)肠粘膜、肾或肺。在本发明的另一方面，提供了包含根据上述任一方面的hs16和tgfβ1蛋白的组合物。在本发明的一个方面，提供了包含根据上述方面的hs16的药物组合物或药物。所述的药物组合物或药物可以进一步包含药学上可接受的载体，佐剂或稀释剂。在一些实施方案中，所述药物组合物被用于治疗方法中，所述方法包括组织的修复和/或再生，例如，结缔组织(软骨，骨，腱，韧带，皮肤，角膜)或断骨。在一些实施方案中，药物组合物或药物可以进一步包含tgfβ1蛋白。在一些实施方案中，药物组合物或药物可以进一步包含间充质干细胞。在本发明的另一方面，提供hs16用于医学治疗的方法。医学治疗的方法可以包括体内伤口愈合、组织的修复和/或再生的方法，例如，结缔组织(软骨，骨，腱，韧带，皮肤，角膜)的修复和/或再生。这样的修复和/或再生可以在哺乳动物或人中进行。在本发明的相关方面，提供了hs16在制备用于医学治疗方法的药物中的用途。在一些实施方案中，医学治疗方法包括如上所述的组织的修复和/或再生。在本发明的另一方面，提供了包含生物材料和hs16的生物相容性植入物或假体。在一些实施方案中，植入物或假体涂覆有hs16。在一些实施方案中，植入物或假体用hs16浸渍。植入物或假体可进一步涂覆或浸渍有tgfβ1蛋白和/或间充质干细胞。在本发明的另一方面，提供了形成生物相容性植入物或假体的方法，所述方法包括用hs16涂覆或浸渍生物材料的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括用tgfβ1蛋白和间充质干细胞中的一种或两种涂覆或浸渍生物材料。在一些方面，方法可以包括向患者施用hs16和间充质干细胞。在这样的方法中，hs16、tgfβ1蛋白和间充质干细胞中的至少两种可以配制在包含hs16、tgfβ1蛋白和间充质干细胞中的至少两种以及药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂的药物组合物中。优选地，hs16，tgfβ1蛋白和间充质干细胞分别以治疗有效量提供。在一些实施方案中，所述方法还包括将治疗有效量的hs16和/或tgfβ1蛋白和/或间充质干细胞配制为药物组合物的步骤，所述药物组合物包含hs16和/或tgfβ1蛋白和/或间充质干细胞以及药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂，其中所述药物组合物施用于患者。在本发明的另一方面，提供了治疗患者的方法，所述方法包括将生物相容性植入物或假体手术植入到位于或围绕于骨折部位的患者组织中，所述植入物或假体包含生物材料和hs16。在一些实施方案中，植入物或假体涂覆有hs16。在一些实施方案中，植入物或假体用hs16浸渍。在一些实施方案中，所述的植入物或假体还用tgfβ1蛋白和间充质干细胞中的一种或两种涂覆或浸渍。在本发明的另一方面中，提供了培养基，所述的培养基包含hs16。在本发明的另一个方面，提供了hs16在体外细胞培养中的用途。在本发明的一个相关方面，提供了hs16在体外结缔组织生长中的用途。在本发明的另一个相关方面，提供了一种体外生长结缔组织的方法，所述方法包括与外源添加的hs16接触培养间充质干细胞。在本发明的另一方面，提供了在有需要的人或动物病患中进行组织例如结缔组织的修复、替换或再生的方法，所述方法包括：(i)与hs16接触体外培养间充质干细胞足以使所述细胞形成组织的一段时间；(ii)收集所述组织；(iii)将所述组织植入到患者体内的损伤或疾病部位，以修复、替换或再生患者体内的组织。所述的组织可以是结缔组织，例如，骨，软骨，腱，皮肤或脂肪。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述培养中的间充质干细胞与外源tgfβ1蛋白接触。在本发明的另一方面，提供了在hs16存在下通过体外培养间充质干细胞获得的组织。在本发明的一些实施方案中，提供了在hs16和tgfβ1蛋白存在下通过体外培养间充质干细胞获得的组织。在本发明的另外一方面，提供了培养干细胞例如间充质干细胞的方法，所述方法包括与hs16接触培养干细胞。在本发明的一些方面，提供了体外培养干细胞的方法，所述方法包括与硫酸肝素hs16接触体外培养干细胞。hs16优选是外源的和分离的，并作为补充物添加到培养物中，例如，作为培养基的一部分。在本发明的另一方面，提供了一种多部分的试剂盒(kitofparts)，所述试剂盒包括预定量的hs16和预定量的tgfβ1。所述的试剂盒可以包括含有预定量的hs16的第一容器和含有预定量的tgfβ1的第二容器。试剂盒可以进一步包含预定量的间充质干细胞。试剂盒可以被提供用于医学治疗方法。所述的医学治疗方法可以包括体内伤口愈合的方法，组织诸如结缔组织(例如软骨，骨，腱，韧带，皮肤，角膜)的修复和/或再生的方法。所述的修复和/或再生可以在哺乳动物或人中。所述试剂盒可以与用于分别地、顺序地或同时地施用hs16、tgfβ1蛋白和/或间充质干细胞以提供医学治疗的说明书一起提供。在本发明的另一方面，提供了产品，所述产品含有治疗有效量的：(i)hs16；和以下的一种或两种(ii)tgfβ1蛋白；(iii)间充质干细胞，用于在医学治疗方法中同时、分别或顺序使用。所述的医学治疗方法可以包括体内伤口愈合的方法，结缔组织的修复和/或再生的方法。所述的修复和/或再生可以在哺乳动物或人中。所述的产品可以任选地配制为用于联合用药的联合制剂。如本文所示，hs16具有稳定tgfβ1，从而延长其作用的性质。hs16防止tgfβ1在培养基中降解。这可以有用地应用于tgfβ1制品的储存和含有tgfβ1的培养基的制备。因此，在本发明的一个方面，提供了包含生长因子和分离的hs16的组合物。生长因子可以是蛋白质生长因子，优选tgfβ1。组合物可以包含分离的tgfβ1和分离的hs16。在一些实施方案中，所述的组合物可以是培养基。在其它实施方案中，组合物可以是含有tgfβ1的药物组合物或药物。组合物可以是在容器中的包含tgfβ1和分离的hs16的tgfβ1制剂。合适的容器可以是瓶，药瓶，管或注射器。还提供了增加生长因子的稳定性的方法，所述方法包括使生长因子与分离的hs16接触。生长因子的稳定性可以根据其半衰期，即在给定组合物中一半生长因子被降解和/或失去其活性所需的时间的量来测量。生长因子优选地为蛋白质生长因子，更优选tgfβ1。hs16起到维持和延长tgfβ1半衰期的作用。该方法可以包括在体外使分离的hs16与生长因子(例如tgfβ1)接触，所述生长因子例如作为生长因子(例如tgfβ1)组合物制剂、其储存或运输的一部分。或者，该方法可包括在体内使分离的hs16与生长因子(例如tgfβ1)接触，例如，通过将分离的hs16施用于其中存在[组织中天然存在，或外源加入组织]生长因子(例如tgfβ1)的组织。该方法还可以包括将外源性生长因子(例如tgfβ1)添加到组织的步骤。可以将含有分离的hs16(或已向其中加入分离的hs16)的给定组合物或组织中tgfβ1的稳定性与不含hs16(或未加入分离的hs16)的对照组合物进行比较。在上述组合物和方法中，hs16可以如本文所述进行纯化。tgfβ1可以是分离的和/或纯化的，未分离的或部分分离的，例如，细胞外基质材料的部分，或存在于细胞组合物中。分离或纯化的tgfβ1可以是重组tgfβ1。重组tgfβ1可从许多商业制造商市售获得。在一些方面，hs16在血液衍生产品的生产期间用作保存剂和/或防腐剂。在一些实施方案中，血液衍生产品包括血小板，血小板产物(plateletproducts)，血小板裂解物和富血小板血浆(prp)。血液衍生产品可以从血液或血清中分离，并任选地富集或分离自血液和/或血清的其它组分。在一些方面，提供了血液衍生产品的制剂，所述制剂包含血液衍生产品和预定量的hs16。hs16优选是分离的或纯化的形式，并且优选对于血液衍生产品是外源的，被加入到血液衍生产品中。所述的制剂可以是血小板制剂，例如，血小板，血小板产物，血小板裂解物或富血小板血浆(prp)，其中已加入hs16。如上文所述，提供了保存生物材料优选包含tgfβ1的生物材料的方法，所述方法包括使生物材料与预定量的hs16接触。在一些实施方案中，生物材料可以选自细胞材料，组织，血液衍生产品，细胞或干细胞。在本发明的另一方面，提供了hs16用于干细胞分离和/或加工的过程。在一些实施方案中，hs16被提供作为在干细胞的培养和/或扩增期间使用的试剂。从而，可以提供分离，处理，培养或扩增干细胞的方法，所述方法包括使干细胞与预定量的hs16接触。干细胞可任选地表达tgfβ1。任选地，本发明的方面和实施方案不包括manton等(journalofcellularphysiology209：219-229(2006))中所述的hs。发明详述发明人已经使用基于序列的亲和色谱平台来开发tgfβ1的肝素结合结构域。这使得能够富集结合tgfb1的硫酸乙酰肝素(hs)部分。术语“硫酸(sulphate)”，“硫酸化的(sulphated)”和“硫酸化(sulphation)”分别与“硫酸(sulfate)”，“硫酸化的(sulfated)”和“硫酸化(sulfation)”互换使用。hs16本发明涉及一类称为hs16的硫酸乙酰肝素分子。hs16分子可通过富集含有一种或多种糖胺聚糖(gag)的化合物的混合物的方法获得，所述糖胺聚糖结合对应于tgfβ1的肝素结合结构域的多肽。特别地，hs16分子可以通过富集结合tgfβ1的肝素结合结构域的硫酸乙酰肝素而获得，该结构域包含氨基酸序列rkdlgwkwihepkgyh或由该氨基酸序列组成。富集过程可用于分离hs16。本发明还涉及富含hs16的化合物的混合物，以及使用这些混合物的方法。除了可通过本文所述的方法获得之外，hs16也可以在功能和结构上被定义。功能方面，hs16能够与具有氨基酸序列rkdlgwkwihepkgyh(seqidno:1)或由该氨基酸序列组成的肽结合。所述的肽可以在肽的一端或两端包含一个或多个另外的氨基酸，或者在一些情况下，可以连接于短氨基酸接头序列(例如长度约1至5个氨基酸)和/或标签例如生物素。优选地，hs16以小于100μm，更优选小于50μm，40μm，30μm，20μm，10μm，1μm，500nm，100nm，50nm，10nm，1nm或100pm的kd与所述肽相结合。优选地，hs16也以小于100μm，更优选小于50μm，40μm，30μm，20μm，10μm，1μm，500nm，100nm，50nm，10nm，1nm或100pm的kd与tgfβ1蛋白相结合。hs16和tgfβ1蛋白之间的结合可以通过以下测定方法确定。将gag固定在每个孔中，然后根据制造商的说明，用tgf-β1激发。简言之，一式三份的孔首先用标准测定缓冲液(sab：100mmnacl，50mm乙酸钠，0.2％v/v吐温20，ph7.2)中的5μg/ml肝素、hspm、hs16+ve或hs16-ve预涂覆，然后在室温下孵育过夜。然后用sab仔细洗涤平板三次，用250μl封闭溶液(0.4％w/v鱼皮明胶，sigma-aldrich，sab溶液)封闭，并在37℃下孵育1小时。然后将tgf-β1以100，200或400ng/ml的浓度溶解于封闭溶液中。将平板用sab洗涤三次，将每种蛋白质稀释物(200μl)分配到一式三份的孔中，并在37℃下孵育2小时，用sab漂洗，并加入200μl的750ng/ml单克隆小鼠抗tgf-β1抗体(mab2401，r&d系统)。然后将板在37℃下孵育1小时，用sab洗涤，并在封闭溶液中加入200μl的1μg/ml多克隆山羊抗小鼠生物素化抗体(ab6788，abcam)。再次，将平板在37℃下孵育1小时，用sab洗涤，并将200μl的220ng/mlextravidinap(sigma-aldrich)加入封闭溶液中，在37℃孵育30分钟，然后用sab漂洗。最后，加入200μl显影试剂(sigmafast对硝基苯磷酸酯，sigma-aldrich)，在37℃孵育40分钟，并在405nm下在1小时内读数。在该测定中，可以通过测量吸光度来确定结合，并且可以相对于对照来确定，所述对照诸如不存在添加的硫酸乙酰肝素的tgfβ1蛋白,或添加了不结合tgfβ1蛋白的硫酸乙酰肝素的tgfβ1蛋白。hs16与tgfβ1的独特相互作用可以通过表面等离子体共振(参见实验结果)进行分析，例如，在与肝素，hspm,hs16+ve或hs16-ve的竞争测定中。hs16的结合优选是特异性的，与非特异性结合相反，并且背景是可以通过一种方法从其他硫酸乙酰肝素和/或gags中选择hs16，所述方法包括选择与包括rkdlgwkwihepkgyh的肽例如seqidno：1或者与tgfβ1蛋白显示出高亲和力结合相互作用的硫酸乙酰肝素。本发明的hs16优选增强tgfβ1的热稳定性并且增强间充质干细胞的tgfβ1信号转导和软骨形成分化。hs16可用于期待tgfβ1的稳定化和/或防止tgfβ1的降解和/或延长tgfβ1的任何应用。例如，hs16可用于稳定血小板产物中的tgfβ1。下面显示了用肝素裂解酶i，ii和iii消化完全然后将所得二糖片段进行hplc分析之后的hs16二糖组成。本发明的hs16包括二糖组成在对于上文hs16保留种类(hs16retainedspecies)(hs16+)的各二糖所示的归一化百分比值±10％(更优选±9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％或0.5％)之内的硫酸乙酰肝素，所述二糖组成是通过用肝素裂解酶i、ii和iii消化完全，然后将所得二糖片段进行hplc分析来确定的。通过用肝素裂解酶i，ii和iii消化完全然后将所得二糖片段进行hplc分析测定的hs16二糖组成可以具有如下所示的任一种二糖组成：或或或或或在优选的实施方案中，所列出的8种二糖的总重量百分比为100％(任选地±3.0％或更小，或±2.0％或更小，±1.0％或更小，±0.5％或更小)。在一些实施方案中，δua，2sglcnac，6s的归一化重量百分比不同于上述情况。例如，hs16可以具有如上所述的归一化重量百分比的二糖，除了δua，2sglcnac，6s，其可以以不同的归一化重量百分比存在，或可以不存在。在一些实施方案中，hs16通过参考δua，2s-glcns，6s，δua，2s-glcns，δua-glcns，6s，δua-glcns，δua，2s-glcnac，δua-glcnac，6s和δua-glcnac的上述归一化重量百分比进行定义。用肝素裂解酶消化hs制剂可以如下进行：将hs制剂(1mg)各自溶解于500μl乙酸钠缓冲液(100mm，含有10mm乙酸钙，ph7.0)中，加入三种酶各2.5mu；将样品在37℃下孵育过夜(24小时)，同时轻微颠倒(9rpm)样品管；将三种酶另外各2.5mu加入到样品中，在37℃下将样品管轻微颠倒(9rpm)再孵育48小时；通过加热(100℃，5分钟)停止消化，然后冻干；将消化物重悬于500μl水中，取等分试样(50μl)用于分析。具体来说，hs16可以如下消化：hspm,hs16+ve和hs16-ve样品溶解在水(1100μl)中并过滤(minisartrc15,0.2μm注射器过滤单元，sartoriusstedim，#17761)以除去任何颗粒物质。作为进一步的纯化步骤，通过离心(4000rpm，1小时，15℃)将过滤的溶液通过2000mwco膜(vivaspin2，hydrosart，sartoriusstedim，#vs02h91,2000mwcohy膜，2ml超滤旋转柱)。将滞留物用水(3×1ml)洗涤，从过滤器回收并冻干。将纯化的hs样品溶解在水(1mg/ml)中，并取每个冷冻干燥样品的等分试样(2x～1ml)用于分析。基于brickman等人的方法(brickman，y.g.，ford，m.d.，gallagher，j.t.，nurcombe，v.，bartlett，p.f.，和turnbull，j.e.(1998)jbiolchem273,4350-4359)，但有一些修改，通过顺序加入肝素裂解酶(肝素裂解酶i，ii和iii，ibextechnologies)将hs样品消化为二糖和寡糖。将干燥的hs样品再溶解于消化缓冲液(500μl；50mm磷酸钠缓冲液，ph7.0)中，并向每个样品中加入肝素裂解酶i(5μl；5miu)。将样品孵育(37℃，2小时)，在旋转轮(9rpm)上轻轻混合。将肝素裂解酶iii(5μl；5miu)加入消化物中，并再孵育1小时(如上所述)。加入肝素裂解酶ii(5μl：5miu)，将消化物如上孵育18小时。最后，同时加入所有三种肝素裂解酶的等分试样(5μl；5miu)，并将消化物再孵育24小时。通过加热(100℃，5分钟)终止酶消化。所有三个hs样品一式两份消化。在一些实施方案中，hs16链包含约12至26个糖单元(聚合度，dp)。在一些实施方案中，dp数可以是至少12，至少14，至少16，至少18，至少20，至少22，至少24或至少26中的一个。任选地，其可以小于26。具有所需大小范围(dp)的hs16链的组合物可以通过对hs16应用尺寸分级步骤来制备。为了鉴定hs16，本发明人使用了涉及对显示与具有肝素结合结构域的特定多肽结合的糖胺聚糖分子进行富集的方法。然后可以鉴定分离的gag混合物和/或分子，并测试它们调节表达含有肝素结合结构域的蛋白的细胞和组织的生长和分化的能力。这使得在体外和体内均能够控制分析特定gag糖序列对细胞和组织的生长和分化的影响。该方法在pct/gb2009/000469(wo2010/030244)中描述，其通过引用并入本文。本发明人将该方法应用于tgfβ1以分离和表征与tgfβ1具有高结合性的gag。因此，为了鉴定hs16，本发明人提供了一种分离糖胺聚糖的方法，所述糖胺聚糖能够结合具有肝素/硫酸乙酰肝素(heparin/heparan)-结合结构域的蛋白，所述方法包括：(i)提供固体支持物，所述固体支持物具有附着于其上的多肽分子，其中所述多肽包含肝素结合结构域；(ii)使所述多肽分子与包含糖胺聚糖的混合物接触，从而形成多肽-糖胺聚糖复合物；(iii)使多肽-糖胺聚糖复合物与混合物的剩余部分分离；(iv)使糖胺聚糖从多肽-糖胺聚糖复合物解离；(v)收集所述解离的糖胺聚糖。本发明人还提供了通过其调节细胞或组织的生长或分化的能力来鉴定的分离的糖胺聚糖。为此，发明人提供了一种鉴定能够刺激或抑制细胞和/或组织的生长和/或分化的糖胺聚糖的方法，所述方法包括：(i)提供固体支持物，所述固体支持物具有附着于其上的多肽分子，其中所述多肽包含肝素结合结构域；(ii)使所述多肽分子与包含糖胺聚糖的混合物接触，从而形成多肽-糖胺聚糖复合物；(iii)使多肽-糖胺聚糖复合物与混合物的剩余部分分离；(iv)使糖胺聚糖从多肽-糖胺聚糖复合物解离；(v)收集所述解离的糖胺聚糖；(vi)将收集的糖胺聚糖添加到细胞或组织中，所述细胞或组织中存在含有肝素结合结构域的氨基酸序列的蛋白；(vii)测量以下一种或多种：细胞的增殖，细胞的分化，一种或多种蛋白标志物的表达。本发明人使用了这些方法鉴定能够结合tgfβ1的gag(他们称之为hs16)，其中本发明人的方法中使用的多肽包含rkdlgwkwihepkgyh(seqidno：1)的肝素结合结构域。在本发明人的方法中，包含gag的混合物可以包含合成的糖胺聚糖。然而，从细胞或组织获得的gag是优选的。包含gag的混合物优选为硫酸乙酰肝素制剂，例如hspm。在优选的实施方案中，gag是硫酸乙酰肝素。硫酸乙酰肝素或gag组分可以通过本领域技术人员熟知的一系列常规分离步骤(例如阴离子交换色谱法)从组织或细胞样品或提取物中提取。gag混合物可以包含不同类型的糖胺聚糖的混合物，其可以包括硫酸葡聚糖，硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素。优选地，与固体支持物接触的gag混合物是硫酸乙酰肝素富集的。可以通过对gag混合物进行柱层析来获得硫酸乙酰肝素富集的gag级分，例如，弱，中或强阴离子交换色谱，以及强阴离子交换高效液相色谱(sax-hplc)，选择适当的级分。收集的gag可进行进一步分析以鉴定gag，例如，确定gag组成或序列，或确定gag的结构特征。gag结构通常是高度复杂的，并且考虑到当前可用的分析技术，在大多数情况下不可能精确测定gag序列结构。然而，收集的gag分子可以进行部分或完全糖消化(例如通过亚硝酸化学地，或用裂解酶例如肝素酶iii酶促地)以产生既是gag的特征性又是诊断性的糖片段。特别地，可以通过消化到二糖(或四糖)来测量所获得的每种二糖的百分比，其将提供gag的特征性二糖“指纹”。还可以确定gag的硫酸化模式，并用于测定gag结构。例如，对于硫酸乙酰肝素，在氨基糖和c2，c3和c6位置处的硫酸化模式可以用于表征硫酸乙酰肝素。二糖分析、四糖分析和硫酸化分析可以与其它分析技术例如hplc、质谱法和nmr结合使用，这些分析技术可以各自为gag提供独特的谱图。组合起来，这些技术可以提供gag的确定的结构表征。例如，hs16的1hnmr谱与总hs制备物例如hspm(从其可能衍生出hs16)和hs16相比较显示在图7中。根据本发明的hs16可具有对应于图7的hs16谱图的1hnmr谱。gag和肝素结合结构域之间的高亲和力结合相互作用表明gag含有有助于高亲和力结合相互作用的特异性糖序列。另一步骤可以包括参与结合相互作用的gag完全或部分糖序列、或gag关键部分的测定。gag-多肽(例如hs-多肽)复合物可以用裂解糖胺聚糖链的试剂例如裂解酶进行处理。裂解酶处理可切割结合的gag中未参与与多肽的结合相互作用的部分。参与与多肽结合相互作用的gag部分可以被保护免受裂解酶作用。除去裂解酶后，例如在洗涤步骤之后，保持与多肽结合的gag分子代表多肽的特异性结合配偶体(“gag配体”)。由于较短gag分子的较低复杂度，在gag配体解离和收集之后，可以预期gag配体的较高程度的结构表征。例如，任何糖序列(即gag配体中包含的单糖的初级(线性)序列)、硫酸化模式、二糖和/或四糖消化分析、nmr谱、质谱谱图和hplc谱的组合可以提供高水平的gag配体结构表征。如本文所用，术语“富集”、“富含”、“富”(‘enriching’,‘enrichment’,‘enriched’)等描述了一种过程(或状态)，其中混合物的相对组成以(或者已经以)这样的方式改变：一个或多个所述实体在混合物中的分数(fraction)增加，而一个或多个其他的实体在混合物中的分数减小。通过富集分离的gag可以是纯的，即基本上仅含有一种类型的gag，或者可以仍然是不同类型gag的混合物，该混合物相对于起始混合物具有更高比例的结合肝素结合结构域的特定gag。优选地，当与其中表达或包含含有肝素结合结构域的蛋白的细胞或组织接触时，hs16表现出功能效应。功能效应可以是调节或增强效应。功能效应可以是促进(刺激)某种类型的细胞的增殖，或一种细胞类型分化成另一种，或一种或多种蛋白标志物的表达。例如，hs16可以促进干细胞分化为专门的细胞类型(例如间充质干细胞分化为结缔组织)。如本文所使用的，术语“调节效应”被理解为是指第一实体对第二实体具有的效果，其中，第二实体在另一个或多个过程中的正常功能由于第一实体的存在而被修改。调节作用可以是激动的或拮抗的。调节效应可以是增强效应。术语“增强效应”被理解为意指增加效力的效果。在本发明的一个优选实施方案中，术语“增强效应”是指第一实体对第二实体具有的效果，该效果可增加该第二实体在另一个或多个过程中的效力。在本发明的另一个优选实施方案中，增强效应被理解为是指分离的gag对肝素结合因子的作用，其中所述作用增加所述肝素结合因子的效力。如本文所使用的，“接触”的过程涉及使两个或更多个离散的实体物理上亲密接近。“接触”的过程包括使两个或更多个离散实体亲密接近，接近的时间和条件足以允许这两个或更多个离散实体的一部分在分子水平上相互作用。优选地，如本文所使用的，“接触”的过程包括使具有一种或多种gag的(多种)化合物的混合物和对应于肝素结合因子的肝素结合结构域的多肽亲密接近。“接触”过程的实例包括混合，溶解，膨胀，洗涤。在优选的实施方案中，gag混合物和多肽的“接触”足以在彼此显示高亲和力的gag和多肽之间形成复合物，复合物可以是共价的但优选非共价的。多肽可以包含具有肝素结合结构域的选定蛋白的全长或接近全长的一级氨基酸序列。由于可能发生在较长多肽中的折叠，导致可能的来自gag混合物的肝素结合结构域的掩蔽，因此优选多肽是短的。优选地，多肽具有包含肝素结合结构域或由肝素结合结构域组成的氨基酸序列，并且任选地在肽的n-和c-末端中的一个或两个末端包括一个或多个氨基酸。这些额外的氨基酸可以使得能够向多肽添加连接多肽到固体支持物所需的接头或连接分子(例如标签如生物素)。在本发明人的方法的优选实施方案中，除了肝素结合结构域中的氨基酸数目，多肽含有不超过1-20个，更优选1-10个，更优选1-5个额外氨基酸，例如在c-和/或n-末端的一个或两个上的任意1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20个氨基酸。在一些实施方案中，肝素结合结构域的氨基酸序列占多肽氨基酸的至少80％，更优选至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。为了将多肽粘附到固体支持物的表面，优选修饰多肽以使其包括分子标签，并且修饰固体支持物的表面以掺入对分子标签具有高亲和力的相应分子探针，即分子标签和探针形成结合对。标签和/或探针可以选自以下任一种：抗体，细胞受体，配体，生物素，这些结构的任何片段或衍生物，前述的任何组合，或可以设计或构造探针以与其结合或以其他方式特异性连接的任何其他结构。适合用作标签和探针的优选结合对是生物素和亲和素。多肽衍生自目标蛋白，在本申请中是tgfβ1。“衍生自”是指多肽是选择、挑选或制备的，因为其含有存在于目标蛋白中的肝素结合结构域的氨基酸序列。肝素结合结构域的氨基酸序列可以从出现在目标蛋白质中的氨基酸序列进行修饰，例如，以研究肝素结合结构域序列的变化对gag结合的影响。在本说明书中，所述蛋白是tgfb1。优选的肝素结合结构域的氨基酸序列是rkdlgwkwihepkgyh(seqidno：1)。本领域技术人员理解，特定多肽的氨基酸序列的微小变化可以允许该部分的固有功能保持。还理解，肽内的某些氨基酸残基用等排和/或等电子的其他氨基酸残基取代可以保持或改善未取代的肽的某些性质。这些变化也包括在本发明的范围内。例如，氨基酸丙氨酸有时可以替代氨基酸甘氨酸(反之亦然)同时仍然保持肽的一种或多种性质。术语“等排的”是指两个实体之间的空间相似性。在中等升高的温度下为等排的部分的两个实例是异丙基和叔丁基基团。术语“等电子”是指两个实体之间的电子相似性，一个实例是其中两个实体具有相同或相似pka的功能。对应于肝素结合结构域的多肽可以是合成的或重组的。固体支持物可以是具有分子可以通过共价或非共价键直接或间接连接的表面的任何基材。固体支持物可以包括能够为连接到表面的探针提供物理支持的任何基底材料。它可以是基质支持。该材料通常能够耐受与探针与表面的附着以及在进行测定期间遇到的任何后续处理、操作或加工相关的条件。材料可以是天然存在的，合成的或天然存在材料的改性。固体支持物可以是塑料材料(包括聚合物，例如聚氯乙烯，环烯烃共聚物，聚丙烯酰胺，聚丙烯酸酯，聚乙烯，聚丙烯，聚(4-甲基丁烯)，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯，聚对苯二甲酸乙二醇酯，聚四氟乙烯(ptfe或)，尼龙，聚(丁酸乙烯酯))等，其单独使用，或与其它材料结合使用。可以考虑附加的刚性材料，例如玻璃，包括二氧化硅，并且还包括例如，可作为bioglass获得的玻璃。可以使用的其它材料包括多孔材料，例如可控孔径玻璃珠。还考虑了本领域已知的能够具有一个或多个官能团例如任何氨基、羧基、硫醇或羟基官能团(例如)掺入其表面的任何其它材料。优选的固体支持物包括柱，所述柱具有固定在柱表面上的多肽。所述表面可以是柱的壁，和/或可以由填充到柱的中心空间中的玻璃珠提供。多肽可以固定在固体支持物上。固定方法的实例包括：吸附，共价结合，包埋和膜限制。在本发明的优选实施方案中，多肽和基质之间的相互作用是基本上永久的。在本发明进一步优选的实施方案中，肽和基质之间的相互作用是适当地对离子交换色谱惰性的。在优选的设置中，多肽附着于固体支持物的表面。应当理解，本领域技术人员将具有大量选项以从中选择以将两个实体彼此化学地和/或物理地附着。这些选择均包括在本发明的范围内。在优选的设置中，通过生物素与链霉亲和素的相互作用，将多肽吸附到固体支持物上。在该设置的代表性实例中，生物素分子与多肽共价键合，从而生物素-多肽缀合物与链霉亲和素结合，链霉亲和素又已经与固体支持物共价键合。在另一种设置中，间隔子或接头部分可用于将生物素分子与多肽，和/或链霉亲和素与基质进行连接。通过使gag混合物与固体支持物接触，形成gag-多肽复合物。通过从固体载体上除去混合物的剩余部分，例如通过洗涤固体支持物以洗脱未结合的材料，将这些(复合物)与混合物的剩余部分分离。当使用柱作为固体支持物时，可以从柱上洗脱gag混合物的非结合成分，留下与柱结合的gag-多肽复合物。应当理解，某些寡糖可以以非特异性方式与多肽相互作用。在某些实施方案中，以非特异性方式与多肽相互作用的寡糖可以包括在富含一种或多种gag(所述gag调节肝素结合因子的作用)的化合物的混合物中，或从中排除。非特异性相互作用的实例是临时限制在适当大小和/或形状的分子囊中。此外，应当理解，这些寡糖可以比根本不显示与肽的相互作用的那些寡糖更慢地洗脱。此外，应当理解，非特异性结合的化合物可以不需要输入相同的外部刺激以使它们像以特异性方式(例如通过离子相互作用)结合的那些化合物那样洗脱。本发明人的方法能够将寡糖混合物分离成该混合物的下列组分：以高亲和力方式结合多肽；以低亲和力方式结合多肽；和不结合多肽的组分。这些命名在操作上针对每个gag-肽对进行定义。通过改变固体支持物表面上(gag和多肽的结合在这里发生)存在的条件(例如盐浓度)，可以选择对肝素结合结构域具有最高亲和力和/或特异性的gag。因此可以获得对感兴趣的蛋白和/或感兴趣蛋白的肝素结合结构域具有高结合亲和力的gag。结合亲和力(kd)可以选自以下之一：小于10μm，小于1μm，小于100nm，小于10nm，小于1nm，小于100pm。通过所述方法获得的hs16可以用于体外和/或体内的一系列应用中。可以提供hs16用于在体外的细胞或组织培养物中或在体内的细胞或组织中刺激或抑制细胞或组织生长和/或增殖和/或分化。hs16可以作为用于这种目的的制剂提供。例如，可以提供包含hs16的培养基。可以收集在hs16存在下从体外细胞或组织培养物中获得的细胞或组织并植入需要治疗的人或动物患者中。因此可以提供细胞和/或组织的植入方法，该方法包括以下步骤：(a)与hs16接触体外培养细胞和/或组织；(b)收集所述细胞和/或组织；(c)将所述细胞和/或组织植入需要治疗的人或动物对象中。细胞可以与hs16接触在(a)步骤中培养足以允许细胞或组织生长、增殖或分化的一段时间。例如，所述时间段可以选自：至少5天，至少10天，至少20天，至少30天或至少40天。在另一个实施方案中，hs16可以配制用于医学治疗方法中，包括预防或治疗损伤或疾病。可以提供包含hs16和药学上可接受的稀释剂、载体或佐剂的药物组合物或药物。可以提供这样的药物组合物或药物用于预防或治疗损伤或疾病。还提供了hs16在制备用于预防或治疗损伤或疾病的药物中的用途。任选地，根据本发明的药物组合物和药物还可以含有具有结合gag的肝素结合结构域的感兴趣蛋白(即tgfβ1)。在另外的实施方案中，药物组合物和药物可以进一步包含干细胞，例如间充质干细胞。损伤或疾病的预防或治疗可包括增强，修复，再生或替换细胞或组织，例如结缔组织(例如骨，软骨，肌肉，脂肪，腱，韧带)，包括皮肤。对于组织的修复，包含hs16的药物组合物或药物可以直接施用于损伤或疾病部位，从而刺激新组织的生长，增殖和/或分化，以实现损伤的修复或治愈或缓解(例如缓解症状)疾病状况。可以通过在药物组合物或药物中组合干细胞来改善组织的修复或再生。一些用途可包括将hs16应用于皮肤作为皮肤修复或复原的一部分。这可以是治疗和/或美容应用，涉及皮肤屏障的修复和/或复原，和/或改善皮肤的外观。例如，hs16可以施用于皮肤以修复、复原和/或改善烧伤或其它瘢痕的外观。对于组织的替换，hs16可以在细胞和/或组织的体外培养期间与细胞和/或组织接触，以便产生细胞和/或组织用于在患者的损伤或疾病部位植入。细胞或组织的植入可用于通过替换损伤或患病组织来实现患者中损伤或患病组织的修复。这可能涉及切除损伤/患病组织和植入通过培养与hs16接触的细胞和/或组织而制备的新组织。因此，根据本发明的药物和化妆品组合物和药物可以包含以下之一：(a)hs16；(b)hs16与干细胞的组合；(c)hs16与含有被hs16结合的肝素结合结构域(例如，rkdlgwkwihepkgyh)的蛋白的组合；(d)hs16与干细胞和含有被hs16结合的肝素结合结构域(例如rkdlgwkwihepkgyh)的蛋白的组合；(e)从与hs16接触培养的细胞或组织的获得的组织或细胞。hs16可以用于身体组织，特别是结缔组织的修复或再生。因此，hs16可用于预防或治疗结缔组织中的或者对于结缔组织的多种疾病和损伤。hs16在组织的修复、再生或替换中的使用可涉及在伤口愈合中的用途，例如，加速伤口愈合，瘢痕或骨组织的愈合和组织移植。在一些方面，本发明涉及包括施用hs16的美容治疗。此处所述的“美容”是非治疗性的。所述的美容治疗可以用于改善皮肤的外观和/或质地。在一些方面，本发明涉及美容治疗的方法，其包括施用hs16。如本文所使用的，术语“美容方法”不包括通过手术或治疗在人体或动物体上进行处理的方法，或根据epc第53(c)条的在人或动物体上实施的诊断方法。在美容方法中，对象不需要治疗性地施用hs16。本发明还提供了包含hs16的化妆品组合物。该组合物可用于改善皮肤的外观。化妆品组合物可以类似于药物组合物配制，如下所述。可以向对象施用美容有效量的hs16。也就是说，有效诱导美容有益效果的hs16的量。这在相关从业者的合理判断范围内，相关从业者将理解，活性化合物或含有活性化合物的组合物的合适剂量可根据对象而不同。在另一方面，本发明提供了包含hs16的生物支架。在一些实施方案中，本发明的生物支架可用于矫形，血管，假体，皮肤和角膜应用。本发明提供的生物支架包括延长释放药物递送装置，组织瓣膜，组织瓣膜小叶，药物洗脱支架，人造血管，伤口愈合或皮肤移植物以及矫形假体如骨，韧带，腱和软骨。在本发明的另一方面，提供了用于组织修复或再生的试剂盒，所述试剂盒包含(i)预定量的hs16和(ii)预定量的tgfβ1。hs16可以以其药学上可接受的盐施用于对象。例如，本发明的富集混合物的化合物的碱式盐包括但不限于与药学上可接受的阳离子，例如钠，钾，锂，钙，镁，铵和烷基铵形成的那些。本发明在其范围内包括阳离子盐，例如钠盐或钾盐。应当理解，带有羧酸基团的本发明化合物可以以可给药的前药的形式递送，其中酸部分被酯化(从而具有-co2r’的形式)。术语“前药”特别涉及-or’基团在体内转化为-oh基团或由其得来的羧酸根阴离子。因此，本发明的前药可以起到增强药物吸附和/或药物递送到细胞中的作用。前药的体内转化可以通过细胞酶例如脂肪酶和酯酶或通过化学裂解例如体内酯水解来促进。根据本发明方面的药物以及药物和化妆品组合物可以配制用于通过多种途径施用，包括但不限于在疾病或损伤部位注射。药物和组合物可以配制成流体或固体形式。流体制剂可以配制用于通过注射施用到人或动物体的选定区域。施用可以是“治疗有效量”，这足以显示对个体的益处。实际施用的量，施用的速率和时间过程将取决于所治疗的损伤或疾病的性质和严重性。治疗的处方，例如，剂量的决定等，在一般医师和其他医疗人员的责任范围内，并且通常考虑待治疗的疾病，个体患者的状况，递送部位，施用方法和医师已知的其它因素。上述技术和方案的实例可以在以下文献找到：remington’spharmaceuticalsciences，第20版，2000，lippincott,williams&wilkins出版。干细胞与hs16接触的细胞包括干细胞。hs16可用于干细胞的增殖和/或分化，和/或干细胞的谱系提交(lineage-commitment)。本文培养和描述的干细胞可以是任何种类的干细胞。它们可以是全能的，多能的或专能的。它们可以是胚胎干细胞或来自任何组织的成体干细胞，并且可以是造血干细胞，神经干细胞或间充质干细胞。优选地，其为成体干细胞。在本说明书中，干细胞是指具有以下能力的任何细胞类型：分裂(即自我更新)并保持全能、多能或专能并产生特化的细胞。在本发明中培养的干细胞可以从现有培养物或直接从任何成体、胚胎或胎儿组织(包括血液，骨髓，皮肤，上皮细胞或脐带(一种通常被丢弃的组织))获得或衍生。干细胞的专能性可以通过使用合适的测定法来确定。这样的测定可以包括检测一种或多种多能性标记，例如，碱性磷酸酶活性，检测runx2，osterix，胶原i，ii，iv，vii，x，骨桥蛋白，骨钙蛋白，bspii，聚集蛋白聚糖，albp，ccaat/增强子结合蛋白-α(c/ebpα)，脂肪细胞脂质结合蛋白(albp)，碱性磷酸酶(alp)，骨涎蛋白2，(bspii)，胶原蛋白2a1(col2a1)和sox9。在一些优选的实施方案中，干细胞是间充质干细胞(msc)，即，能够分化成结缔组织和/或骨细胞，例如软骨细胞，成骨细胞，肌细胞和脂肪细胞。间充质干细胞可以通过微创技术容易地从骨髓获得，并且可以在培养中扩增并允许分化成期望的谱系。分化可以通过应用特定的生长因子诱导。转化生长因子β(tgf-β)超家族成员蛋白例如骨形态发生蛋白(bmp)是间充质干细胞的软骨形成和成骨分化的重要因素。间充质干细胞可以使用来自cd34+级分的选择性标记例如stro-1(表明它们的骨髓再生潜力)来分离和检测。这些细胞表面标记物仅存在于间充质干细胞的细胞表面上，并且是细胞多能性的指示。合适的间充质干细胞可以从骨髓抽吸物收集的骨髓单核细胞(bmmnc)获得或衍生(例如wexler等，adultbonemarrowisarichsourceofhumanmesenchymal‘stem’cellsbutumbilicalcordandmobilizedadultbloodarenot.haemopoiesisandleucocytesbritishjournalofhaematology121(2):368-374,april2003.)，或从脐带的沃顿胶质(wharton’sjelly)(例如ta等，long-termexpansionandpluripotentmarkerarrayanalysisofwharton’sjelly-derivedmesenchymalstemcells.stemcellsdev.2009july20(epub))获得或衍生。间充质干细胞可以通过多能干细胞(例如人胚胎干细胞或诱导的多能干细胞)的分化而获得，所述分化通过应用合适的分化因子进行，如本领域熟知的。间充质干细胞是专能祖细胞，具有产生软骨、骨、肌肉、腱、韧带和脂肪组分的能力。这些原始的祖细胞在出生后存在并表现出干细胞特征，即低发生率和广泛的更新潜力。这些性质与它们的发育可塑性结合已经引发了对将它们用于替换受损组织的潜在用途的极大兴趣。本质上，可以培养这些干细胞以扩增它们的数量，然后移植到损伤部位或接种在支架中/上之后产生适当的组织构建体。因此，用于骨骼、肌肉、腱、韧带和血液修复/再生的替代方法是合适的祖细胞(例如间充质干细胞，软骨细胞)的选择、扩增和调节，组合以传导或诱导性支架以支持和引导再生，以及合适的选择特定的组织生长因子。干细胞可以从任何动物或人获得，例如，非人动物如兔，豚鼠，大鼠，小鼠或其他啮齿动物(包括来自任何啮齿目的动物的细胞)，猫，狗，猪，绵羊，山羊，牛，马，非人灵长类动物或其他非人脊椎动物生物；和/或非人哺乳动物；和/或人。优选地，它们是人的。可选地，它们是非人的。任选地，它们是非胚胎干细胞。任选地，它们不是全能的。在本发明的另一方面，提供了包含通过本发明的任何方法产生的干细胞或其它细胞、或其片段或产物的药物组合物。该药物组合物可用于医疗方法。合适的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体，佐剂或稀释剂。在本发明的另一方面，通过本发明的任何方法产生的干细胞或其它细胞可用于医学治疗的方法中，优选地，提供了医学治疗的方法，所述方法包括向需要治疗的个体施用治疗有效量的所述药物或药物组合物。通过根据本发明的培养方法和技术获得的干细胞和其它细胞可以用于分化成为用于医学治疗方法的另一种细胞类型。因此，分化的细胞类型可以衍生自通过所述培养方法和技术获得的干细胞(所述干细胞随后被允许分化)并且可以被认为是其产物。可以提供包含这样的分化细胞，任选地与药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂一起的药物组合物。该药物组合物可用于医疗方法。间充质干细胞间充质干细胞(msc)最初从骨髓中分离，并且在104-105个总骨髓单核细胞(bmmnc)中仅存在1个(friedenstein等人，1966)。这些细胞能够产生源自单细胞前体的克隆，被称为cfu-f(集落形成单位成纤维细胞)群。现在已经在许多其它组织中鉴定了msc，包括脂肪组织(gimble和guilak2003；zuk等2001)，脐带血(bieback等，2004；erices等，2000；goodwin等，2001；kogler等，2004；wagner等，2005)和肌肉(jiang等，2002)。专能人间充质基质细胞(msc)的最低标准已由国际细胞治疗学会(dominici等，cytotherapy(2006)vol.8，no.4,315-317)阐述。他们提出三个标准来定义人msc：对塑料的粘附性，特异性表面抗原表达和专能分化潜力。特别地，他们指出“首先，当在标准培养条件下使用组织培养瓶维持时，msc必须是塑料粘附的。第二，≥95％的msc群体必须表达cd105，cd73和cd90，如通过流式细胞术所测量的。此外，这些细胞必须缺少cd45，cd34，cd14或cd11b，cd79α或cd19和hlaii类(hla-dr)的表达(≤2％阳性)。第三，细胞必须能够在标准体外分化条件下分化成成骨细胞，脂肪细胞和成软骨细胞。dominici等人还指出，最独特地鉴定msc的生物学特性是它们使用标准的体外组织培养-分化条件三系间充质分化成成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的能力。他们证实，通过用茜素红染色或vonkossa染色可以证明分化成骨细胞，通过用油红o染色可以最容易地证明脂肪细胞分化，并且可以通过用阿尔新蓝染色或用于ii型胶原的免疫组织化学染色来证明成软骨细胞分化。dominici等人指出用于这种测定的试剂盒是可商购的，并且证明分化对于所有研究者都是可行的。dominici等人还认识到，未来可能可以鉴定新的表面标志物，其也可以用于定义人类msc。现在已知三种这样的标记：cd49a,ssea-4和stro-1。rider等报道与未分选的细胞相比，cd49a+克隆具有增强的cd90和cd105的表达，并且证明与未分选的细胞相比，cd49a+克隆容易多系分化成脂肪、骨和软骨，支持使用α-1整联蛋白(cd49a)选择用于富集间充质干细胞，并提供了从骨髓单核干细胞的异质池中选择最专能细胞的策略(rider等人，j.mol.hist(2007)38：449-458)。rider等人还报道了cfu-f细胞与cd49a的表达相关，表达cd49a的cfu-f细胞也共表达stro-1，并且除了人以外，cd49a可用于从大鼠和小鼠中分离msc，表明它可以是用于富集的保守标记。gang等人报道，阶段特异性胚胎抗原ssea-4(通常用作未分化的多能人胚胎干细胞的标志物)以及分裂到胚泡期胚胎也鉴定了成年人间充质干细胞群体并且可以用于分离msc(gang等，blood2007；109：1743-1751)。gang等人还描述了用结合表面标志物stro-1的单克隆抗体来富集促克隆形成基质细胞(cfu-f)——所谓的stro-1+bright。糖胺聚糖如本文所用，术语“糖胺聚糖”和“gag”可互换使用，并且被理解为指包含寡糖的分子的大集合，其中这些结合糖中的一个或多个具有氨基取代基或其衍生物。gag的实例是硫酸软骨素，硫酸角质素，肝素，硫酸皮肤素，透明质酸盐和硫酸乙酰肝素。如本文所使用的，术语“gag”也延伸到涵盖作为gag缀合物的那些分子。gag缀合物的实例是蛋白糖胺聚糖(pgag，蛋白多糖)，其中肽组分与寡糖组分共价结合。在优选的实施方案中，gag是硫酸乙酰肝素。硫酸乙酰肝素(hs)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hspg)代表一高度多样化的蛋白聚糖亚组，由共价连接到蛋白质主链的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖侧链组成。核心蛋白以三种主要形式存在：被称为基底膜聚糖的分泌形式，锚定在质膜中被称为磷脂酰肌醇聚糖的形式，和被称为粘结蛋白聚糖的跨膜形式。它们是哺乳动物细胞表面和大多数细胞外基质的普遍存在的成分。还存在其他蛋白例如集聚蛋白或淀粉样蛋白前体蛋白，其中hs链可以连接到较不常见的核上。本发明的优选实施方案涉及与其核心蛋白分离的hs链。hs链可以容易地与核心蛋白分开和分离，例如，通过神经酰胺酶处理。“硫酸乙酰肝素”(“硫酸乙酰肝素”或“hs”)最初在高尔基体中合成为由d-葡萄糖醛酸(glca)和n-乙酰基-d-葡糖胺(glcnac)的串联重复组成的多糖。新生多糖可以随后在一系列步骤中进行修饰：glcnac的n-脱乙酰化/n-硫酸化，glca至艾杜糖醛酸(idoa)的c5差向异构化，idoa和glca的c2上的o-硫酸化，n-磺基葡萄糖胺(glcns)的c6上的o-硫酸化和glcns的c3偶然o-硫酸化。hs的n-脱乙酰化/n-硫酸化，2-o-，6-o-和3-o-硫酸化分别由hsn-脱乙酰酶/n-磺基转移酶(hsndst)，hs2-o-磺基转移酶(hs2st)，hs6-o-磺基转移酶(hs6st)和hs3-o-磺基转移酶的特异作用介导。在每个修饰步骤中，仅修饰一部分潜在底物，导致相当大的序列多样性。hs的这种结构复杂性使得难以确定其序列并理解hs结构和功能之间的关系。乙酰肝素硫酸盐侧链由通过(1→4)糖苷键连接的交替排列的d-葡糖醛酸或l-艾杜糖醛酸和d-葡糖胺组成。葡糖胺通常是n-乙酰化或n-硫酸化的，并且糖醛酸和葡萄糖胺都可以另外o-硫酸化。特定hspg对特定结合配偶体的特异性是通过连接到葡糖胺和糖醛酸的羧基、乙酰基和硫酸酯基团的特定模式产生的。与肝素相反，硫酸乙酰肝素含有较少的n-和o-硫酸基团和更多的n-乙酰基。硫酸乙酰肝素侧链通过四糖键连接子(-葡萄糖醛酸基-β-(1→3)-半乳糖基-β-(1→3)-半乳糖基-β-(1→4)-木糖基-β-1-o-(丝氨酸))区域连接到核心蛋白的丝氨酸残基。硫酸乙酰肝素链和核心蛋白均可能经历一系列可能最终影响其生物活性的修饰。已经认为hs的复杂性超过核酸的复杂性(lindahl等人，1998，j.biol.chem.273,24979；sugahara和kitagawa，2000，curr.opin.struct.biol.10,518)。hs种类的变化来自糖残基的非随机、高度硫酸化序列的合成，所述糖残基被含有n-乙酰化葡糖胺的二糖的非硫酸化区域分割。n-乙酰葡糖胺最初转化为n-磺基葡糖胺产生了其它修饰的焦点，包括葡糖醛酸至艾杜糖醛酸的差向异构化作用和在葡糖胺或艾杜糖醛酸上的o-硫酸化的复杂模式。此外，在未修饰的低硫酸化n-乙酰化序列中，己糖醛酸残基保留为葡糖醛酸，而在高度硫酸化的n-硫酸化区域中，c-5差向异构体艾杜糖醛酸酯占优势。这限制了在任何给定链中可能的二糖变体的数目，但不限制每一个的丰度。大多数修饰发生在n-硫酸化结构域中或直接与它们相邻，使得在成熟链中存在被低硫酸化结构域分割的高度硫酸化的区域(brickman等，(1998)，j.biol.chem.273(8)，4350-4359，其通过引用整体并入本文)。假设高度可变的硫酸乙酰肝素链在调节大量细胞外配体的作用中起关键作用，包括通过自分泌、并分泌和旁分泌反馈回路的复杂组合来调节和呈递生长和粘附因子至细胞，从而控制细胞内信号转导并因而控制干细胞的分化。例如，即使可以在遗传上描述硫酸乙酰肝素糖胺聚糖(alberts等人(1989)garlandpublishing，inc，newyork&london，第804和805页)，从单一来源分离的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖类可能在生物活性上是不同的。如brickman等人，1998，glycobiology8,463所示，从神经上皮细胞获得的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖的两个单独的库可以特异性激活fgf-1或fgf-2，这取决于促有丝分裂状态。类似地，硫酸乙酰肝素(hs)与fgf-1或fgf-2相互作用的能力描述于wo96/23003中。根据该专利申请，能够与fgf-1相互作用的相应的hs可以在胚胎天数约11至约13天时从鼠细胞获得，而能够与fgf-2相互作用的hs可在胚胎天数从约8至约10天获得。如上所述，hs结构在hs之间是高度复杂和可变的。实际上，hs结构的变化被认为在促进每种hs在促进细胞生长和指导细胞分化中的不同活性中起重要作用。结构复杂性被认为超过核酸的结构复杂性，并且尽管hs结构可以表征为具有具体和独特的硫酸化模式的重复二糖单元的序列，但是当前没有相当于那些核酸测序的标准测序技术可用于确定hs序列结构。在不存在用于测定明确的hs序列结构的简单方法的情况下，本领域技术人员通过许多分析技术确认和结构表征hs分子。这些包括二糖分析，四糖分析，hplc和分子量测定中的一种或组合。这些分析技术是为本领域技术人员公知的和使用的。从hs生产二糖和四糖的两种技术包括亚硝酸消化和裂解酶消化。下面仅仅作为示例提供了执行这些消化技术的一种方式的描述，这种描述不限制本发明的范围。亚硝酸消化当完成时，硫酸乙酰肝素基于亚硝酸的解聚导致碳水化合物链最终降解成其单独的二糖组分。例如，亚硝酸可以通过以下方法制备：分别在冰上冷却250μl的0.5mh2so4和0.5mba(no2)215min。冷却后，ba(no2)2与h2so4合并，并漩涡振荡，然后离心从而除去硫酸钡沉淀。125μl的hno2加入到在20μl的h2o中重悬的gag样品中，漩涡振荡后在25℃下孵育15min，偶尔混合。孵育后，1mna2co3加入到样品中，将样品调节至ph6。然后，100μl的0.25mnabh4的0.1mnaoh溶液加入到样品中，混合物加热到50℃20min。然后冷却混合物至25℃并加入酸化的冰醋酸调节ph至3。然后将混合物用10mnaoh中和，并通过冷冻干燥减小体积。最终样品在bio-gelp-2柱上运行以分离二糖和四糖，以验证降解程度。裂解酶消化肝素酶iii在葡糖苷酸键上切割糖链。一系列肝素酶(i，ii和iii)各自通过在特定的硫酸化识别位点解聚某些硫酸乙酰肝素序列而显示相对特异性的活性。肝素酶i沿着hs链切割具有ns区的hs链。这导致硫酸化结构域的破坏。肝素酶iii解聚具有na结构域的hs，导致碳水化合物链分离成单独的硫酸化结构域。肝素酶ii主要在hs链的na/ns“肩”结构域(其中发现不同的硫酸化模式)中切割。注意：乙酰肝素聚合物的重复二糖骨架是与氨基糖葡糖胺连接的糖醛酸。“ns”表示氨基糖在氨基上携带硫酸酯，使得能够在c2、c6和c3处的其他基团硫酸化。“na”表示氨基未被硫酸化并保持乙酰化。例如，对于使用肝素酶iii的na区中的解聚，在含有20mmtris-hcl，0.1mg/mlbsa和4mmcacl2的ph7.5的缓冲液中制备酶和冻干的hs样品。纯粹作为例子，肝素酶iii可以以5mu/1μghs的剂量加入，在37℃下孵育16h，然后通过加热到70℃5min停止反应。二糖和四糖可以通过柱色谱法例如hplc洗脱。或者，它们可以通过毛细管电泳分析。软骨和结缔组织的形成在本发明的另一方面，提供了促进软骨组织形成(软骨形成)的方法，包括向软骨前体细胞或软骨干细胞施用hs16。刺激或抑制骨形成或软骨组织形成的方法可以在体外通过使骨或软骨前体或干细胞与hs16接触而进行，任选地在外源添加的tgfβ1蛋白的存在下。前体细胞或干细胞可以是间充质干细胞。在促进组织形成的情况下，可以收集形成的组织并用于植入人或动物患者体内。因此，在本发明的一个方面，提供结缔组织，其中结缔组织通过在hs16(即外源hs16)存在下、任选地在tgfβ1(即外源性tgfβ1)存在下体外培养间充质干细胞而获得。结缔组织可以是骨，软骨，肌肉，脂肪，韧带或腱。使用hs16预防或治疗疾病可涉及组织，特别是结缔组织例如骨，软骨，肌肉，脂肪，韧带或腱的修复，再生或替换。在这些组织之一恶化的患者中，将hs16给予恶化部位可以用于刺激该部位处组织的生长，增殖和/或分化。例如，存在于或接近施用部位的间充质干细胞的刺激可以导致，优选当tgfβ1也存在于该部位时，间充质干细胞增殖和分化为合适的结缔组织，从而提供损伤组织的替换/再生和损伤的治疗。或者，可以收集从与hs16接触的间充质干细胞的体外培养获得的结缔组织，并将其植入损伤或疾病部位以替换受损或恶化的组织。受损或恶化的组织可任选地首先从损伤或疾病部位切除。因此，hs16可用于通过向需要治疗的患者直接施用hs16(任选地与tgfβ1和/或干细胞组合)来实现的体内伤口愈合，包括组织修复，再生和/或替换(例如瘢痕组织或断骨的愈合)。hs16也可用于体外产生适合植入需要组织修复、再生和/或替换的患者的组织。软骨组织的修复和/或再生在一些方面，本发明涉及hs16的治疗用途(人和/或兽医的)，以治疗或预防关节破坏，软骨降解，对软骨组织的损伤或软骨组织的损失或退化。在一些实施方案中，如本文所述通过施用hs16治疗的疾病或病症可以是与关节破坏、软骨降解、软骨组织损伤和软骨组织损失或退化中的一种或多种相关的疾病或病症。软骨退化、损伤或损失可涉及软骨厚度或体积的减小。作为疾病过程、生理过程和/或作为损伤或创伤的结果，可能发生关节破坏，软骨降解，软骨组织损伤和/或软骨组织的损失或退化。例如，可能由于损伤或创伤而引发关节破坏，软骨降解，软骨组织损伤和/或软骨组织的损失或退化，然后这些过程中的一个或多个可以通过疾病和/或生理过程而进展。疾病或病症可以是关节炎，任选的创伤或损伤诱导的关节炎，年龄相关的关节炎或非年龄相关的关节炎。关节炎可以是骨关节炎。骨关节炎是关节疼痛的临床综合征，并且关节功能降低(例如，僵硬和/或活动范围减小)。症状包括关节疼痛，僵硬和移动关节有问题。其可以通过软骨局部缺失，骨重塑和/或炎症在病理学上表征。最常受关节炎影响的关节是膝关节，髋关节和手和脚中的关节，但是其他关节也可能受影响。根据本发明的方法治疗的对象可能易受关节破坏、软骨降解、软骨组织损伤和软骨组织的损失或退化中的一种或多种的影响，即使这些过程尚未开始。对象可能由于患有与关节破坏、软骨降解、软骨组织损伤和软骨组织损失或退化中的一种或多种相关的疾病或病症而易受影响。软骨可能由于物理过程(例如损伤或创伤)、或机械磨损和/或生物过程(例如疾病和生理过程)而被损坏或降解。物理过程和生物过程相互作用以引起软骨的损失，退化，降解或损伤。例如，损伤或创伤或机械磨损可引发软骨损伤并例如通过炎症参与那些影响和加速软骨的损失、退化、降解或损伤的生物过程。损伤或创伤可能是跌倒或运动相关的损伤或创伤的后果。机械磨损可能与肥胖和/或重复动作相关。例如，机械磨损可以是特定活动的结果，或者与特定职业相关联。导致软骨损失，退化，降解或损伤的生物过程的效应子包括蛋白酶，金属蛋白酶，响应于炎症介质上调的软骨降解酶，聚集蛋白聚糖酶，胶原酶，adamts-4，adamts-5，mmp3和mmp13。软骨细胞的增加的分解代谢活性与导致软骨的损失，退化，退化或损伤的生物过程相关。软骨细胞的代谢活性可以通过例如分析软骨基因如sox-9，colii，aggrecan，col1和tsg-6的表达或放射性标记的掺入来测定。可通过随时间对软骨成像和/或测量软骨来确定软骨的损失，退化，降解，损伤或维持。软骨的成像和/或测量可以在感兴趣的部位，例如损伤或创伤部位，或患关节炎的关节。软骨损失，退化，降解或损伤可以通过本领域技术人员熟知的常规方法测定。例如，可以通过磁共振成像(mri)或通过关节镜检查来确定软骨中的缺陷(即损伤)或软骨损失。软骨损失、退化或降解可以通过观察关节中或某位置处减少的软骨量(相对于该关节中或该位置处先前测量的软骨量)来确定。或者，可以通过观察关节中或某位置处软骨减少的量、厚度或体积(相对于不经历软骨损失、退化或降解的同等关节或位置)来确定软骨损失、退化或降解。关节镜观察到的软骨损伤可根据国际软骨修复协会(icrs)分级系统分级，如下：0＝(正常)健康软骨；1＝软骨具有软斑点或水泡2＝在软骨中可见小的磨损3＝损伤具有深缝隙(超过软骨层的50％)4＝软骨磨损暴露了下面的(软骨下)骨。2/3级缺损的软骨可能具有原纤化或破碎的外观。软骨损伤也可以通过根据pritzker等人，osteoarthritiscartilage200614(1)：13-29中描述的骨关节炎研究学会国际(oarsi)分级系统的组织病理学进行评估。与软骨降解相关的酶或已知在响应于软骨降解时上调的基因或酶的表达和/或活性也可用于确定软骨的损失，退化，降解，损伤或维持。类似地，可以测定软骨细胞的分解代谢活性以研究软骨的损失，退化，降解，损伤或维持。可以通过在关节中或某位置处未发现或仅发现极小的软骨损失、退化、退化或损伤(相对于该关节中或该位置处先前测量的软骨量)，来确定由于施用治疗有效量的本发明多肽或多核苷酸而抑制了关节破坏或软骨降解，或预防或延迟了软骨组织的降解或损伤或损失，或维持了有效的软骨组织。或者，可通过发现关节中或某位置处软骨的损失、退化、降解或损伤减少或减慢(相对于未治疗的对照关节或位置)，来确定抑制关节破坏或软骨降解，或预防或延迟软骨组织的降解或损伤或损失，或有效软骨组织的维持。基因表达，例如，与软骨损失，退化，降解或损伤相关的基因的表达可以通过本领域技术人员熟知的多种方法来测定。例如，可以通过定量实时pcr在样品中，例如活检或组织样品，测定基因的表达水平。与软骨损失相关的基因包括但不限于编码蛋白酶，金属蛋白酶，响应于炎症介质上调的软骨降解酶，聚集蛋白聚糖酶，胶原酶，adamts-4，adamts-5，mmp3和mmp13。蛋白质或酶的表达或活性水平(例如与软骨损失，退化，降解或损伤相关的)可以通过本领域技术人员已知的常规方法测定。例如，可以通过免疫印迹或elisa在样品中，例如活检或组织样品，测定蛋白的表达水平。酶的活性水平可以通过使用该酶的活性的报告子测定在样品中例如活检或组织样品中确定。类似地，可以测定样品例如活检或组织样品中软骨细胞的代谢活性。软骨降解/破坏/损失/损伤和/或关节破坏可与与软骨组织的损失、退化、降解或损伤或者关节破坏相关的疾病或病症的临床症状相关联，因此这些也可用于研究或估计软骨退化/破坏/损失/损伤或关节破坏、软骨细胞的代谢活性、或软骨降解酶的表达和/或活性。骨折在一些方面，本发明涉及hs16治疗骨折的治疗用途(人和/或兽医的)。骨折是一种医学状况。在本申请中，“骨折”包括骨骼的损伤或伤害，其中骨骼破裂、断裂或碎裂。断裂是指骨骼的不连续。骨折可以由物理冲击、或机械应力或由诸如骨质疏松症或骨关节炎的医学病症引起。骨折的骨科分类包括闭合或开放和简单或多碎片骨折。在闭合性骨折中，皮肤保持完整，而在开放骨折中，骨可通过伤口部位暴露，这带来更高的感染风险。简单的骨折沿着单线发生，倾向于将骨分为两部分。多碎片骨折将骨分割成多片。其他骨折类型包括压缩性骨折，压实骨折，螺旋骨折，完全和不完全骨折，横向，线性和斜形骨折以及粉碎性骨折。在大多数对象中，骨愈合(骨折愈合)自然发生并且在损伤后开始。出血通常导致白细胞和成纤维细胞的凝固和吸引，随后产生胶原纤维。这之后是骨基质(钙羟基磷灰石)沉积(矿化)将胶原基质转化成骨。不成熟的再生骨通常比成熟骨弱，随着时间的推移，未成熟骨经历重塑过程以产生成熟的“层状”骨。完整的骨愈合过程需要相当长的时间，通常多个月。其中发生骨折并且可能受益于使用hs16的治疗的骨包括所有骨类型，特别是所有哺乳动物骨骼，包括但不限于长骨(例如股骨，肱骨，趾骨)，短骨(例如腕骨，跗骨)扁骨(例如颅骨，肋骨，肩胛骨，胸骨，骨盆带)，不规则骨(例如椎骨)，籽骨(例如髌骨)。其中骨折发生并且可以从使用hs16的治疗中受益的骨包括骨架骨(即骨架的任何骨)，颅-面部区域的骨，轴向骨架的骨(例如椎骨，肋骨)，附肢骨(例如四肢的)，骨盆骨骼(例如骨盆)的骨。其中发生骨折并且可以从使用hs16的治疗中获益的骨还包括头部(颅骨)和颈部的骨，包括面部的那些，例如颚，鼻和颊。hs16可以用于在牙齿或面部或颅骨手术期间辅助骨的修复或再生，这可以包括重建面部和/或口腔的骨骼(与牙齿不同)，例如，包括颚骨。骨折还包括病理性多孔，例如具有骨质疏松症的对象所显示的。尽管不限于本发明，hs16的主要作用可以在伤口部位内、邻近伤口部位或被引起迁移到伤口部位中的细胞上，并且可以在伤口床内发现或被引起迁移到伤口床中的间充质干细胞、骨干细胞、前成骨细胞或成骨细胞上，或在任何辅助细胞或血管生成细胞上。提供了hs16和包含hs16的药物组合物和药物用于治疗哺乳动物对象骨折的方法。治疗可以包括在骨中的伤口愈合。治疗可涉及骨的修复，再生和生长。hs16通过促进新骨生长而促进骨折修复。hs16提高骨折修复的速度，使得骨愈合更快地发生，导致改善的损伤恢复时间。治疗可以导致改善的骨强度。治疗还可包括治疗骨质疏松症或骨关节炎。hs16优选施用于骨折周围的组织。这可以包括直接给予已发生骨折的骨组织。施用可以是对围绕骨或骨折的结缔组织或对靠近骨并供应骨的脉管系统(例如血管)。可以直接施用到损伤部位，并且可以施用到通过伤口的初始愈合形成的愈伤组织。根据本发明的药物和药物组合物可以配制用于通过多种途径施用。最优选地，hs16配制成用于注射的流体或液体形式。在一些实施方案中，hs16配制为控释制剂，例如，在用于植入伤口部位的药物胶囊中。hs16可以附着、浸渍或浸入载体材料(例如生物材料)，例如纳米纤维或可生物降解的纸或织物。包含hs16的药物组合物，药物，植入物和假体还可以包含tgf-β1。由于hs16结合tgf-β1的能力，hs16可以作为tgf-β1的载体，协助将tgf-β1递送至伤口部位。施用优选以“治疗有效量”施用，其与对应的未治疗骨折相比足以改善骨折的愈合。实际施用的量，施用的速率和时间过程将取决于骨折的性质和严重性。治疗的处方，例如，剂量的决定等在一般医师和其他医疗人员的责任范围内，并且通常考虑骨折的性质，个体患者的状况，递送部位，施用方法和医师已知的其它因素。hs16剂量的单次或多次施用可以根据开处方医生的指导施用。纯粹作为实例，hs16可以以至少1ng/ml，更优选至少5ng/ml和任选10ng/ml或更多的剂量递送。个体hs16剂量可以是小于1mg且大于1μg的级别，例如约5μg，约10μg，约25μg，约30μg，约50μg，约100μg，约0.5mg或约1mg中的一种。上述技术和方案的实例可以在remington’spharmaceuticalsciences，20thedition，2000，pub.lippincott，williams&wilkins中找到。hs16可以用于在其他治疗时治疗骨折，例如施用疼痛缓解或抗炎药物，骨的固定和设置，例如将损伤的肢体固定在石膏模型中，手术介入，例如，以重置骨骼或移动骨骼以校正位移、角度或脱位。如果需要手术，hs16可以在外科手术期间直接施用于(例如施涂于)骨折。生物材料本发明的药物组合物和药物可以采用用hs16涂覆和/或浸渍的生物材料的形式。植入物或假体可以由生物材料形成。这种植入物或假体可以通过手术植入以帮助组织再生，组织重构和/或组织重塑。hs16可以应用于植入物或假体以加速在期望位置处的新组织形成。应当理解，与蛋白质不同，硫酸乙酰肝素是特别强的并且具有好的多的承受制造合成生物支架和应用于植入物和假体所需溶剂的能力。生物材料可以用hs16涂覆或浸渍。浸渍可以包括通过将hs16与生物材料的组成成分混合来形成生物材料，例如在聚合反应中，或者将hs16吸收到生物材料中。涂覆可以包括将hs16吸附到生物材料的表面上。当施用或植入对象时，生物材料应允许涂覆或浸渍的hs16从生物材料中释放。生物材料释放动力学可以通过改变生物材料的结构例如孔隙率来改变。除了用hs16涂覆或浸渍生物材料之外，一种或多种生物活性分子可以浸渍或涂覆在生物材料上。例如，选自下组的至少一种：bmp-2，bmp-4，op-1，fgf-1，fgf-2，tgf-β1，tgf-β2，tgf-vegf；胶原；层粘连蛋白；纤连蛋白；玻连蛋白。优选可用tgf-β1进行浸渍或涂覆。用hs16涂覆或浸渍的生物材料可用于医学和兽医目的。应当理解，本发明可以改善患者的生活质量或潜在地延长动物的生命，例如用于育种的有价值的赛马。生物材料提供支架或基质支持物。生物材料可适于植入组织中，或可适于施用(例如作为溶液中的微胶囊)。植入物或假体应是生物相容的，例如，无毒和低免疫原性(最优选非免疫原性的)。生物材料可以是生物可降解的，使得生物材料在伤口愈合发生时降解，最终在对象中仅原位留下再生组织。或者，可以使用不可生物降解的生物材料，例如，以在大的中断上引导组织再生和/或在愈合期间用作结构支撑，在成功的伤口愈合之后，生物材料的手术切除是任选的要求。生物材料可以是软的和/或柔性的，例如，水凝胶，纤维蛋白网或筛，或胶原海绵。“水凝胶”是当有机聚合物(可以是天然或合成的)凝固或固化以形成捕获水分子或其它溶液并形成凝胶的三维开放晶格结构时形成的物质。凝固可以通过聚集，凝结，疏水相互作用或交联发生。或者，生物材料可以是相对刚性的结构，例如，由诸如塑料的固体材料或诸如钛的生物惰性金属形成。生物材料可以具有可以由交联聚合物提供的多孔基质结构。基质优选地对骨生长所需的营养物和生长因子而言是可渗透的。基质结构可以通过交联纤维例如纤维蛋白或胶原而形成，或由藻酸钠、壳聚糖或其它具有合适交联剂的多糖(例如钙盐，聚丙烯酸，肝素)的液体膜形成。或者，支架可以形成为凝胶，由胶原或藻酸盐制备，使用本领域技术人员已知的熟知的方法交联。用于基质形成的合适的聚合物材料包括但不限于可生物降解/生物再吸收的聚合物，其可以选自：琼脂糖，胶原，纤维蛋白，壳聚糖，聚己内酯，(dl-丙交酯-己内酯)共聚物，(l-丙交酯-己内酯-乙交酯)共聚物，聚乙交酯，聚丙交酯，聚羟基脂肪酸酯，其共聚物，或不可生物降解的聚合物，其可选自：纤维素乙酸酯，纤维素丁酸酯，藻酸盐，聚砜，聚氨酯，聚丙烯腈，磺化聚砜，聚酰胺，聚丙烯腈，聚甲基丙烯酸甲酯，其共聚物。由于其生物相容性和支持细胞附着和功能的有利性质，胶原是用于基质构建的有希望的材料(美国专利号no.5,019,087；tanaka,s.；takigawa,t.；ichihara,s.&nakamura,t.mechanicalpropertiesofthebioabsorbablepolyglycolicacid-collagennerveguidetubepolymerengineering&science2006,46,1461-1467)。临床可接受的胶原海绵是基质的一个实例，并且是本领域公知的(例如来自integralifesciences)。纤维蛋白支架(例如纤维蛋白胶)提供了替代的基质材料。纤维蛋白胶具有广泛的临床应用，作为伤口密封剂，递送生长因子的储库，以及作为生物植入物的放置和固定的辅助(rajeshvasita,dhirendraskatti.growthfactordeliverysystemsfortissueengineering:amaterialsperspective.expertreviewsinmedicaldevices.2006；3(1):29-47；wongc,inmane,spaether,helgersons.thromb.haemost.200389(3):573-582；panditas,wilsondj,feldmands.fibrinscaffoldasaneffectivevehicleforthedeliveryofacidicgrowthfactor(fgf-1).j.biomaterialsapplications.2000；14(3)；229-242；debloiscotemf.doilloncj.heparin-fibroblastgrowthfactorfibrincomplex:invitroandinvivoapplicationstocollagenbasedmaterials.biomaterials.1994；15(9):665-672.)。luong-van等人(invitrobiocompatibilityandbioactivityofmicroencapsulatedheparansulphatebiomaterials28(2007)2127-2136)，通过引用并入本文，描述了hs从聚己内酯微胶囊的延长的局部递送。生物材料的另一个实例是掺入羟基磷灰石或透明质酸的聚合物。生物材料可以补充以另外的细胞。例如，人们可以用干细胞(例如间充质干细胞，更优选人间充质干细胞)“接种”生物材料(或共同合成)。待治疗的对象可以是任何动物或人。对象优选是哺乳动物，更优选人。对象可以是非人哺乳动物(例如兔，豚鼠，大鼠，小鼠或其他啮齿类动物(包括来自任何啮齿目动物的细胞)，猫，狗，猪，绵羊，山羊，牛(包括母牛，如奶牛，或任何牛(bos)目动物)，马(包括任何马(equidae)目动物)，驴，和非人灵长类动物)。非人哺乳动物可以是家养宠物，或为商业目的而饲养的动物，例如，赛马，或养殖家畜如猪，绵羊或牛。对象可以是雄性或雌性。对象可以是患者。如所指出的，根据本发明的方法可以在体外或体内进行。术语“体外”旨在包括具有培养物中的细胞的程序，而术语“体内”意图包括具有完整的多细胞生物体的程序。培养基包含hs16(优选分离的hs16)的培养基可以是任何种类，但优选是液体或凝胶，并且可以含有其它营养物和生长因子(例如tgfβ1，fgf-2)。培养基可以干燥形式制备，例如粉末或冻干形式，用于重构成液体或凝胶。hs16优选以非痕量存在。例如，培养基中hs16的浓度可以在约1ng/ml培养基至约1000ng/ml培养基的范围内。优选地，培养基中hs16的浓度为约500ng/ml或更低，更优选为250ng/ml或更低，100ng/ml或更低，90ng/ml或更低，80ng/ml或更低70ng/ml或更低，60ng/ml或更低，50ng/ml或更低，40ng/ml或更低，30ng/ml或更低，20ng/ml或更低，10ng/ml或更低，或5ng/ml或更低。硫酸乙酰肝素的剂量在体外和体内用途中，hs16可以以约500ng/ml或更低，更优选250ng/ml或更低，100ng/ml或更低，90ng/ml或更低的浓度或剂量使用80ng/ml或更低，70ng/ml或更低，60ng/ml或更低，50ng/ml或更低，40ng/ml或更低，30ng/ml或更低，20ng/ml或更低，10ng/ml或更低，5ng/ml或更低；或约100mg或更低，50mg或更低，40mg或更地，30mg或更低，20mg或更地，10mg或更低，5mg或更低，4mg或更低，3mg或更低，2mg或更低，或1mg或更低；或约0.3-5μg/ml,0.3-4,0.3-3,0.3-2.5,0.3-2,0.3-1.5,0.3-1.0,0.3-0.9,0.3-0.8,0.3-0.7,0.3-0.6,0.3-0.5,0.3-0.4,1-2,1-1.75,1-1.5,1-1.25,1.25-2,1.5-2,或1.75-2μg/ml的浓度或剂量使用。在一些实施方案中，可以在施用治疗剂量之前施用引发剂量的hs16。引发剂量可以起预先结合活化的tgfβ1的作用。引发剂量和治疗剂量可以各自独立地选自上面给出的值或范围之一。剂型虽然hs16可以单独给药，但优选将其作为医药或化妆品制剂(例如组合物，制剂，药物)，所述医药或化妆品制剂包含hsx以及本领域技术人员熟知的一种或多种其他药学上或化妆品可接受的成分的，包括但不限于药学上或化妆品可接受的载体，佐剂，赋形剂，稀释剂，填充剂，缓冲剂，防腐剂，抗氧化剂，润滑剂，稳定剂，增溶剂，表面活性剂(例如润湿剂)，掩蔽剂，着色剂，调味剂和甜味剂。因此，本发明进一步提供如上定义的药物或化妆品组合物，以及制备药物或化妆品组合物的方法，包括将至少一种如上定义的活性化合物与本领域技术人员熟知的一种或多种其它药学上或化妆品可接受的成分(例如载体，佐剂，赋形剂等)混合。如果配制为离散单位(例如片剂等)，每个单位含有预定量(剂量)的活性化合物。本文所用的术语“药学上可接受的”涉及在合理的医学判断范围内，化合物、成分、材料、组合物、剂型等，适用于与所讨论的对象(例如人)的组织接触，没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。每种载体，佐剂，赋形剂等在与制剂的其它成分相容的意义上也必须是“可接受的”。合适的载体，佐剂，赋形剂等可以在标准药学教科书中找到，例如remington’spharmaceuticalsciences，第18版，mackpublishingcompany，easton，pa.，1990；和handbookofpharmaceuticalexcipients，第2版，1994。制剂可以通过药学领域已知的任何方法制备。这些方法包括使活性化合物与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。一般来说，通过均匀和紧密地使活性化合物与载体(例如液体载体，细碎的固体载体等)结合，然后使产物成形(如果需要)，来制备制剂。适当的制剂可以为液体，溶液(例如水性，非水性)，任选的盐水溶液，悬浮液(例如水性，非水性)，乳液(例如水包油，油包水)，酏剂，糖浆剂，糖饵剂，漱口剂，滴剂，片剂(包括例如包衣片剂)，颗粒剂，粉剂，锭剂，软糖剂，胶囊(包括例如硬和软明胶胶囊)，扁囊剂，药丸，安瓿，大丸剂，栓剂，阴道栓剂，酊剂，凝胶剂，糊剂，软膏剂，霜剂，洗剂，油剂，泡沫剂，喷雾剂，雾剂或气溶胶。制剂可适当地提供为用一种或多种活性化合物和任选的一种或多种其它药学上可接受的成分(包括例如渗入、渗透和吸收增强剂)浸渍的贴剂，胶布，绷带，敷料，或类似物。制剂也可适当地以贮库(depot)或贮池(reservoir)的形式提供。活性化合物可以溶解于，悬浮于或与一种或多种其它药学或化妆品可接受的成分混合。适于口服给药(例如通过摄取)的制剂包括液体，溶液(例如水性，非水性)，悬浮剂(例如水性，非水性)，乳液(例如水包油，油包水)，酏剂，糖浆剂，糖饵剂，片剂，颗粒剂，粉剂，胶囊，扁囊剂，药丸，安瓿，大丸剂。适于非口腔经粘膜给药的制剂包括液体，溶液(例如水性，非水性)，悬浮剂(例如水性，非水性)，乳液(例如水包油，油包水)，栓剂，阴道栓剂，凝胶剂，糊剂，软膏剂，霜剂，洗剂，油剂以及贴剂，胶布，贮库，和贮池。适于透皮给药的制剂包括凝胶，糊剂，软膏，霜剂，洗剂和油剂，以及贴剂，胶布，绷带，敷料，贮库，和贮池。片剂可以通过常规方法制备，例如任选地与一种或多种辅助成分共同压制或模制。软膏通常由活性化合物和石蜡或水混溶性软膏基质制备。霜剂通常由活性化合物和水包油乳膏基质制备。如果需要，乳膏基质的水相可以包括例如至少约30％w/w的多元醇，即具有两个或更多个羟基的醇，例如丙二醇，丁-1,3-二醇，甘露醇，山梨醇，甘油和聚乙二醇及其混合物。局部制剂可期望地包括增强活性化合物通过皮肤或其它受影响区域的吸收或渗透的化合物。这种皮肤渗透增强剂的实例包括二甲亚砜和相关的类似物。乳剂通常由活性化合物和油相制备，所述油相可以任选地仅包含乳化剂(或者称为乳化剂(emulgent))，或者其可以包含至少一种乳化剂与脂肪或油或者脂肪和油二者的混合物。优选地，亲水性乳化剂与作为稳定剂的亲脂性乳化剂共同包含。还优选包括油和脂肪。具有或不具有稳定剂的乳化剂一起构成所谓的乳化蜡，并且蜡与油和/或脂肪一起构成所谓的乳化软膏基质，其形成霜剂配方的油性分散相。合适的乳化剂和乳液稳定剂包括吐温60，span80，鲸蜡硬脂醇，肉豆蔻醇，单硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸钠。用于制剂的合适的油或脂肪的选择是基于实现所需的化妆品性质，因为活性化合物在可能用于药物乳液制剂的大多数油中的溶解度可能非常低。因此，霜剂应优选是具有合适均匀性的非油腻、不沾染和可洗涤的产品，以避免从管或其它容器中泄漏。可使用直链或支链的一元或二元烷基酯如二-异己二酸酯，硬脂酸异鲸蜡酯，椰子脂肪酸的丙二醇二酯，肉豆蔻酸异丙酯，油酸癸酯，棕榈酸异丙酯，硬脂酸丁酯，棕榈酸2-乙基己酯或称为crodamolcap的支链酯混合物，后三种是优选的酯。这些可以单独使用或组合使用，这取决于所需的性能。或者，可以使用高熔点脂质如白软石蜡和/或液体石蜡或其它矿物油。适于鼻内给药的制剂，其中载体是液体，包括例如鼻喷雾剂，滴鼻剂或通过喷雾器的气雾剂给药，包括活性化合物的水性或油性溶液。适合于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括其中溶解，悬浮或以其它方式提供(例如，在脂质体或其他微粒中)有活性化合物的水性或非水性，等渗，无热原，无菌液体(例如溶液，悬浮液，盐溶液)。这样的液体可另外含有其它药学上可接受的成分，例如抗氧化剂，缓冲剂，防腐剂，稳定剂，抑菌剂，悬浮剂，增稠剂和使制剂与预期的接受者的血液(或其它相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水，盐水，醇，多元醇，甘油，植物油，或其类似物。用于这种制剂的合适的等渗载体的实例包括氯化钠注射液，林格氏溶液或乳酸林格注射液。通常，活性化合物在液体中的浓度为约1ng/ml至约10μg/ml，例如约10ng/ml至约1μg/ml。制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿和小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，只需要使用前立即加入无菌液体载体例如用于注射的水。临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末，颗粒和片剂制备。tgfβ1在本说明书中，tgfβ1是指转化生长因子1，其是转化生长因子β超家族的成员。来自智人的tgfβ1的氨基酸序列可以从genbank登录号np_000651.3(gi：63025222)[seqidno：2]获取。tgfβ1作为前原蛋白合成，其随后经历蛋白水解切割。单体通过二硫键桥二聚化以形成前tgfβ1二聚体。然后切割tgfβ1二聚体，得到小的休眠tgfβ复合物(slc)，其中休眠相关肽(lap)和成熟肽通过非共价键缔合。大的休眠性tgfβ1复合物(llc)通过大的休眠性tgfβ1结合蛋白(ltbp)与slc的共价连接形成。如本文所用，“tgfβ1”或“tgfβ1蛋白”包括前原tgfβ1，前tgfβ1，成熟tgfβ1和休眠性tgfβ1。前原tgfβ1，前tgfβ1，成熟tgfβ1和休眠性tgfβ1形式可以包含在蛋白复合物中，例如小的休眠tgfβ1复合物或大的休眠tgfβ1复合物。在本说明书中，“tgfβ1”包括与tgfb1的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％之一的同一性的蛋白或多肽。tgfβ1蛋白或多肽优选还包含肝素结合结构域，所述肝素结合结构域具有seqidno：1的氨基酸序列或与seqidno：1的氨基酸序列具有75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。tgfβ1蛋白或多肽可以是全长tgfβ1蛋白或多肽的片段或截短物。例如，tgfβ1可以是前原tgfβ1，前tgfβ1或成熟tgfβ1多肽。tgfβ1蛋白可以是源于，或衍生自，任何动物或人类，例如非人哺乳动物，例如兔，豚鼠，大鼠，小鼠或其他啮齿类动物(包括来自任何啮齿目动物的细胞)，猫，狗，猪，绵羊，山羊，牛(包括母牛，如奶牛，或任何牛目动物)，马(包括任何马目的动物)，驴，和非人灵长类动物，或其他非人脊椎动物生物；和/或非人哺乳动物；和/或人。tgfβ1的用量在体外和体内用途中，tgfβ1可以与hs16组合使用。在本发明的一些细胞培养方法中，将外源hs16加入培养物中。tgfβ1合适的浓度或剂量包括约500ng/ml或更低，更优选250ng/ml或更低，100ng/ml或更低，90ng/ml或更低的浓度或剂量使用80ng/ml或更低，70ng/ml或更低，60ng/ml或更低，50ng/ml或更低，40ng/ml或更低，30ng/ml或更低，20ng/ml或更低，10ng/ml或更低，5ng/ml或更低；或约100mg或更低，50mg或更低，40mg或更地，30mg或更低，20mg或更地，10mg或更低，5mg或更低，4mg或更低，3mg或更低，2mg或更低，或1mg或更低；或约0.1-5ng/ml,0.1-0.2,0.1-0.3,0.1-0.4,0.1-0.5,0.1-0.6,0.1-0.7,0.1-0.8,0.1-0.9,0.1-1.0,0.1-1.5,0.1-0.2.0,0.1-2.5,0.1-3.0,0.1-3.5,0.1-4.0,0.1-4.5,0.1-5.0ng/ml的范围。在一些实施方案中，hs16的体外和体内用途不包括外源性tgfβ1的加入。例如，在本发明的一些细胞培养方法中，不向培养物中加入外源性tgfβ1。本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这样的组合是明显不允许或明确避免的。本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。现在将参考附图通过示例来说明本发明的方面和实施方案。其它方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。本文中提及的所有文件通过引用并入本文。在整个说明书(包括所附权利要求书)中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”及其变体例如“包含(comprises)”和“含有(comprises)”将被理解为表示包括所述整数或步骤或多个整数或步骤的集合，但不排除任何其它整数或步骤，或整数或步骤的集合。必须指出，如说明书所使用的，除非上下文清楚地指出，否则在所附的权利要求书中，单数形式“一”，“一个”，和“该”包括复数形式。本发明的范围可以用从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值来表示。表示这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或至另一个特定值。同样，当值表示为近似值时，通过使用先行词“约”，理解为该特定值形成另一个实施方案。附图简要说明现在将参考附图来讨论说明本发明的原理的实施方案和实验，其中：图1a和1b.显示肝素与tgf-β1结合的图表。(a)显示gag结合平板测定结果以确定tgf-β1结合肝素的能力的图表。误差棒代表标准偏差，n＝3。(b)spr传感图，其显示对各种浓度注射的tgf-β1(50至800nm)的结合响应的变化。通过绘制结合响应(ru)作为注射蛋白的函数制备标准曲线。tgf-β1与肝素结合的kd估测为～0.475μm。图2a至2d.肝素结合增强tgf-β1活性。(a)该图显示tgf-β1(2.5μm)和dtt(10mm)含有(tgf-β1+hep)或不含肝素(tgf-β1)(25μm)的dsf获得的熔解曲线的一阶导数。在每个条件下的tgf-β1的熔解温度取在每个图的峰值。(b)蛋白质印迹和显示相对蛋白水平的图：细胞用在室温下用不同量(0,10或40μg/ml)的肝素(hep)预孵育10分钟的tgf-β1(1或5ng/ml)处理，并在6小时后裂解。通过蛋白质印迹测定磷酸化的smad2(psmad2)和smad3(psmad3)，总smad2/3和肌动蛋白水平，并通过相对于肌动蛋白的光密度测定法来定量。误差棒代表标准偏差，n＝3。(c)该图显示在软骨形成培养基(培养基)或具有肝素(10μg/ml)的软骨形成培养基(培养基+hep)中培养3天的软骨形成微细胞团中sox9和comp的定量pcr结果。误差棒代表标准偏差，n＝3。(d)该图显示在用dmso或sb431542(10μm)处理后通过qpcr测量的在第3天软骨形成微细胞团中sox9和comp表达的抑制。误差棒代表标准偏差，n＝3。图3a至3c.tgf-β1结合和活性的肝素长度要求。(a)代表性spr传感图，显示在注射前用5或10μg肝素(hep)或尺寸分级的肝素(dp4至24)预孵育时200nmtgf-β1的结合响应的变化。代表性条形图显示各种gag针对肝素涂覆的芯片竞争tgf-β1结合的能力。将数据归一化为单独的200nmtgf-β1。(b)该图显示gag结合板测定的结果以确定tgf-β1结合各种肝素片段(dp14-24)或未分级肝素(hep)的能力。误差棒代表标准偏差，n＝3。(c)蛋白质印迹：细胞用在室温下用10μg/ml的各种肝素片段(dp14-24)或未分级肝素(hep)预孵育10分钟的tgf-β1(1ng/ml)处理，并在6小时裂解。通过蛋白质印迹测定磷酸化的smad2(psmad2)和smad3(psmad3)，总smad2/3和肌动蛋白水平。图4a至4c.tgf-β1结合和活性的肝素硫酸化要求。(a)代表性spr传感图，显示当用5或10μg肝素(hep)，2-o-脱硫肝素(2-o-de)，6-o-脱硫酸肝素(6-o-de)或n-脱硫酸肝素(n-de)预孵育时200nmtgf-β1的结合响应的变化。代表性条形图显示各种gag针对肝素涂覆的芯片竞争tgf-β1结合的能力。将数据归一化为单独的200nmtgf-β1。(b)该图显示gag结合板测定以确定tgf-β1结合选择性脱硫的(2-o-de,6-o-de或n-de)或完全硫酸化的肝素(hep)的能力。误差棒代表标准偏差，n＝3。(c)蛋白质印迹：细胞用在室温下用10μg/ml的各种选择性脱硫的(2-o-de,6-o-de或n-de)和完全硫酸化的的肝素(hep)预孵育10分钟的tgf-β1(1ng/ml)处理，并在6小时裂解。通过蛋白质印迹测定磷酸化的smad2(psmad2)和smad3(psmad3)，总smad2/3和肌动蛋白水平。图5a和5b.鉴定tgf-β1肝素结合位点。(a)通过保护-和-标记策略[seqidno：3]鉴定的tgf-β1氨基酸序列和赖氨酸的位置。公开的tgf-β1的肝素结合结构域(hbd)加下划线。标识了以高置信度(*)和中等置信度(^)鉴定的赖氨酸。(b)定位到预测的tgf-β13维结构上的鉴定的赖氨酸的位置(pdb：1klc[51])。顶部，条带图。底部，相应的分子表面。左列和右列，tgf-β1围绕水平轴旋转180°。图6a至6f.分离亲和力选择的tgf-β1结合hs(hs16+ve)。(a)成熟tgf-β1的氨基酸序列，显示用于从市售hspm[seqidno：3]分离tgf-β1-结合性hs群的肽。(b)该图显示3h-肝素结合测定结果以确定肽结合3h-肝素的能力。将肽吸附到硝酸纤维素膜上，然后使其与3h-肝素结合。用闪烁计数器定量结合肽的肝素的量。pbs用作阴性对照。误差棒代表标准偏差，n＝2。(c)用tgf-β1肽亲和选择后获得的hs级分的色谱图。不结合肽的hs(hs16-ve)首先洗脱，而结合肽的hs(hs16+ve)用1.5mnacl洗脱。(d)成熟tgf-β1的氨基酸序列，显示用于从市售hspm(p4)和测试的三种其他肽(p1，p2p3)分离tgf-β1-结合性hs群的肽。(e)该图显示hspm与pbs和p1，p2，p3，p4中的每一种的相对结合。(f)说明hs16的色谱分离。图7a至7c.hs16+ve的表征。(a)hs16+ve(上),hs16-ve(中)和hspm(下)的质子nmr谱。箭头表示三种糖的谱图之间的差异。(b)hs16+ve,hs16-ve和hspm的尺寸排阻色谱。肝素尺寸标准物(dp8,12,20和26)的洗脱时间在图上表明。(c)该图显示肝素裂解酶消化的hs16+ve,hs16-ve和hspm的二糖组成。图8a至8h.hs16+ve结合并加强tgf-β1信号转导。(a)代表性spr传感图，显示在注射前用5或10μg的hs16+ve,hs16-ve或hspm预孵育时200nmtgf-β1的结合响应的变化。代表性条形图显示各种gag针对肝素涂覆的芯片竞争tgf-β1结合的能力。将数据归一化为单独的200nmtgf-β1。(b)显示凝胶电泳：纤溶酶消化单独孵育或与指定的gag一起孵育的tgf-β1。将样品消化1.5小时，在4-12％sds-page上显示并通过银染显色。(c)蛋白质印迹：细胞用在室温下用10μg/ml的肝素(hep),hspm,hs16+ve或hs16-ve预孵育10分钟的tgf-β1(1ng/ml)处理，并在6小时裂解。通过蛋白质印迹测定磷酸化的smad2(psmad2)和smad3(psmad3)，总smad2/3和肌动蛋白水平。代表性spr传感图，显示在注射前用5或10μg的(d)hspm,(e)hs16+ve,(f)hs16-ve或(g)肝素(hep)预孵育时200nmtgf-β1的结合响应的变化。(h)该条形图显示各种gag针对肝素涂覆的表面竞争tgf-β1结合的能力。为了清楚起见，仅对于肝素显示了没有任何gag(即0μg)的tgf-β1的结合响应。将数据归一化为单独的200nmtgf-β1。误差棒代表标准偏差，n＝3。图9.肝素/hs与tgf-β1相互作用的示意图。根据lyon等人提出的模型(2),肝素/hs链(实线)通过任一单体上的k26残基与tgf-β1相互作用。根据该模型，肝素/hs链必须通过(navigate)两个蛋白单体的界面之间的凹槽。k13的位置将有助于糖链获得结合tgf-β1所需的这种空间取向。预测的tgf-β1结构与khan(57)等最近发表的肝素结构的比较还表明dp22肝素片段足以桥接任一单体上的k26残基之间的距离。图10a至10c.hs16+ve加强ltgf-β1信号转导。(a)蛋白质印迹：细胞用在室温下用10μg/ml的肝素(hep),hspm,hs16+ve或hs16-ve预孵育10分钟的ltgf-β1(3.3ng/ml)处理，并在6小时裂解。通过蛋白质印迹测定磷酸化的smad2(psmad2)和smad3(psmad3)，总smad2/3和肌动蛋白水平。(b)肝素/hs与ltgf-β1的相互作用的示意图。将与图9相同的肝素结合模型应用于ltgf-β1结构(pdb：3rjr(60))中，k13残基可有助于肝素/hs链(红线)的取向，以干扰休眠相关肽(lap，颜色显示为米色)与成熟tgf-β1的结合。(c)ltgf-β1的带状图，说明lap如何包绕tgf-β1同源二聚体。图11.显示tgf-β1合成过程的图。tgf-β1被合成为含有信号肽(s)，休眠相关肽(lap)和tgf-β1本身的390个氨基酸的前原蛋白。翻译后，信号肽被切割，在两个单体之间形成二硫键，然后lap从tgf-β1切割。lap和tgf-β1然后非共价重新缔合以形成休眠型tgf-β1(ltgf-β1)，也称为小休眠复合物(slc)。二硫键显示为黄色。图12.hspm，hs16+ve和hs3+ve的组成的比较。条形图显示hspm、hs16+ve、和hs3+ve(hspm的bmp-2结合部分)之间的组成差异。hspm和hs16+ve的组成通过hplc测定，其不能检测稀有ua，2s-glcnac，6s二糖，而hs3+ve的组成通过毛细管电泳测定。误差棒表示误差间隔，其使用斯氏t-分布确定，置信限度设置为95。hs3+ve的数据取自[murali,s.,等,affinity-selectedheparansulfateforbonerepair.biomaterials,2013.34(22):p.5594-5605]并用作比较。图13a至13e.hs16+ve和hs3+ve与bmp-2结合的比较。代表性spr传感图，显示在注射前用5或10μg的(a)hspm,(b)hs3+ve,(c)hs16+ve或(d)肝素(hep)预孵育时25nmbmp-2的结合响应的变化。(e)各种gag针对肝素涂覆表面竞争bmp-2结合的能力的条形图。为了清楚起见，仅显示了肝素的没有任何gag(即0μg)的bmp-2的结合响应。将数据归一化为单独的25nmbmp-2。误差棒代表标准偏差，n＝3。图14.hs16+ve的bmp-2增强能力。该条形图描绘了hspm，hs16+ve和hs3+ve加强c2c12细胞中bmp-2驱动的碱性磷酸酶(alp)表达的能力。误差棒代表sd，n＝4。*p<0.05,**p<0.01,**p<0.001.图15.分化中的hmscs的湿重变化。该图显示用(tgf-β1)或不用tgf-β1(对照)处理的软骨形成分化的细胞团的重量随时间的变化。误差棒代表sd，n＝3。***p<0.001与对照组相比较。图16a至16e.分化中的hmscs中的软骨形成基因表达。在用10ng/mltgf-β1处理(tgf-β1)或不处理(对照组)的细胞团中显示(a)sox9，(b)comp，(c)聚集蛋白聚糖，(d)胶原蛋白2α1型和(e)胶原蛋白10α1型的mrna表达。在对照组细胞团中没有检测到2α1型胶原蛋白mrna。误差棒代表sd，n＝3。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，与对照组相比。图17a和17b.肝素对早期软骨形成基因表达的影响。条形图显示在具有所指示的处理的软骨形成培养基中分化3天后，hmsc中(a)sox9和(b)compmrna表达水平。ctrl-对照组；5hep-5μg/ml肝素；10hep-10μg/ml肝素；1tgf-β1-1ng/mltgf-β1；10tgf-β1-10ng/mltgf-β1。误差棒代表sd，n＝3。*p<0.05,***p<与对照组相比。#p<0.05,###p<0.001，与1tgf-β1相比。图18a至18d.分离的hs级分对hmsc的软骨形成基因表达的影响。散点图显示在含有1或10ng/mltgf-β1(分别为1tgf-β1和10tgf-β1)和10μg/ml的所示gag的软骨形成培养基中培养21天的细胞团中的(a)sox9，(b)comp，(c)聚集蛋白聚糖和(d)胶原蛋白10α1型mrna表达水平。仅在用10ng/mltgf-β1处理的沉淀中检测到2α1型胶原mrna。中线表示平均值，而误差棒表示sd，n＝3。*p<0.05,***p<0.001，与1tgf-β1相比。注意1tgf-β1+hs16+ve数据集中存在的异常值。图19.成熟人[seqidno：3]和兔tgf-β1[seqidno：4]的序列比对。成熟人tgf-β1的预测的肝素结合结构域中的氨基酸残基加下划线，并且通过“保护和标记”技术鉴定的赖氨酸(k)以粗体显示。图20a和20b.治疗组的肉眼评分。每个治疗组的icrsi评分的散点图。(a)中线表示平均得分，误差棒表示se。(b)线代表中值得分。实施例实施例1：肝素/硫酸乙酰肝素-转化生长因子-β1相互作用和信号增强的结构要求背景：肝素能够结合并加强转化生长因子-β1(tgf-β1)信号转导。结果：鉴定了肝素/硫酸乙酰肝素(hs)和tgf-β1的相互作用的分子决定因素。结论：对于tgf-β1与肝素/hs的相互作用存在确定的结构要求，其影响tgf-β1信号转导的增强。意义：对hs-tgf-β1相互作用的理解可指导tgf-β1治疗的发展。摘要转化生长因子-β1(tgf-β1)是肝素结合蛋白，其涉及许多生理过程，包括人间充质干细胞(hmsc)引起的软骨形成。在这里我们显示肝素能够结合并加强hmscs中tgf-β1信号。这种增强通过经由tgf-β受体调节tgf-β1途径而发生，并导致早期软骨形成基因的上调。分子相互作用和基于细胞的测定还证明，长度为18-22个糖(dp18-22)并且缺乏2-o-硫酸化的肝素链对于结合tgf-β1是最佳的。通过结构蛋白质组学探讨tgf-β1和肝素之间的相互作用，使得鉴定了参与肝素结合的tgf-β1上的新的赖氨酸残基。有了这些信息，我们分离了一种对tgf-β1亲和力增强的猪黏膜硫酸乙酰肝素(hs)亚部分。与原始的起始hs相比，该tgf-β1-结合性hs能够更好地结合于并且增强tgf-β1和休眠性tgf-β1的活性。本研究首次报告了肝素与tgf-β1相互作用的结构要求。它还为发展基于hs的策略以调节用于软骨修复的tgf-β1信号转导奠定了基础，其中外源蛋白质剂量可以减少或免除。介绍糖胺聚糖(gag)硫酸乙酰肝素(hs)1和肝素是结构相关的、线性多糖，已知结合许多细胞外蛋白和生长因子并调节它们的功能(1)。转化生长因子-β1(tgf-β1)是一种已经被证明在纤维化(6,7)，皮肤愈合(8)，癌症转移(9,10)和软骨形成(11-15)中起作用的强效肝素结合生长因子(2-5)。tgf-β1驱动人间充质干细胞(hmsc)的软骨形成分化并维持软骨形成表型的这种能力，使得在软骨修复策略的发展中对其产生了特别的兴趣(13,15-18)。虽然最初看起来成功，但是这些方法在其转移到临床中面临显著的障碍，因为经常使用超生理剂量的tgf-β1来克服清除，并且甚至中等剂量已经显示产生不期望的结果，例如滑膜炎症(19,20)。除了非生理剂量的问题之外，还存在持续的将生长因子定位于治疗部位以防止其引起全身性副作用(包括纤维化和肿瘤形成)的需要(9,10,21)。此外，对tgf-β1的敏感性随着年龄而降低(22)，因此足够的tgf-β1给药对老年患者呈现更多的风险。响应于这些挑战，正在开发新的策略，其减少或完全消除对外源性生长因子的需要，更好地定位和控制生长因子在治疗部位的递送，并且提高对生长因子的细胞敏感性或因子的信号转导效率。一些研究组已经通过使用自组装肽两亲物解决了前两个障碍(23,24)，并且已经证明tgf-β1的内源水平足以驱动局部msc分化(25)。然而，合成的肽两亲物具有显著的免疫原性风险，并且未能解决在期望的细胞靶标内增强信号转导活性的需要。理想的治疗将增强tgf-β1信号转导，而无外源性tgf-β1应用。我们的小组已经揭示了hsgag能够调节许多临床相关生长因子的作用(26-29)。在这里我们研究了肝素和hs与tgf-β1结合作用的机制，以及它们在hmscs内信号转导的增强。我们证明，肝素与tgf-β1的结合通过tgf-βi型受体-smad2/3途径增强其活性，并且对这种结合的结构要求存在具体约束。此外，我们利用这些信息来分离hs的tgf-β1结合群，其在组成上不同于猪粘膜hs(hspm)，并且在增强tgf-β1信号转导中比猪粘膜hs(hspm)更有效。这项工作为进一步研究tgf-β1-hs相互作用铺平了道路，并有助于基于hs来调节组织修复的hmsc行为的策略发展。实验程序人msc分离和细胞培养原代hmsc(lonza)通过塑料贴附从年轻健康成年人供体的骨髓单核细胞中分离，并如前所述进行表征(30,31)。将贴壁细胞保持在补充有10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素和2mml-谷氨酰胺的dmem-低葡萄糖(1000mg/l，dmem-lg)基础培养基中，并在标准条件下在37℃和5％co2下在湿润气氛中培养。每三天更换培养基。在达到75-80％汇合时，用0.125％胰蛋白酶/versene(ph7.0)分离细胞，并在相同培养条件下以3,000个细胞/cm2的密度重新铺板。所有实验都用第5代细胞进行。软骨形成分化软骨形成分化使用改良的微团培养系统进行，如zhang等人所述(32)。简言之，收获第4代hmsc，并以2×107个细胞/ml重悬于化学成分确定的软骨形成培养基(pt-3003，lonza)中。然后将12.5μl的液滴接种在24孔板的每个孔的中间，并在37℃下使其贴壁2小时，之后，将500μl的补充有单独的10ng/mltgf-β1(100-2c，peprotech)(培养基)或tgf-β1和10μg/ml肝素(sigma-aldrich))(培养基+hep)的软骨形成培养基加入每个孔中。细胞小滴在24小时后聚结成球形团块，并且在第3天收集微团。基于表面等离子共振(spr)的tgf-β1-gag相互作用的分析基于hernaiz等报道的方案制备生物素化肝素(33)。简言之，将20mg肝素在1ml水中过滤灭菌(0.22μm)，并与8.6μmol的n-羟基琥珀酰亚胺-生物素(nhs-生物素)(pierce)在20μl二甲基亚砜(dmso)中的溶液在4℃下共同孵育2小时。然后将生物素化的肝素广泛透析(7000mwco)以除去未反应的生物素。使用固定化向导在biacoret100(gehealthcare)上以约40个响应单位(ru)的靶向固定水平进行生物素化肝素在链霉亲和素(sa)传感器芯片(gehealthcare)上的固定化。使用hbs-ep运行缓冲液(10mmhepes，150mmnacl，3.0mmedta，0.05％(v/v)吐温20，ph7.4)固定。tgf-β1-肝素相互作用通过制备在hbs-ep-0.1运行缓冲液(0.1％而不是0.05％(v/v)吐温20)中稀释的一系列tgf-β1蛋白样品(50-800nm最终浓度)来影响。对于竞争性结合实验，将终浓度为200nmtgf-β1的hbs-ep-0.1溶液与5或10μg的以下gag之一混合：-肝素(hep)；大小分级肝素(聚合度dp4,6,8,10,12,14,16,18,20,22和24)(iduron)；选择性脱硫肝素(2-o-脱硫，6-o-脱硫和n-脱硫)(iduron)；hspm(ho-03103，celsus实验室)；亲和分离的tgf-β1-结合性hs(hs16+ve)；或tgf-β1-非结合性hs(hs16-ve)。然后将样品溶液以30μl/min的流速注射到肝素涂覆的芯片上120s，随后使hbs-ep-0.1在芯片上通过另外1200s以监测tgf-β1解离。解离后，芯片上的传感器表面通过2次以30μl/min注射的2mnacl洗涤60s来再生。在25℃下以其对时间的函数形式测量响应(传感图)。将每种条件的最大结合响应相对于从单独的tgf-β1获得的响应归一化。gag结合板检测为了确定tgf-β1结合肝素的能力，我们使用带正电荷的gag-结合板(iduron)作为捕获基材。将gag固定在每个孔中，然后根据制造商的说明书用tgf-β1激发。简言之，一式三份的孔首先用5μg/ml的在标准测定缓冲液(sab:100mmnacl,50mm乙酸钠,0.2％v/v吐温20,ph7.2)中制备的全长肝素、大小分级的肝素(dp14,16,18,20,22和24)或选择性脱硫肝素预涂覆，然后在室温下孵育过夜。然后用sab仔细洗涤平板三次，用250μl封闭溶液(0.4％w/v鱼皮明胶，sigma-aldrich，sab溶液)封闭，并在37℃下孵育1小时。然后将tgf-β1以100，200或400ng/ml的浓度溶解于封闭溶液中。将平板用sab洗涤三次，将每种蛋白稀释物(200μl)分配到一式三份的孔中，并在37℃下孵育2小时，用sab漂洗，并加入200μl的750ng/ml单克隆小鼠抗tgf-β1抗体(mab2401，r&d系统)。然后将板在37℃下孵育1小时，用sab洗涤，并在封闭溶液中加入200μl的1μg/ml多克隆山羊抗小鼠生物素化抗体(ab6788，abcam)。再次，将平板在37℃下孵育1小时，用sab洗涤，并将200μl的220ng/mlextravidinap(sigma-aldrich)加入封闭溶液中，在37℃孵育30分钟，然后用sab漂洗。最后，加入200μl显影试剂(sigmafast对硝基苯磷酸酯，sigma-aldrich)，在37℃孵育40分钟，并在405nm下在1小时内读数。差示扫描量热法(dsf)如前所述，在7500fastrealpcrsystem(软件版本1.4，appliedbiosystems)上进行dsf(34,35)。使用或不使用肝素(25μm)测试tgf-β1(2.5μm)。为了促进tgf-β1的熔解，将10mm的二硫苏糖醇(dtt)加入到反应混合物中。通过前述方法(34)进行实验。使用origin7(originlabcorp.)计算熔解曲线的一阶导数，以确定tgf-β1在各种条件下的熔解温度。实验一式三份进行，但是为了清楚起见，本文给出的数据仅显示多个重复的平均值。细胞裂解和蛋白质印迹将人msc在6孔板中在基础培养基中以10,000个细胞/cm2的密度培养24小时。然后单独或在10μg/ml或40μg/ml全长肝素存在下以1ng/ml或5ng/ml剂量的tgf-β1进行tgf-β1处理，或1ng/ml剂量tgf-β1与10μg/ml大小分级或选择性脱硫的肝素，hspm，hs16+或hs16-进行tgf-β1处理，并在加入细胞之前在室温孵育10分钟。休眠tgf-β1(ltgf-β1)处理类似地用3.3ng/ml单独或者与10μg/ml的上述各种gag组合来制备。对于抑制剂研究，在用tgf-β1处理之前，用10μm的sb431542(sigma-aldrich)或dmso预处理细胞30分钟。然后将细胞进行各种tgf-β1处理1，6或24小时，并在2xlaemmli缓冲液中裂解，然后在4-12％sds-page凝胶上分离。然后用抗smad2/3(#3102，cellsignaling)，磷酸化smad2(psmad2，#3108，cellsignaling)，磷酸化smad3(psmad3，#9520，cellsignaling)和肌动蛋白(mab1501r，millipore)的抗体对样品进行免疫印迹。使用quantityone软件(版本4.6.6，bio-rad)进行光密度测定。逆转录和定量pcr(qpcr)使用trizol试剂(invitrogen，lifetechnologies)根据制造商的方案从软骨形成微细胞团中分离总rna。使用vilotmcdna分析试剂盒(invitrogen，lifetechnologies)，按照制造商的说明书，在1μgrna上进行逆转录，在42℃下孵育2小时而不是1小时。每个qpcr含有40ngcdna，每个基因1μl引物-探针混合物和10μl快速通用pcr主混合物(应用生物系统公司，lifetechnologies)，终体积为20μl。热循环条件为95℃，20秒，然后在95℃下进行3秒，60℃下进行30秒，45个循环。每个qpcr一式两份进行，基因表达相对于hprt1表达归一化以获得δct值。取生物学三份的平均值。在不含肝素的培养基(培养基)中培养的软骨形成性微细胞团用作对照(δδct)。各个引物集的相关表达水平通过2-δδct方法(36)表示为倍数变化。使用以下引物-探针测定(应用生物系统公司，lifetechnologies)：hprt1(测定id:hs01003267_m1),sox9(测定id:hs00165814_m1)和comp(测定id:hs00164359_m1)。保护和标记tgf-β1上的肝素结合位点通过“保护和标记”方法鉴定，如ori等人对于fgf-2所描述的(37)，除了使用1nmol的tgf-β1蛋白和0.1％(w/v)rapigesttmsf表面活性剂(waters公司)从小柱中洗脱蛋白质。消化和生物素化的肽在c18ziptip(millipore)上纯化，然后通过串联质谱法(ms)分析。使用easy-nlc(proxeon)将高达2μg的生物素化肽注射到ltqvelos仪器(thermo)中。在picofrittm柱(halo,c18,2.7μm,75μm(id)x100mm长度)(newobjectives)上，采用60分钟线性梯度(2-40％(v/v)乙腈溶于0.1％甲酸)分离多肽。使用top-10策略进行数据采集，其中在双重压力线性离子阱中获得调查ms扫描。ms扫描范围从310到1400m/z，agc目标3e4，最大注射时间10ms。离子强度高于1000和电荷状态不包括1的10个最强的离子被顺序分离到4e4的最大agc目标值达最大100ms，并且使用30％的归一化碰撞能量通过碰撞诱导的解离(cid)来片段化。使用排除列表大小500，一个重复计数，重复持续时间45秒，排除持续时间30秒以及质量宽度1.0低和1.5高应用动态排除列表。到期被停用(expirationwasdisabled)。使用mascotsearch(版本2.3，matrixscience)用ipi.human.v3.86.decoy数据库(183,568个序列)并应用以下参数进行数据分析：消化物，胰凝乳蛋白酶(fwyl/p)；最大确实断裂,2；固定修饰，脲甲基(cys)；可能的修饰，乙酰基(lys)，乙酰基(蛋白n端)，生物素(lys)，氧化(met)；亲本离子耐受性，2da；片段离子耐受性，0.8da。手工验证mascot评分高于20的生物素化肽。3h-肝素结合测定为了测定tgf-β1衍生肽(序列-rkdlgwkwihepkgyh-ahx-k(生物素)[ahx＝6-氨基己酸]；[seqidno：7])的肝素结合能力，将0.5mg的肽在1ml磷酸盐缓冲盐水(pbs)中重构。然后通过在室温下将硝酸纤维素盘在1ml重构肽中孵育1小时并持续摇动将肽吸附在硝酸纤维素盘(6mm直径)上。在单独的pbs中孵育的盘作为阴性对照。吸附后，将盘在80℃和-10hg的真空烘箱中干燥45分钟，用pbs洗涤3次，然后与1ml0.1μci/ml3h-肝素在室温下孵育16小时不断摇动。然后将盘用pbs洗涤4次，用闪烁计数器测定3h-肝素的结合量。hs16+ve的亲和分离hs16+ve的分离通过之前所述方法(29)进行，使用上述的tgf-β1肽序列。简言之，将3mg肽偶联至hitraptm链霉亲和素hp柱(gehealthcare，buckinghamshire，uk)，然后将其用于与市售猪粘膜hs(hspm，celsuslaboratoriesinc，ohio，usa)的亲和层析。将hspm以1mg/ml溶解于低盐缓冲液(20mm磷酸盐，150mmnacl，ph7.2)中，以0.2ml/min的流速加载，并将柱在相同缓冲液中洗涤直到在232nm的基线吸光度(a232)达到零。用高盐缓冲液(20mm磷酸盐，1.5mnacl，ph7.2)在单一步骤中洗脱结合的hs，在a232监测峰级分，收集，并用低盐缓冲液重新平衡柱。分别收集洗脱(hs16+ve)和流通(hs16-ve)峰，冷冻干燥，在hipreptm26/10脱盐柱(gehealthcare，buckinghamshire，uk)上以10ml/min流速脱盐，再次冷冻干燥并储存在-20℃下。质子nmr谱合并hspm,hs16+ve和hs16-ve样品，并在d2o中交换三次(干燥粉末在d2o(0.5至1ml)中溶解三次，并冷冻干燥直至完全冻干)并测定干重。nmr分析在30℃下，在5mm管中作为d2o溶液进行，包括tbuoh(0.2mg/ml)作为内标。综合数据集的最佳浓度为约15mg/ml(1h)，虽然hs制剂为约3mg/ml。在三通道brukeravanceiii500上记录质子(500mhz)nmr谱图。探针是装备有主动屏蔽的50g/cmz轴脉冲场梯度的bruker双通道5mm宽度核探针(31p-109ag)。nmr谱图根据需要进行相位校正并参照tbuoh(1hδ1.24ppm；13c(甲基)δ30.29ppm)。信号的分配基于guerrini等人报道的内容(38)。原始page中的gag阿尔辛蓝染色/银染为了检查hspm，hs16+ve和hs16-ve样品中多糖链的大小分布，将2μg的每种gag在已经在80v预运行30分钟以去除残余过硫酸铵和四甲基乙二胺(temed)的12％原始page凝胶上运行。用4x电泳迁移率变动分析(emsa)缓冲液(40mmtris-hcl，ph8.0,40％(v/v)超纯甘油，0.4％(v/v)np40和400mmkcl)配制终体积为25μl的样品，用tris-甘氨酸缓冲液(25mmtris，192mm甘氨酸)稀释至1倍。分子量梯度和bsa用作分子量标记，而肝素用作阿尔辛蓝染色的阳性对照。然后将凝胶用0.5％(w/v)阿尔辛蓝的2％(v/v)乙酸溶液染色45分钟，在2％(v/v)乙酸中脱色15分钟，并在milliq水中过夜洗涤去除多余的染色。随后，凝胶被银染以显现蛋白质标记物并增强阿尔辛蓝染色的gag的对比度。亲和分离的hs的hplc-尺寸排阻色谱-折射率(hplc-sec-ri)在具有waters2410折射率监测器(范围64)的waters2690alliance系统上使用串联的tsk凝胶g4000pwxl(7.8mm×30cm)和tsk凝胶g3000pwxl(7.8mm×30cm)(tosohcorp.)获得hplc-sec-ri色谱图。用于ri定量的dn/dc设定为0.129(39)。注射样品(50μg)，并在室温下用50mm乙酸铵以0.5ml/min的流速洗脱。使用dawnastra软件(版本4.73.04，wyatttechnologycorp.)收集和分析数据。分子量(mw)标准品的洗脱体积基于在相同条件下运行的肝素寡糖(iduron和dextralaboratories)的洗脱体积。在这两种情况下，这些色谱柱的运行时间均为100min。所有gag样品在水中的浓度为1mg/ml。用肝素裂解酶消化hs样品hspm,hs16+ve和hs16-ve样品溶解在水(1100μl)中并过滤(minisartrc15,0.2μm注射器过滤单元，sartoriusstedim，#17761)以除去任何颗粒物质。作为进一步的纯化步骤，通过离心(4000rpm，1小时，15℃)将过滤的溶液通过2000mwco膜(vivaspin2，hydrosart，sartoriusstedim，#vs02h91,2000mwcohy膜，2ml超滤旋转柱)。将滞留物用水(3×1ml)洗涤，从过滤器回收并冻干。将纯化的hs样品溶解在水(1mg/ml)中，并取每个冷冻干燥样品的等分试样(2x-1ml)用于分析。基于brickman等人的方法(40)，但进行了某些改动，通过依次加入肝素裂解酶(肝素裂解酶i，ii和iii，ibextechnologies)将hs样品消化为二糖和寡糖。将干燥的hs样品再溶解于消化缓冲液(500μl；50mm磷酸钠缓冲液，ph7.0)中，并向每个样品中加入肝素裂解酶i(5μl；5miu)。将样品孵育(37℃，2小时)，在旋转轮(9rpm)上轻轻混合。将肝素裂解酶iii(5μl；5miu)加入消化物中，并再孵育1小时(如上所述)。加入肝素裂解酶ii(5μl：5miu)，将消化物如上孵育18小时。最后，同时加入所有三种肝素裂解酶的等分试样(5μl；5miu)，并将消化物再孵育24小时。通过加热(100℃，5分钟)终止酶消化。所有三个hs样品一式两份消化并通过具有uv检测(232nm)的hplc分析。消化的hs样品的hplc-sec-ri在具有waters2410折射率检测器(范围64)的waters2690联盟系统上，使用两个串联的superdextm肽10/300gl柱(300×10mm，gehealthcare)获得hplc-sec色谱图。用于ri定量的dn/dc设定为0.129(39)。注射样品(2mg/ml)(50μl；100μg)，并用50mm乙酸铵(0.5ml/min)在室温下洗脱。在相同条件下运行肝素寡糖标准品(iduron和dextralaboratories)。这些柱的运行时间为120分钟。使用dawnastra软件(版本4.73.04，wyatttechnologycorp)收集和分析数据。通过hplc进行二糖组成分析通过细菌肝素酶从高级猪肝素消化得到的十二种二糖标准物购自iduron。通过将二糖溶解在水(1mg/ml)中制备每种二糖标准品的储备溶液。为了确定二糖标准物的校准曲线，从储备溶液制备含有20μg/ml的每种二糖的标准混合物。用这十二个二糖标准混合物制备含有20,10,5,2.5,1.25,0.625和0.3125μg/ml的每种二糖的系列稀释物。用水稀释hspm,hs16+ve和hs16-ve消化物(2mg/ml)，得到100μg/ml溶液，然后使用亲水性ptfe一次性注射器过滤器单元(0.2μm，13mm，advantec)过滤。hplc分离条件基于skidmore等人的文章。(41)。在agilent1260infinity液相色谱系统(agilenttechnologies)上进行分析，在232nm处用agilent1260mwdvl检测器监测。hs衍生的二糖在具有保护柱的propactmpa1柱(thermoscientific，4mm×250mm)上分离。使用二元溶剂系统进行梯度洗脱。洗脱液a是ph3.5的水(用hcl调节)，洗脱液b是ph3.5的2mnacl(用hcl调节)。梯度程序如下：100％a从0-1分钟，然后0-35％b从1-32分钟，然后35-65％b从32-47分钟，然后100％b从47-57分钟，然后100％a从57-60分钟。注射体积为50μl。该柱以1.0ml/min的流速洗脱并保持在40℃。通过与12种二糖标准混合物中的二糖的洗脱时间进行比较，通过它们的洗脱时间鉴定hs消化物中存在的二糖。hs16+和hs16-消化物每个重复消化注射两次(总共4次注射)，而hspm样品每个重复消化注射一次(总共2次注射)。纤溶酶消化为了测定各种gag保护tgf-β1免受蛋白水解消化的能力，将tgf-β1(100ng)与10μghep，hspm，hs16+ve或hs16-ve或单独在pbs中，在室温下预孵育10分钟。通过向tgf-β1样品中加入0.5mu纤溶酶并在37℃孵育1.5小时进行纤溶酶消化。随后将样品在4-12％sds-page凝胶上电泳并通过银染色显色。将所有样品制备成在pbs中的10μl的最终体积。碱性磷酸酶(alp)测定为了测定hs16+ve对bmp-2活性的影响，将c2c12小鼠成肌细胞以20,000细胞/cm2接种在完全c2c12培养基(dmem-lg，10％(v/v)fcs，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)，并允许贴壁24小时。然后用具有或不具有100ng/mlbmp-2和/或5μg/mlhs16+ve，hs3+ve或hspm的处理培养基(dmem-lg，5％(v/v)fcs，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)替换完全培养基，并将细胞孵育3天。然后将总细胞裂解物收集在含有蛋白酶抑制剂混合物(calbiochem，merckmillipore，ma，usa)的ripa缓冲液中，并使用bca蛋白测定试剂盒(thermofisherscientific)测定蛋白质含量。通过在37℃下将5μg蛋白质与对硝基苯磷酸酯(sigma-aldrich)孵育1小时并读取405nm处的吸光度变化来测量alp活性。单独的ripa缓冲液和1μl(10,000u/ml)的小牛肠磷酸酶(newenglandbiolabsltd，ontario，canada)分别用作阴性和阳性对照。每个样品一式两份读取，得到每个处理组总共4个读数。hmscs的肝素酶处理为了评估内源性hs对tgf-β1信号转导的影响，将hmsc以7,500个细胞/cm2的密度接种在基础培养基中的12孔板中，并使其贴壁过夜。然后将肝素酶i，ii和iii(每种为1.2miu/ml)的组合加入到每个孔的培养基中并孵育24小时。然后将细胞暴露于tgf-β1处理(所述tgf-β1处理以1ng/ml或5ng/ml的剂量单独制备或在室温下与10μg/ml或40μg/ml完全长度肝素共同预孵育)6小时，然后裂解用于在2xlaemmli缓冲液中的免疫印迹。处理在无血清培养基(补充有100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素和2mml-谷氨酰胺的dmem-lg)中制备，以避免当将新鲜血清加入细胞时观察到的psmad本底水平增加。肝素酶消化的细胞的免疫荧光染色为了确保肝素酶处理有效地从hmsc中去除了内源性hs链，将细胞以3,500个细胞/cm2的密度接种在基础培养基中的8孔腔室载玻片中。使细胞附着过夜，然后用直接加入每个孔的肝素酶i，ii和iii(每种1.2miu/ml)的组合处理24小时。随后，将细胞在室温下在pbs中的4％(w/v)多聚甲醛中固定10分钟，在室温下用在pbs中的3％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)封闭30分钟，然后与抗-hs10e4抗体(在0.3％(w/v)bsa-pbs中1:25稀释)(amsbiotechnology，abingdon，uk)在室温下孵育3小时。然后将细胞与抗小鼠igm-fitc抗体(在0.3％(w/v)bsapbs中1:500稀释)(bdpharmingentm，becton，dickinsonandcompany，nj，usa)在室温下孵育45分钟，用hoechst33342(2μg/ml的pbs溶液)(lifetechnologies)在室温下染色细胞核10分钟。样品在olympusix-81上成像。结果肝素与tgf-β1结合并增强其活性为了确定肝素对tgf-β1信号转导的影响，我们首先确定肝素能够结合tgf-β1。spr和gag-结合板测定证明了tgf-β1以剂量依赖性方式结合到已经固定在96-孔板中(图1a)或生物素化并固定在biacoresa-芯片上的肝素(图1b)。我们的数据表明tgf-β1以约0.475μm的kd结合肝素(图1b)。这种与肝素的结合赋予了tgf-β1增强的热稳定性，如通过dsf测定的(图2a)。tgf-β1同源二聚体包含9个二硫键，4个链内和1个链间，这赋予它高度的热稳定性。这通过对单独的tgf-β1观察到的66℃的高熔融温度得到了证明(数据未显示)。当我们测试前提即肝素与tgf-β1的结合将通过引入新的、非共价的分子间键而进一步增加其热稳定性时，有必要将蛋白的熔解温度降低至该测定可以检测到的水平。这通过向反应中加入10mmdtt来实现，其减少蛋白内的二硫键，从而降低其热稳定性。这导致tgf-β1的熔解温度从66℃变为44℃。加入肝素后，看到表示tgf-β1的熔解温度的峰向右移动，蛋白的熔解温度升至47.5℃。下一步是确定肝素和tgf-β1之间的相互作用是否影响tgf-β1信号通路。为了实现这一点，用不同量的肝素和tgf-β1处理hmsc，并在处理后1,6和24小时收获蛋白，以检查psmad2和psmad3的水平(图2b)。在处理后1小时，psmad2和psmad3水平在用tgf-β1和肝素处理的所有细胞中都饱和(数据未显示)。在用单独的肝素处理的任何细胞中没有观察到可识别水平的psmad2和psmad3，这表明肝素本身不能激活tgf-β1信号转导途径。在处理后6小时，所有细胞中的psmad水平开始消退。然而，已经用肝素和tgf-β1处理的细胞显示psmad2和psmad3的水平分别比用等量的不含肝素的tgf-β1处理的细胞高约1.6和约1.35倍(图2b)。类似地，与用单独的tgf-β1处理的细胞相比，用肝素和tgf-β1二者处理的细胞中24小时后的psmad水平依然更高(数据未显示)。这些数据首先表明，较高剂量的tgf-β1(5ng/ml对1ng/ml)产生持续较长时间的psmad信号。其次，它们还表明肝素能够延长psmad信号的半衰期，超过通常对单独的生长因子观察到的半衰期。为了进一步调查这种影响，我们继续检查在hmscs的软骨形成分化的早期阶段表达的tgf-β1靶基因的转录水平。在培养基(单独的tgf-β1)或培养基+hep(tgf-β1+肝素)的存在下进行hmsc的软骨形成分化。在软骨形成培养基中培养3天后，在培养基+hep培养基中培养的微细胞团显示出约5倍更高水平的sox9和compmrna转录物(图2c)。总之，数据表明肝素能够结合tgf-β1，并且这种结合增强细胞中所见的tgf-β1信号。确定了肝素确实加强tgf-β1的活性之后，我们接下来试图排除肝素通过一些间接途径而不是通过tgf-β1信号途径产生这些作用的可能性。为此，使用了sb431542，一种tgf-βi型受体抑制剂(42)。用sb431542处理hmsc导致3日龄软骨形成性微细胞团中sox9和comp基因表达的减少(图2d)。数据表明tgf-β1活性在受体水平的抑制抵消了肝素的tgf-β1增强作用，这再次意味着肝素通过调节tgf-β1信号转导对tgf-β1活性发挥其作用。tgf-β1结合和活性的肝素长度要求我们接下来试图确定结合tgf-β1所需的肝素的最小长度。可溶的、大小分级的肝素片段(dp4至dp24)竞争性抑制tgf-β1与肝素涂覆的sa芯片结合的能力与其长度成比例增加(图3a)。tgf-β1结合能力的这种增加似乎从dp18往上达到了平台期，其竞争水平类似于对于未分级的全长肝素(hep)所见的竞争水平。从gag-结合板测定获得的结果还表明，当肝素链的长度从14(dp14)增加至24(dp24)糖单位时，tgf-β1与肝素的结合改善(图3b)。短于dp14(即dp4-12)的肝素链不能有效结合tgf-β1(数据未显示)。用不同长度的肝素片段和tgf-β1处理的细胞中，在处理后1小时psmad2和psmad3水平的蛋白质印迹分析显示两种psmad信号饱和(数据未显示)。然而，在处理后6小时，我们预期观察到各种(dp14-24)肝素片段的增强活性的长度依赖性增加，dp24-tgf-β1组合具有预期的最大的psmad信号，尽管仍然低于用未分级肝素(hep)和tgf-β1处理的细胞中观察到的。相反，我们观察到已经用tgf-β1和dp18和dp22之间的肝素片段处理的细胞显示比用未分级肝素和tgf-β1处理的细胞中观察到的psmad水平更高的psmad水平，其中信号在dp20-tgf-β1组合情况下达到峰值(图3c)。这表明肝素链的长度对其加强tgf-β1信号的能力施加相当大的影响。tgf-β1结合和活性的肝素硫酸化要求鉴于肝素-蛋白相互作用的主要离子性质，我们接下来开始检查肝素中的各种硫酸基团对其与tgf-β1之间的相互作用的影响。biacore竞争测定表明，肝素的2-o硫酸基团的损失(2-o-de)对其竞争性抑制tgf-β1结合固定化肝素的能力具有最小的影响(图4a)。6-o硫酸基团的损失(6-o-de)导致大约40％的tgf-β1结合能力的损失，而n-硫酸基团的损失消除了肝素结合tgf-β1的能力。相比之下，gag结合板测定表明，与完全硫酸化的全长肝素(hep)相比，从肝素去除2-o硫酸基团(2-o-de)减少了tgf-β1结合约60％(图4b)。去除6-o硫酸基团(6-o-de)使tgf-β1的能力降低约80％，并且n-硫酸化的缺乏(n-de)再次基本上消除了tgf-β1的结合。有趣的是，当在细胞培养物中测试时，获得的结果与评估各种肝素长度时所见的结果一样可变。不同于我们预期的在用2-o-脱硫的肝素(2-o)处理6小时的细胞的psmad水平中相对于完全硫酸化的肝素的减少，我们观察到水平增加至超过了在肝素处理的细胞中观察到的(图4c)，表明2-o-脱硫肝素增强tgf-β1信号转导甚至超过完全硫酸化肝素。类似地，6-o-硫酸化(6-o)的去除也导致了psmad水平的稳定(相对于在肝素处理的细胞中观察到的)。然而，n-硫酸化(n)的损失没有导致相对于肝素处理的细胞的psmad水平的增加。总的来说，数据表明，肝素中2-o-硫酸化的丧失以及较小程度的6-o-硫酸化实际上提高了肝素增强tgf-β1信号的能力，表明结合强度和生物活性的关系不是线性的。鉴定tgf-β1肝素结合位点由于肝素已知与许多易感生长因子中存在的碱性残基的构型相互作用，我们的下一个目标是鉴定tgf-β1中的实际肝素结合位点。在tgf-β1上鉴定推定的肝素结合位点的先前研究通过鉴定存在于线性蛋白质序列中的肝素结合基序来进行(2,4)。然而，这种方法没有考虑蛋白质的完整3维(3d)构象性质，因此不能鉴定仅可从蛋白质的三级结构显现的肝素结合位点。因此，我们决定采用ori等人开发的保护和标签策略(37)以确定这些3d位点是否存在于tgf-β1内。我们的分析鉴定了表现出参与tgf-β1与肝素结合的8种赖氨酸(k13，k26，k31，k37，k60，k95，k97和k110)(图5a，表1)。在这8个中，基于ms/ms测序，7个具有高水平的置信度。剩余的赖氨酸k60被鉴定为具有中等的置信水平，表明其与肝素的相互作用是间歇的，并且对于tgf-β1与肝素的结合可能不是必需的，因此也支持lyon等人提出的当前结合模型(2)。在这些鉴定出的赖氨酸中，除了其中的两个，k13和k110，所有赖氨酸之前已经鉴定为tgf-β1的肝素结合结构域的一部分(图5a)。当定位到3d结构上时，k13与k26定位到相同的底表面上，k26已被提出是肝素结合的必要残基(图5b)。k110定位到沿着tgf-β1单体之间的界面。然而，k110似乎嵌入在蛋白内，因此很可能这个结果是假阳性，因为tgf-β1的“粘性”性质导致从肝素小柱洗脱蛋白需要使用酸敏感性去污剂(rapigesttmsf表面活性剂)，而不是2mnacl。使用这种洗涤剂洗脱导致蛋白在标记/生物素化步骤之前变性，使得通常嵌入蛋白核心内的残基暴露并被错误标记。分离亲和力选择的tgf-β1-结合性hs(hs16+ve)已经确定了肝素-tgf-β1相互作用的结构特征和要求，我们的下一个目标是从构成市售hspm制剂的异质池中分离hs的tgf-β1结合部分。为此，我们首先设计了源自tgf-β1的肝素结合肽(图6a)并测试了其结合3h-肝素的能力(图6b)。然后使用我们的hs亲和分离平台(如先前murali等人所述(29))将tgf-β1肽用于分离hs的tgf-β1结合群体。未结合到柱的hs称为hs16-ve，而用1.5mnacl从柱洗脱的tgf-β1-结合性hs称为hs16+ve(图6c)。表1.通过保护和标记结构蛋白质组学鉴定到的肽的概述。通过串联质谱法鉴定标记的肽，并通过mascotsearchversion2.3(matrixscience)分析。这里，提供了参与肝素结合位点和标记位置的肽的概述。a残基编号根据图5a然后进行质子nmr，hplc-sec-ri和二糖组成分析以确定hspm,hs16+ve和hs16-ve之间是否存在任何系统差异。三个hs样品的nmr分析显示了几个细微的差异(箭头，图7a)，而来自sec的色谱图表明hs16+ve主要由总是比在hspm和hs16-ve中观察到的那些更大的hs链组成(图7b)。三个hs样品的nmr谱中最显著的差异是在hs16+ve的约5.4ppm处的信号强度的轻微降低(箭头，图7a)，其归于葡糖胺乙酸盐甲基共振,如guerrini等先前所描述的[complexglycosaminoglycans:profilingsubstitutionpatternsbytwo-dimensionalnuclearmagneticresonancespectroscopy.analbiochem,2005.337(1):p.35-47.].该降低表明与其它两种级分相比，hs16+ve中的n-硫酸化水平略高。基于几种肝素大小标准品(dp8,12,20和26)的洗脱时间，我们的数据还表明hs16+ve由长于26个糖的hs链组成。最后，三种hs样品消化物的二糖组成分析显示，虽然hspm和hs16-ve相似，但是hs16+ve富含δua-glcns，6s和δua，2s-glcns，6s并且含有较少的δua-glcnac，δua-glcns，δua，2s-glcnac和δua，2s-glcns(图7c，表2)。综合起来，数据表明，就尺寸分布和组成这二者而言，组成hs16+ve的hs池与hs16-ve和hspm显著不同。此外，在hs16+中观察到的δua，2s-glcnac和δua，2s-glcns的相对减少证实了我们早期关于从肝素中损失2-o-硫酸如何实际上增加其对tgf-β1的生物活性的研究结果(图4)。已知hs链在链长度方面显著变化[esko,j.d.,k.kimata,andu.lindahl,proteoglycansandsulfatedglycosaminoglycans,inessentialsofglycobiology,a.varki,等,editors.2009,coldspringharborlaboratorypress:coldspringharbor,newyork.]，这部分解释了它们结合这么多种蛋白质的能力。为了增强hs制剂对给定蛋白的相对特异性，有必要减少这种变异性。我们检查了三个hs样品中多糖链的大小分布。通过天然page分析三个样品和肝素显示与hs16-ve和hspm相比，hs16+ve主要由更长的hs链组成。使用比hs同质性更高的肝素来评价hs制剂中存在的高度异质性。为了验证这些发现，进行尺寸排阻色谱(hplc-sec-ri)。来自sec的色谱图表明hs16+ve由约dp8至>dp26的hspm的多分散子集组成(图7b)。然而，hs16+ve群体富含具有更长链长度(>dp26)的hs，这证实了我们来自天然page的数据和我们关于肝素结合tgf-β1的长度要求的发现。数据表明，就尺寸分布和组成二者而言，构成hs16+ve的hs池与hs16-ve和hspm显著不同。此外，在hs16+ve中观察到的δua，2s-glcnac和δua，2sglcns的相对减少证实了较早的观察，即肝素的2-o硫酸的损失实际上能够增加其对tgf-β1的生物活性(图4c)。δua，2s-glcns，6s的增加的相对比例可能是由于肽优先富集具有n-和6-o-硫酸化的糖，而不管是否存在2-o-硫酸化。表2.肝素裂解酶消化的hs样品的二糖组成hs样品用肝素裂解酶i，ii和ii消化，并且通过hplc分离所得的二糖。通过将它们的洗脱时间与已知的二糖标准物的洗脱时间进行比较来鉴定二糖，并且用几个校准曲线计算它们在每个hs样品中的比例。hs16+ve结合并加强tgf-β1信号转导考虑到hs16+ve与hs16-ve和hspm的组成的差异，我们接下来开始研究这些差异是否导致任何功能结果。在biacore竞争测定中检查这些hs级分结合tgf-β1的能力表明hs16+ve能够以比hs16-ve或hspm高得多的亲和力结合tgf-β1(图8a)。由于使用tgf-β1衍生肽分离hs16+ve，评估糖掩盖蛋白上的碱性残基的能力是重要的。为此，我们用tgf-β1预结合糖(hep，hspm，hs16+ve和hs16-ve)，并对其进行纤溶酶消化。考虑到纤溶酶优先切割赖氨酸和精氨酸残基的羧基面，我们推断如果糖以一定程度的特异性结合tgf-β1，它将赋予蛋白针对纤溶酶的一定程度的保护。纤溶酶消化产物的银染显示，hs16+ve(tgf-β1+hs16+ve)比任何其他测试的糖，包括肝素(tgf-β1+hep)，能更好地保护tgf-β1免于纤溶酶消化(图8b)。在体外系统中，hs16+ve能够在hmsc中通过psmad2和psmad3增强tgf-β1信号转导至与肝素类似的程度(图8c)。有趣的是，hspm和hs16-ve不能引起类似的反应，这佐证了我们早期的发现，即hs16+ve在组成和功能上不同于hspm和hs16-ve。由于大多数tgf-β1在体内以无活性形式存在，称为休眠tgf-β1(ltgf-β1)，且hs16+ve已从hspm库中分离，我们接下来试图探索hs16+ve可能具有的对ltgf-β1的功能。我们的数据表明，再一次，hs16+ve能够比肝素(hep)，hspm和hs16-ve更显著地加强ltgf-β1诱导的psmad信号(图10a)。总的来说，我们的数据显示，与hspm起始材料和非结合hs16-ve相比，hs16+ve分离物能更好地结合并增强由tgf-β1驱动的信号转导。此外，与hspm起始材料和非结合hs16-ve相比，hs16+ve能够增强由生理上更丰富的ltgf-β1驱动的信号转导。hmscs的分离和表征为了检查肝素-tgf-β1相互作用的生物效应，有必要分离原代hmsc。购买市售的骨髓细胞(lonza)，通过塑料粘附分离hmsc。随后将0代细胞扩增并以每小瓶1×106个细胞批次冷冻。通过facs筛选细胞在第5代时的msc表面标志物表达，如dominici等人[minimalcriteriafordefiningmultipotentmesenchymalstromalcells.theinternationalsocietyforcellulartherapypositionstatement.cytotherapy,2006.8(4):p.315-317.]。超过95％的分离的hmsc表达cd73，cd90和cd105，而cd14，cd19，cd34，cd45和hla-dr不表达。分离的细胞还能够在体外分化成成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞。因此，通过塑料粘附分离的细胞被认为满足hmsc的最低标准特征。肝素对hmscs中tgf-β1信号转导的影响分离原代hmscs后，我们接下来检查肝素和tgf-β1之间的相互作用是否可以影响对tgf-β1信号转导的细胞应答，其通过smad2和smad3的下游磷酸化来测量。肝素已显示出增强tgf-β1在原代大鼠和牛平滑肌细胞(smc)和ccl64貂肺上皮细胞系中的作用，但不是在原代人隐静脉(smc)中的作用[mccaffrey，ta等，transforminggrowthfactor-betaactivityispotentiatedbyheparinviadissociationofthetransforminggrowthfactorbeta/alpha2-macroglobulininactivecomplex.jcellbiol,1989.109(1):p.441-44；mccaffrey,t.a.等,protectionoftransforminggrowthfactorβactivitybyheparinandfucoidan.jcellphysiol,1994.159(1):p.51-59.]。因此，我们假设，如果肝素在hmsc中增强tgf-β1活性，那么当来自单独的tgf-β1的psmad2和psmad3信号开始消退才能看到效果。因此，为我们的初始tgf-β1给药实验选择的时间点为6,12,24和48小时。用一系列tgf-β1剂量处理第5代细胞，并在处理后6,12,24和48小时收集全细胞裂解物。然后在4-12％(w/v梯度)sds-page凝胶上分离溶菌产物样品，转移到硝酸纤维素膜上并通过蛋白质印迹方法探测磷酸-dsd2(psmad2)(138d4，cellsignalingtechnology)，磷酸-smad3(psmad3)c25a9，cellsignalingtechnology)，总smad2/3(cellsignalingtechnology)和肌动蛋白(clonec4，merckmillipore)。我们的研究结果表明没有tgf-β1(0ng/ml)，有低背景水平的psmad2和psmad3信号。使用1ng/ml，psmad2信号在处理后6小时相当强烈，并在12小时以后开始消退。psmad3信号与psmad2信号类似，尽管强度较低。对于5ng/ml和10ng/mltgf-β1，观察到psmad2信号在所测试的所有时间点都保持饱和，但是psmad3信号在24小时后恢复背景水平。因此选择6小时时间点用于所有后续实验。我们的下一个目标是确定用于我们的实验的肝素的剂量。正如mccaffrey等(supra)]先前已报道的，肝素的有效tgf-β1增强剂量在1-100μg/ml之间，我们选择使用该范围内的剂量。与用相同剂量的单独tgf-β1处理的细胞相比，用10μg/ml肝素预孵育的1ng/mltgf-β1处理的细胞维持了更强的psmad2和psmad3信号(图3.12)。较高剂量的肝素(40μg/ml)不能用1ng/ml的tgf-β1引起相同的效果。当用5ng/mltgf-β1预孵育时，两种剂量的肝素都不能增强psmad信号超过单独从生长因子获得的信号。总之，我们的结果表明肝素延长而不是增强由tgf-β1产生的psmad信号。我们接下来试图检查细胞表面hs可能对tgf-β1驱动的smad信号转导的影响。为此，在hmsc培养基中用肝素酶i，ii和iii(各1.2miu/ml)处理第5代细胞24小时，然后在无血清培养基中用含或不含肝素的tgf-β1处理。用于蛋白质印迹的6小时时间点需要在肝素酶处理后使用无血清培养基，以避免血清中的生长因子对smad2和3的背景水平可能具有的影响。用抗hs10e4抗体对细胞表面hs的免疫荧光染色显示，在24小时处理后，几乎所有的细胞表面hs都被除去。然而，细胞表面hs的去除似乎不影响当用tgf-β1处理细胞时产生的psmad信号。我们的研究结果表明肝素在加强tgf-β1信号转导中的作用不同于它在fgf-2信号转导中的作用[schlessinger,j.等,crystalstructureofaternaryfgf-fgfr-heparincomplexrevealsadualroleforheparininfgfrbindinganddimerization.molecularcell,2000.6(3):p.743-750.].hs16+ve和bmp-2-结合性hs(hs3+ve)的比较已经显示hs16+ve增强tgf-β1信号转导，我们(继而)感兴趣的是确定其是否可以类似地增强tgf-β超家族的其他成员的活性。我们的小组先前报道了hs级分即hs3+ve(其增强bmp-2的活性)的亲和分离[murali,s.等,affinity-selectedheparansulfateforbonerepair.biomaterials,2013.34(22):p.5594-5605；wo2010/030244]。两种蛋白之间的结构相似性保证了hs16+ve和hs3+ve的组成的比较(图12)。发现hs3+ve和hs16+ve含有相似量的δua-glcnac，δua-glcns和δua，2s-glcns，而hs16+ve含有比hs3+ve更多的δua-glcnac,6s,δua-glcns,6s和δua,2s-glcns,6s，以及更少的δua,2s-glcnac。必须注意的是，hs3+ve的组成通过毛细管电泳(ce)测定，而hs16+ve和hspm的组成通过hplc测定，因此在后两个样品中没有检测到δua，2s-glcnac，6s二糖。有人可能认为，不能检测到这种二糖将改变hs变体的组成特征，但是使用ce方法的先前的hspm分析产生了与hplc获得的组成分布类似的组成分布，不含δua，2s-glcnac，6s二糖。hs16+ve和hs3+ve的组成中观察到的差异对其活性具有功能性后果。令人惊讶的是，发现在基于spr的结合竞争测定中hs16+ve结合bmp-2比hs3+ve更好(图13)。然而，当研究其在小鼠c2c12成肌细胞系中增强bmp-2驱动的碱性磷酸酶(alp)表达的能力时，hs16+ve和bmp-2的组合不能实现当hs3+ve与bmp-2一起使用时的相同alp表达水平(图14)。总的来说，数据显示，使用tgf-β1肽亲和纯化的hs在组成上不同于原始hs制剂，将结合全长蛋白并以其活性和休眠形式增强其活性。此外，用tgf-β1肽纯化的hs不同于用bmp-2肽纯化的hs，并且该差异足以改变或调节其对tgf-β1的活性并减少未分级hspm的异质效应。讨论在这项研究中，我们已经表明肝素能够结合到tgf-β1，并因此增强了生长因子的热稳定性。这种稳定化似乎延长了hmsc中tgf-β1信号转导活性的半衰期。在软骨形成分化条件下，这种肝素介导的强化作用增强了早期软骨形成基因的表达。我们的发现支持这样的想法，即肝素对这种软骨形成基因表达的增强效应的发生是由于肝素通过tgf-β1信号通路起作用，并且需要18-22糖长度之间的gag链以最佳地结合tgf-β1并加强其信号。三元tgf-β1配体-受体复合物的研究表明，更长的肝素链可能干扰tgf-βii型受体(tβrii)与tgf-β1在复合物形成期间的结合(43)。尽管结合亲和力降低，但是2-o硫酸化的损失以及较小程度的6-o硫酸化实际上提高了肝素增强tgf-β1信号的能力。加上我们早期关于肝素链长度的影响的研究结果，这些结果为当前的hs“糖代码”假说(44-47)提供了强有力的证据，并支持了结合强度和生物活性之间的非线性关系的想法(48)。我们还鉴定了k13作为参与肝素结合的tgf-β1单体上的新残基。在该数据的指导下，我们继续从获自猪粘膜制剂的异质混合物中分离优先结合tgf-β1的hs群体(hs16+ve)。hs16+ve的表征证明它在组成上不同于hspm和hs16-ve，并且这种差异使得它能够更好地结合并加强hmsc中的tgf-β1和ltgf-β1信号转导。以前的研究表明，肝素将结合tgf-β1并保护其免受α2-巨球蛋白的蛋白酶活性和循环清除，从而增强其信号(3,5)。这导致其在一些软骨修复研究中用作tgf-β载体或作为支架材料(49,50)。一些研究甚至利用肝素控制在鼠msc的软骨形成诱导过程中生长因子的释放(51)。然而，这种糖不太可能被广泛采用作为组织修复或生长因子调节的治疗剂，不仅因为不受控制的出血和血小板减少的风险(52),而且因为肝素的过硫酸化意味着能够预先结合超过200种不同的细胞外蛋白，统称为肝素相互作用体或肝素体(53,54)。这意味着肝素不具有足够的特异性用于体内系统(其中生长因子的产生和定位不容易控制)中的靶向生长因子调节。然而，我们的体外数据表明肝素可以用于在hmsc软骨分化过程中延长tgf-β1活性，这表明如果这些固有的局限性可以克服，将实现一种治疗潜力。使用hs代替肝素理论上可以克服这些障碍，因为hs不具有肝素的抗凝血活性(55)。然而，hs确实产生其自身的一系列问题，包括原始制备物的高度可变性。然而，已经开发出克服这些困难的技术(26,27,29)并且通过利用这些技术中的一种(29)，我们能够证明了可以分离优先结合特定生长因子的hs选择性亚群。值得注意的是，虽然使用了tgf-β1衍生肽分离hs16+，但hs16+ve也能够调节ltgf-β1的作用，ltgf-β1是生理上丰富的tgf-β1体内形式。有趣的是，已报道肝素抑制ltgf-β1的活化(56)，而hs16+ve不抑制。这提出了关于在正常和改变的生理状态期间细胞体内合成tgf-β1-结合性hs的有趣问题。这里报道的工作为未来tgf-β1-hs研究奠定了基础，并建立在lyon等人提出的结合模型上。(2)。我们的数据将k13鉴定为新的残基，其似乎通过穿过凹槽(在蛋白单体之间延伸)的多肽的空间定向而影响肝素与tgf-β1的结合(图9)。此外，最近的几个大肝素片段的结构解决方案(57)使我们能够比较和验证我们关于tgf-β1和肝素结构的物理测量的体外研究结果。目前，ltgf-β1结构的有限知识(58-60)也引起了关于肝素和hs对调节这种较大蛋白的活性的作用的问题(补充图s1b，c)。tgf-β1首先合成为前蛋白，其在细胞内裂解以产生小的休眠复合物(slc)。成熟slc由tgf-β1二聚体组成，非共价连接到二聚的休眠相关肽(lap)。对于迄今研究的大多数细胞类型，slc与休眠型tgf-β1结合蛋白-1(ltbp-1)一起释放，从而形成大的休眠复合物(llc)(61)。ltbp-1通过与多种粘附蛋白相互作用将休眠tgf-β1推入细胞外基质(ecm)(62)，从而产生休眠性tgf-β1的储备物，这些储备物被激活(细胞介导的激活)后成为可以使用的。尽管lap具有被认为是稳定的结构，但是分子的两个区域可以解折叠从而在slc中捕获tgf-β1(60)。当这些区域的构象被机械强制完全打开时，活性tgf-β1从lap释放(58)。这两个结构域的同时解折叠是完全tgf-β1释放所必需的全或无的快速机制，只有当lap与ltbp-1结合时才是可能的。hs是否以及如何参与这种机械力的产生或释放是一个有趣的问题。所有这些考虑指出需要大量的计算机模拟肝素-tgf-β1相互作用以验证我们的结果，并开发计算工具来破译hs制剂如hs16+ve的结构域组织(63)。这样的研究将开放改进我们基于亲和力的hs分离或甚至化学上定义的tgf-β1特异性hs分子的合成的可能性(64)。总之，我们显示肝素和亲和力分离的hs，可以用于调节hmscs上的tgf-β1信号转导。我们也是第一个报道了肝素-tgf-β1相互作用的结构要求。总之，数据重申了理解这些分子之间的结构相互作用可以如何指导治疗发展的重要性。这有希望开发软骨修复的新型治疗策略，其利用碳水化合物分子调节tgf-β1活性来驱动hmsc的软骨形成分化。这种策略也可以扩展到涉及使用生长因子的其他组织修复策略。在我们的研究中，使用含有tgf-β1的肝素结合位点的肽通过亲和纯化从猪粘膜hs(hspm)中分离hs的tgf-β1结合部分。发现分离的tgf-β1肽结合hs(称为hs16+ve)在组成上不同于不结合的hs级分(其被称为hs16-ve)和原始hspm起始材料。组成上的这种变化增强了hs16+ve相对于hs16-ve和hspm结合并调节tgf-β1活性的能力。令人惊讶的是，hs16+ve也能够调节ltgf(tgf-β1的无活性、存储形式)的活性。当与hs3+ve(一种hs变体，被开发以增强bmp-2活性)比较时，[murali,s.等,affinity-selectedheparansulfateforbonerepair.biomaterials,2013.34(22):p.5594-5605.]，发现hs16+ve具有组成差异，这种差异改变了其增强bmp-2活性的能力(与hspm和hs3+ve相比)。在这项工作中，所用的肽长度为16个氨基酸，而全长成熟tgf-β1的长度为112个氨基酸。已知溶液中的肽采用不同于完全蛋白的一部分时所假定的构象，并且用于分离hs16+ve的利用pepfold[maupetit,j.,p.derreumaux,andp.tuffery,pep-fold:anonlineresourcefordenovopeptidestructureprediction.nucleicacidsresearch,2009.37(suppl2):p.w498-w503；maupetit,j.,p.derreumaux,和p.tufféry,afastmethodforlarge-scaledenovopeptideandminiproteinstructureprediction.journalofcomputationalchemistry,2010.31(4):p.726-738；和216.thévenet,p.等,pep-fold:anupdateddenovostructurepredictionserverforbothlinearanddisulfidebondedcyclicpeptides.nucleicacidsresearch,2012.40(w1):p.w288-w293.]进行的tgf-β1肽结构预测不匹配其tgf-β1中的天然结构。这提出了驱动我们基于肽的亲和纯化的机制的问题，因为很难设想单个肽段将能够重建tgf-β1肝素结合结构域的空间组织。有人可以提出肽和hs之间的相互作用主要由离子相互作用驱动，这对于肽-肝素相互作用几乎肯定是真的(来自我们组的未发表的数据)，但是在这里似乎不是这样的情况，因为使用来自不同蛋白(bmp-2)的肽改变了分离的hs级分的特性(profile)。广泛研究的涉及肝素结合的碱性残基的共有序列被提议采用碱性残基的两个基序之一：-x-b-b-bx-x-b-x-x-或-x-b-b-x-b-x-x-(其中x为任何中性或酸性的氨基酸且b是碱性残基)[cardin,a.d.和h.j.weintraub,molecularmodelingofproteinglycosaminoglycaninteractions.arteriosclerosis,thrombosis,andvascularbiology,1989.9(1):p.21-32.]。已经提出了存在于tgf-β1中的第三种基序：-x-bx-x-b-x-x-b-x-x-b-x-[mccaffrey,t.a.,d.j.falcone，和b.du,transforminggrowthfactor-β1isaheparin-bindingprotein:identificationofputativeheparin-bindingregionsandisolationofheparinswithvaryingaffinityfortgf-β1.jcellphysiol,1992.152(2):p.430-440.]。有趣的是，pace和scholtz[nickpace,c.和j.martinscholtz,ahelixpropensityscalebasedonexperimentalstudiesofpeptidesandproteins.biophysicaljournal,1998.75(1):p.422-427]已报道碱性残基具有在溶液中形成α-螺旋的高倾向。考虑到这些提出的基序中的碱性残基的组织以及α-螺旋的组织(每一圈3.6个氨基酸残基)，并不奇怪地发现这些基序在溶液中采用螺旋结构，而其碱性残基沿着相同的平面排列。如果是真的，这样的组织可能赋予肽一定程度的选择性。hs16+ve的大小和组成分析显示，相对于hs16-ve和hspm，它富集了更长的多糖链，链长度分布方面较少异质性，并富集了6-o-和n-硫酸化二糖。这证实了我们在肝素-tgf-β1相互作用的研究中的发现，其中我们鉴定了肝素链需要至少等同于dp22并具有6-o-和n-硫酸基团以有效地结合和调节tgf-β1活性。hs富含更长的链这一点可以通过需要至少22个糖单元来桥接tgf-β1同源二聚体上的两个肝素/hs结合位点而得到解释。这样的链还必须满足硫酸分布标准以有效地与tgf-β1相互作用，这将进一步缩窄通过我们的纯化而选择的hs链的范围。hs16+ve能够加强tgf-β1驱动的smad信号转导至与肝素类似的程度。出人意料的是，其对ltgf-β1的影响比肝素对ltgf-β1的影响更显著。由于ltgf-β1是体内tgf-β1的主要形式，这引起关于hs在tgf-β1信号转导中的合成和生理作用的有趣问题。ltgf的休眠相关肽(lap)部分具有被认为是稳定的结构，虽然分子的两个区域可以解折叠[shi,m.等,latenttgf-βstructureandactivation.nature,2011.474(7351):p.343-349]以使其在ltgf-β1复合物中捕获tgf-β1。当这些区域的构象被机械强制完全打开时，活性tgf-β1从lap释放[buscemi,l.等,thesingle-moleculemechanicsofthelatenttgf-β1complex.currbiol,2011.21(24):p.2046-2054]。这两个结构域的同时解折叠是完全tgf-β1释放所必需的全或无的快速机制，只有当lap与ltgf-结合蛋白-1(ltbp-1)结合时才是可能的。有趣的是，已经报道lap和ltbp-1都与肝素相互作用[lee,m.j.,heparininhibitsactivationoflatenttransforminggrowthfactor-β1.pharmacology,2013.92(5-6):p.238-244；chen,q.等,potentialroleforheparansulfateproteoglycansinregulationoftransforminggrowthfactor-β(tgf-β)bymodulatingassemblyoflatenttgf-β-bindingprotein-1.jbiolchem,2007.282(36):p.26418-26430；andparsi,m.k.,等,ltbp-2hasmultipleheparin/heparansulfatebindingsites.matrixbiology,2010.29(5):p.393-401].hs是否以及如何参与这种机械力的产生或释放是一个相关的问题，虽然证据表明在体内合成的hs可以被调节以激活ltgf-β1。hs16+ve的组成与hs3+ve的组成的比较显示了它们组成上的差异。在hs变体结合和调节bmp-2活性的能力中观察到的差异可能是组成差异和继而体现在hs链中的二糖序列的组合的结果。bmp-2-肝素相互作用的建模[gandhi,n.s.和r.l.mancera,predictionofheparinbindingsitesinbonemorphogeneticproteins(bmps).biochimicaetbiophysicaacta(bba)-proteinsandproteomics,2012.1824(12):p.1374-1381]表明，它们的结合与tgf-β1和肝素的结合显著不同，这将解释hs16+ve和hs3+ve的组成的差异，也提示了tgf-β超家族内肝素/hs结合位点的多样化[rider,c.c.,heparin/heparansulphatebindinginthetgf-βcytokinesuperfamily.biochemsoctrans,2006.34(pt3):p.458-460.]。在hs16+ve相对于hspm增强bmp-2驱动的alp表达的能力中观察到的中度增加可能归因于hs16+ve中硫酸化hs链的富集，使得其比hspm更类似于肝素，或者在hs16+ve和hs3+ve制剂中hs链的组成的重叠。尽管hs似乎不以核酸和蛋白质中观察到的相同的绝对序列特异性被编码，但我们的结果为当前的hs“糖代码”假说[gama,c.i.等,sulfationpatternsofglycosaminoglycansencodemolecularrecognitionandactivity.natchembiol,2006.2(9):p.467-473；duchesne,l.,等,transportoffibroblastgrowthfactor2inthepericellularmatrixiscontrolledbythespatialdistributionofitsbindingsitesinheparansulfate.plosbiol,2012.10(7):p.e1001361；chang,z.,等,differentialabilityofheparansulfateproteoglycanstoassemblethefibroblastgrowthfactorreceptorcomplexinsitu.fasebj,2000.14(1):p.137-144；andjastrebova,n.,等,heparansulfatedomainorganizationandsulfationmodulatefgf2inducedcellsignaling.jbiolchem,2010]提供了有力的证据并支持了结合强度和生物活性之间的非线性关系的想法[rudd,t.r.等,comparablestabilisation,structuralchangesandactivitiescanbeinducedinfgfbyavarietyofhsandnon-gaganalogues:implicationsforsequence-activityrelationships.orgbiomolchem,2010.8(23):p.5390-5397.]。尚待回答的主要问题之一是给定hs链与给定蛋白相互作用所需的严格性水平。希望开发改进的计算工具来解码gag的组织将有助于这项工作[spencer,j.l.等,acomputationalapproachfordecipheringtheorganizationofglycosaminoglycans.plosone,2010.5(2):p.e9389]。实施例1参考文献1.ori,a.,wilkinson,m.c.,和fernig,d.g.(2011)jbiolchem2.lyon,m.,rushton,g.,和gallagher,j.t.(1997)jbiolchem272,18000-180063.mccaffrey,t.a.,falcone,d.j.,brayton,c.f.,agarwal,l.a.,welt,f.g.,和weksler,b.b.(1989)jcellbiol109,441-4484.mccaffrey,t.a.,falcone,d.j.,和du,b.(1992)jcellphysiol152,430-4405.mccaffrey,t.a.,falcone,d.j.,vicente,d.,du,b.,consigli,s.,和borth,w.(1994)jcellphysiol159,51-596.lee,j.-h.,lee,h.,joung,y.k.,jung,k.h.,choi,j.-h.,lee,d.-h.,park,k.d.,和hong,s.-s.(2011)biomaterials32,1438-14457.watson,r.s.,gouze,e.,levings,p.p.,bush,m.l.,kay,j.d.,jorgensen,m.s.,dacanay,e.a.,reith,j.w.,wright,t.w.,和ghivizzani,s.c.(2010)labinvest90,1615-16278.siebert,n.,xu,w.,grambow,e.,zechner,d.,和vollmar,b.(2011)labinvest91,1753-17659.jakowlew,s.(2006)cancermetastasisrev25,435-45710.yang,y.-a.,dukhanina,o.,tang,b.,mamura,m.,letterio,j.j.,macgregor,j.,patel,s.c.,khozin,s.,liu,z.-y.,green,j.,anver,m.r.,merlino,g.,和wakefield,l.m.(2002)jclininvest109,1607-161511.grimaud,e.,heymann,d.,和rédini,f.(2002)cytokinegrowthfactorrev13,241-25712.rosen,f.,mccabe,g.,quach,j.,solan,j.,terkeltaub,r.,seegmiller,j.e.,和lotz,m.(1997)arthritisrheum40,1275-128113.toh,w.s.,liu,h.,heng,b.c.,rufaihah,a.j.,ye,c.p.,和cao,t.(2005)growthfactors23,313-32114.vanderkraan,p.m.,blaneydavidson,e.n.,blom,a.,和vandenberg,w.b.(2009)osteoarthritiscartilage17,1539-154515.yang,x.,chen,l.,xu,x.,li,c.,huang,c.,和deng,c.-x.(2001)jcellbiol153,35-4616.miura,y.,parvizi,j.,fitzsimmons,j.s.,和o’driscoll,s.w.(2002)jbonejointsurgam84,793-79917.sato,m.,ishihara,m.,ishihara,m.,kaneshiro,n.,mitani,g.,nagai,t.,kutsuna,t.,asazuma,t.,kikuchi,m.,和mochida,j.(2007)jbiomedmaterresbapplbiomater83b,181-18818.wang,w.,li,b.,li,y.,jiang,y.,ouyang,h.,和gao,c.(2010)biomaterials31,5953-596519.allen,j.b.,manthey,c.l.,hand,a.r.,ohura,k.,ellingsworth,l.,和wahl,s.m.(1990)jexpmed171,231-24720.leah,e.(2013)natrevrheumatol9,382-38221.bakker,a.c.,vandeloo,f.a.j.,vanbeuningen,h.m.,sime,p.,vanlent,p.l.e.m.,vanderkraan,p.m.,richards,c.d.,和vandenberg,w.b.(2001)osteoarthritiscartilage9,128-13622.blaneydavidson,e.n.,scharstuhl,a.,vitters,e.l.,vanderkraan,p.m.,和vandenberg,w.b.(2005)arthritisresther7,r1338-r134723.kopesky,p.w.,vanderploeg,e.j.,kisiday,j.d.,frisbie,d.d.,sandy,j.d.,和grodzinsky,a.j.(2011)tissueengparta17,83-9224.shah,r.n.,shah,n.a.,delrosariolim,m.m.,hsieh,c.,nuber,g.,和stupp,s.i.(2010)procnatlacadsciusa107,3293-329825.coupes,b.m.,williams,s.,roberts,i.s.d.,short,c.d.,和brenchley,p.e.c.(2001)nephroldialtransplant16,361-36726.bramono,d.s.,murali,s.,rai,b.,ling,l.,poh,w.t.,lim,z.x.,stein,g.s.,nurcombe,v.,vanwijnen,a.j.,和cool,s.m.(2012)bone50,954-96427.helledie,t.,dombrowski,c.,rai,b.,lim,z.x.h.,hin,i.l.h.,rider,d.a.,stein,g.s.,hong,w.,vanwijnen,a.j.,hui,j.h.,nurcombe,v.,和cool,s.m.(2012)stemcellsdev21,1897-191028.murali,s.,leong,d.f.m.,lee,j.j.l.,cool,s.m.,和nurcombe,v.(2011)jbiolchem286,17755-1776529.murali,s.,rai,b.,dombrowski,c.,lee,j.l.j.,lim,z.x.h.,bramono,d.s.,ling,l.,bell,t.,hinkley,s.,nathan,s.s.,hui,j.h.,wong,h.k.,nurcombe,v.,和cool,s.m.(2013)biomaterials34,5594-560530.samsonraj,r.m.,raghunath,m.,hui,j.h.,ling,l.,nurcombe,v.,和cool,s.m.(2013)gene519,348-35531.rider,d.a.,dombrowski,c.,sawyer,a.a.,ng,g.h.b.,leong,d.,hutmacher,d.w.,nurcombe,v.,和cool,s.m.(2008)stemcells26,1598-160832.zhang,l.,su,p.,xu,c.,yang,j.,yu,w.,和huang,d.(2010)biotechnollett32,1339-134633.hernaiz,m.,liu,j.,rosenberg,r.d.,和linhardt,r.j.(2000)biochembiophysrescommun276,292-29734.uniewicz,k.a.,ori,a.,xu,r.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cesintgf-βeffectsonchondrocytemetabolism:potentialtherapeuticrolesoftgf-βincartilagedisorders.cytokinegrowthfactorrev,2002.13(3):p.241-257；serra,r.等人,expressionofatruncated,kinase-defectivetgf-βtypeiireceptorinmouseskeletaltissuepromotesterminalchondrocytedifferentiationandosteoarthritis.jcellbiol,1997.139(2):p.541-552.；blaneydavidson,e.等人,tgfbeta-inducedcartilagerepairismaintainedbutfibrosisisblockedinthepresenceofsmad7.arthritisresther,2006.8(3):p.r65]。因此，迄今为止的大多数研究已经使用外源tgf-β1(单独或与其它生长因子组合)驱动hmsc软骨形成分化[blaneydavidson,e.n.,p.m.vanderkraan,和w.b.vandenberg,tgf-βandosteoarthritis.osteoarthritiscartilage,2007.15(6):p.597-604；park,j.s.等,heparin-boundtransforminggrowthfactor-β3enhancesneocartilageformationbyrabbitmesenchymalstemcells.transplantation,2008.85(4):p.589-596；goepfert,c.等,cartilageengineeringfrommesenchymalstemcells,inbioreactorsystemsfortissueengineeringii,c.kasper,m.vangriensven,和r.editors.2010,springerberlin/heidelberg.p.163-200；mara,c.s.等,regulationofchondrogenesisbytransforminggrowthfactor-β3andinsulin-likegrowthfactor-1fromhumanmesenchymalumbilicalcordbloodcells.jrheumatol,2010.37(7):p.1519-1526.]。虽然最初看起来成功，但是这些方法在其转移到临床中面临显著的障碍，因为经常使用超生理剂量的tgf-β1来克服清除，并且甚至20ng剂量已经显示产生不期望的结果，例如滑膜炎[leah,e.,osteoarthritis:tgf-βoverloadatbonesofcartilagedegeneration.natrevrheumatol,2013.9(7):p.382-382；allen,j.b.等人,rapidonsetsynovialinflammationandhyperplasiainducedbytransforminggrowthfactorbeta.jexpmed,1990.171(1):p.231-247]。除了非生理剂量的问题之外，还需要将生长因子定位于治疗部位以防止其引发全身副作用，例如纤维化和肿瘤发生[jakowlew,s.,transforminggrowthfactor-βincancerandmetastasis.cancermetastasisrev,2006.25(3):p.435-457；bakker,a.c.等人,overexpressionofactivetgf-beta-1inthemurinekneejoint:evidenceforsynovial-layer-dependentchondro-osteophyteformation.osteoarthritiscartilage,2001.9(2):p.128-136；yang,y.-a.等人,lifetimeexposuretoasolubletgf-βantagonistprotectsmiceagainstmetastasiswithoutadversesideeffects.jclininvest,2002.109(12):p.1607-1615.]。此外，对tgf-β1的敏感性随年龄增加而降低[blaneydavidson,e.n.等人,reducedtransforminggrowthfactor-betasignalingincartilageofoldmice:roleinimpairedrepaircapacity.arthritisresther,2005.7(6):p.r1338-r1347.]，因此足够的tgf-β1给药对老年患者呈现更大的风险。响应于这些挑战，正在考虑新的策略，其减少或完全消除对外源性生长因子的需要，更好地定位和控制生长因子在治疗部位的递送，并且提高对生长因子的细胞敏感性或因子的信号转导效率。已经描述了hs16+ve的发展及其在msc单层培养物中增强tgf-β1驱动的smad应答的能力，我们假设它可以用于通过隐蔽内源性tgf-β1来改善软骨愈合。因此，我们试图研究其对以下两方面的影响：(1)体外hmscs的软骨形成分化；和(2)兔模型中的软骨愈合响应。本实施例描述了用改良的微细胞团培养系统来研究hs16+ve对hmsc的软骨形成分化的体外作用。然后，在用于软骨修复的兔模型中滑车槽(trochleagroove)的完全深度的软骨缺陷中，继续研究了先前描述的hs变体当与当前的临床“护理标准”组合使用时的效果。材料和方法逆转录和定量pcr(qpcr)使用trizol试剂(lifetechnologies,ca,usa)根据制造商的方案从软骨形成微细胞团中分离总rna。使用vilotmcdna分析试剂盒(lifetechnologies)，按照制造商的说明书，在1μgrna上进行逆转录，在42℃下孵育2小时而不是1小时。每个qpcr含有40ngcdna，每个基因1μl引物-探针混合物和10μl快速通用pcr主混合物(lifetechnologies)，终体积为20μl。热循环条件为95℃，20秒，然后在95℃下进行1秒，60℃下进行20秒，45个循环。每个qpcr一式两份进行，基因表达相对于hprt1表达归一化以获得δct值。取生物学一式三份的平均值。在不含gag或tgf-β1的培养基中培养的软骨形成性微细胞团用作对照(δδct)。各个引物集的相对表达水平通过2-δδct方法[livak,k.j.和t.d.schmittgen,analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativepcrandthe2-δδctmethod.methods,2001.25(4):p.402-408.]表示为倍数变化。使用以下引物-探针测定(lifetechnologies)：体内研究设计二十二只骨骼成熟的雄性新西兰白兔(平均年龄9个月，体重3.9kg)被用于本研究。所有兔子接受股骨滑车槽上双侧软骨缺损，每个缺陷随机分配到四个治疗组之一：(1)凝胶单独，(2)凝胶+hspm，(3)凝胶+hs16+ve和(4)凝胶+hs16-ve。每个缺陷接受60μl基于透明质酸的水凝胶(gel)(auxigeltm，termiraab，stockholm，sweden)[bergman,k.等,injectablecell-freetemplateforbone-tissueformation.journalofbiomedicalmaterialsresearchparta,2009.91a(4):p.1111-1118.]和10μg的hspm,hs16+ve或hs16-ve。两只兔子死于胃潴留术后，不包括在分析中。缺陷创建和凝胶注射用于本研究的研究方案由机构动物护理和使用委员会(a*star新加坡)批准，并遵循所有合适的指导方针。所有外科手术在全身麻醉下进行，所述麻醉在无菌条件下通过面罩采用氯胺酮(35mg/kg)和赛拉嗪(5mg/kg)注射液和异氟烷的组合组成。进行15-20mm的内侧对-髌骨皮肤切口，并且髌骨侧向脱位。在每个股骨滑车槽的中心制造一个完整厚度的临界尺寸的软骨缺损(直径4mm，深2mm)，完全清除钙化软骨。随后，使用整形外科钻子在每个缺陷中制造3个微裂缝(0.8mm直径，2mm深度)并用外科手术纱布施加直接压力以确保在施加指定的治疗之前所有的出血停止。用200μl移液管施加治疗并待其凝固。当凝胶载体凝固时，观察到所有缺陷都充满血液。一旦凝胶载体凝固，将髌骨重新定位，并将关节弯曲15次，以确保在切口闭合成层之前，治疗保持在原位，并允许兔子承受重量。用vetbondtm组织粘合剂(3m，mn，usa)进一步密封伤口部位。在手术后5天皮下施用预防性抗生素(恩氟沙星，10mg/kg)和止痛剂(丁丙诺啡，0.1mg/kg)。在12周时，所有兔子在镇静后用戊巴比妥(150mg/kg)安乐死。收获远端股骨并在处理用于组织学和免疫组织化学(ihc)分析之前进行宏观成像。关节的大体病理观察关节的图像由不知道各治疗组的盲观察者检查和评分。宏观评分基于国际软骨修复学会(icrs)视觉评估量表(icrsi评分系统)[brittberg,m.和l.peterson,introductionofanarticularcartilageclassification.icrsnewsletter,1998.1:p.5-8.].组织学分析收获的远端股骨头在真空下在10％(v/v)中性缓冲福尔马林(nbf)中固定1周，并在室温下在5％(v/v)甲酸中脱钙平均6-7天。随后将样品包埋在石蜡中并沿缺损中间横切(5μm)。将切片脱石蜡并用马松三色，阿尔新蓝(ph1，用中性红复染)和番红o染色。免疫组织化学(ihc)分析使用leicabondtm-iii或leicabondtm-maxautostainer(leicanusslochgmbh，germany)和bondtm精细检测试剂盒(leica)进行ihc染色。将切片用bondtmdewax溶液(leica)脱蜡并通过与蛋白酶k(20μg/ml)(sigma-aldrich)在室温下孵育15分钟进行抗原修复。通过用3-4％(v/v)h2o2孵育15分钟来阻断内源性过氧化物酶活性。然后将切片在10％(v/v)山羊血清中封闭30分钟，然后与稀释于bondtm一抗稀释剂(leica)中的第一抗体(i型胶原蛋白(1：1000)，novusbiologicals，co，usa和ii型胶原蛋白(1:2000)，inc.，ca，usa)在室温下孵育30分钟。染色的检测如bondtm精细检测试剂盒中所述的进行，并将细胞核用苏木精复染色5分钟。所有洗涤用1×bondtm洗涤溶液(leica)进行。组织学评分染色切片的检查和评分由不知道治疗组的被掩蔽的观察者进行。基于o’driscoll[o’driscoll,s.w.,f.w.keeley,和r.b.salter,thechondrogenicpotentialoffreeautogenousperiostealgraftsforbiologicalresurfacingofmajorfullthicknessdefectsinjointsurfacesundertheinfluenceofcontinuouspassivemotion.anexperimentalinvestigationintherabbit.jbonejointsurgam,1986.68(7):p.1017-1035]和icrsii[mainil-varlet,p.等,anewhistologyscoringsystemfortheassessmentofthequalityofhumancartilagerepair:icrsii.theamericanjournalofsportsmedicine,2010]打分系统进行打分，并且通过量化软骨和软骨下空间内每种组织类型(即骨组织，纤维组织，纤维软骨，混合软骨和透明软骨)的百分比来确定组织填充。结果hs16+ve对hmsc在体外的软骨形成分化的影响为了评估hs16+ve对hmscs体外软骨形成分化的影响，首先必须确定单独的tgf-β1的作用。软骨形成分化使用改良的微团培养系统进行[zhang,l.等人,chondrogenicdifferentiationofhumanmesenchymalstemcells:acomparisonbetweenmicromassandpelletculturesystems.biotechnollett,2010.32(9):p.1339-1346.]。简言之，收获第4代hmsc，并以2×107个细胞/ml重悬于化学成分确定的软骨形成培养基(pt-3003，lonza,md,usa)中。然后将12.5μl的液滴接种在24孔板的每个孔的中间，使之在37℃下贴壁2小时，之后，将500μl的软骨形成培养基加入每个孔中，所述软骨形成培养基补充有1或10ng单独的tgf-β1(100-2c，peprotech)或具有5或10μg/ml肝素(sigma-aldrich)、猪粘膜hs(hspm)(celsus实验室)、hs16+ve或hs16-ve。细胞小滴在24小时后聚结成球形团块。培养基每3天更换，并且在第3，7,14和第21天收集微团。在第3,7,14和21天取得所得对照(ctrl)和tgf-β1处理(10ng/ml)(tgf-β1)组微细胞团的湿重(图15)。虽然在任一治疗组中的细胞团的重量随时间降低，但是在tgf-β1处理组的细胞团中的重量损失不如对照组细胞团显著。在第3(仅sox9和comp)，7,14和21天对微细胞团的基因表达分析显示，相对于未处理的对照细胞团(对照)，用10ng/mltgf-β1(tgf-β1)处理一致性地导致软骨形成标志物sox9(图16a)、comp(图16b)和聚集蛋白聚糖(图16c)表达的增加。使用未分化的hmsc作为第0天对照。ii型胶原转录物仅在tgf-β1处理的细胞团和未分化的hmsc中可检测到(图16d)。这似乎表明当在单层中生长时，hmsc表达低水平的ii型胶原转录物，但是当在没有tgf-β1的软骨形成培养基中作为微团培养时，该表达丢失。最后，发现tgf-β1处理的细胞团相对于对照细胞团表达极高水平的x型胶原蛋白转录物(软骨细胞肥大的标志物)(图16e)。这种高表达水平表明细胞团正经历软骨形成性肥大，作为软骨内骨化的前奏[shen,g.,theroleoftypexcollageninfacilitatingandregulatingendochondralossificationofarticularcartilage.orthodontics&craniofacialresearch,2005.8(1):p.11-17]。在第21天通过阿尔辛蓝染色(其染色的gag为蓝色)的石蜡包埋的细胞团的组织学检查显示，相较于对照组细胞团，tgf-β1处理的细胞团含有更多的gag。已经确立了tgf-β1对hmscs的软骨形成分化的作用，接下来我们试图检查肝素具有的效应，然后开始研究hs16+ve的作用。在实施例1中，我们显示肝素能够在处理后6小时增强hmsc中tgf-β1驱动的psmad信号。由于在软骨形成分化过程中每3天更换培养基，我们选择使用第3天时间点来检查肝素对sox9和comp的表达的影响,sox9和comp均为早期软骨形成的标志物[barry,f.等人,chondrogenicdifferentiationofmesenchymalstemcellsfrombonemarrow:differentiation-dependentgeneexpressionofmatrixcomponents.expcellres,2001.268(2):p.189-200；li,h.等人,comparativeanalysiswithcollagentypeiidistinguishescartilageoligomericmatrixproteinasaprimarytgfβ-responsivegene.osteoarthritiscartilage,2011.19(10):p.1246-1253；huang,a.h.,a.stein,和r.l.mauck,evaluationofthecomplextranscriptionaltopographyofmesenchymalstemcellchondrogenesisforcartilagetissueengineering.tissueengparta,2010.16(9):p.2699-708；zaucke,f.等人,cartilageoligomericmatrixprotein(comp)andcollagenixaresensitivemarkersforthedifferentiationstateofarticularprimarychondrocytes.biochemj,2001.358(1):p.17-24.]。我们还推断，如果肝素能加强tgf-β1的作用，则对推荐剂量10ng/ml的响应的进一步增加可能是检测不到的。因此，与推荐剂量平行使用较低剂量的tgf-β1。我们的数据显示，不管使用的tgf-β1的量如何，5μg/ml的肝素不显著改变sox9表达的水平(图17a)。相反，10μg/ml的肝素本身不影响sox9表达，但是当与1ng/mltgf-β1一起使用时，能够增加sox9的表达。当与10ng/ml的tgf-β1一起使用时，相同剂量的肝素不能引起sox9表达的任何变化，表明tgf-β1信号已经饱和。在comp表达的情况下，发现两种剂量的肝素自身都轻微地减少其表达(图17b)。然而，当与1ng/mltgf-β1组合使用时，肝素能够以剂量依赖性方式增加comp表达水平。使用任一剂量的肝素与10ng/ml的tgf-β1不能引起comp表达的进一步增加。事实上，较高剂量的肝素实际上降低了comp表达水平。这再次表明10ng/ml的tgf-β1是使得hmsc经历软骨形成分化的饱和剂量。当10μg/ml肝素与10ng/mltgf-β1一起使用时观察到的comp表达的降低表明响应于过量tgf-β1信号的负反馈机制的激活。选择剂量为10μg/ml的gag以与1ng/ml剂量的tgf-β1联合使用。用1ng/mltgf-β1,1ng/mltgf-β1和10μg/ml肝素或10ng/mltgf-β1培养21天的细胞团的组织学分析显示，较高剂量的tgf-β1导致gag产生和沉积的增加(基于阿尔辛蓝染色)。与单独的1ng/ml的tgf-β1相比，使用肝素与tgf-β1导致gag沉积略微增加，但是该增加仍然小于对10ng/ml的tgf-β1观察到的增加。接下来，在单独1ng/mltgf-β1(1tgf-β1)或与10μg/mlgag(肝素，hspm，hs16+ve或hs16-ve)组合的存在下，或用10ng/mltgf-β1(10tgf-β1)作为阳性对照，使hmsc分化21天。在21天时分析sox9mrna表达，显示使用的所有糖都没有产生显著变化(图18a)。当用肝素或hs16+ve(p<0.05)结合1ng/mltgf-β1培养细胞团时，相对于单独的1ng/mltgf-β1，comp表达增加约2.5倍(图18b)。在补充有低(1ng/ml)tgf-β1和hspm或者hs16-ve，或补充有高(10ng/ml)tgf-β1的培养基中的培养相对于单独的低剂量tgf-β1没有显著改变comp表达。在第21天，聚集蛋白聚糖表达对于低剂量和高剂量的tgf-β1以及肝素和hs16+ve是类似的(图18c)。然而，与hspm和hs16-ve一同培养降低了聚集蛋白聚糖的转录水平。相对于低tgf-β1，高tgf-β1诱导了x型胶原表达的显著增加(p<0.001)(图18d)。用gag处理相对于低tgf-β1没有显著改变x型胶原表达。ii型胶原转录物仅在用高tgf-β1处理的细胞团中检测到，因此这里未显示。应当注意，在用hs16+ve处理的所有样品中观察到的高方差源自数据集内的异常值的存在。相对于低tgf-β1，在第21天通过阿尔辛蓝染色的细胞团的组织学检查未表明用各种糖培养的细胞团之间的显著差异。然而，与低tgf-β1相比，高tgf-β1的确诱导了gag产量的中度增加。hs16对msc在体内的软骨形成分化的影响选择骨骼成熟的成年新西兰白兔用于我们的体内试验，这既是由于它们在软骨修复研究中的广泛使用，也是为了避免在未成年兔中会观察到的自发性愈合。我们选择在包括在股骨滑车槽中的全深度软骨缺损的模型中试验我们的化合物，其中微裂缝与市售的基于透明质酸的水凝胶(auxigeltm，termiraab)一起使用[bergman,k.,等,injectablecell-freetemplateforbone-tissueformation.journalofbiomedicalmaterialsresearchparta,2009.91a(4):p.1111-1118.],基于reinholz等提出的指南[reinholz,g.g.等人,animalmodelsforcartilagereconstruction.biomaterials,2004.25(9):p.1511-1521.],icrs[hurtig,m.b.等人,preclinicalstudiesforcartilagerepair:recommendationsfromtheinternationalcartilagerepairsociety.cartilage,2011.2(2):p.137-152.],以及医院当前的标准治疗实践[fritz,j.等,articularcartilagedefectsintheknee-basics,therapiesandresults.injury,2008.39(1,supplement):p.50-57；hunziker,e.b.,articularcartilagerepair:basicscienceandclinicalprogress.areviewofthecurrentstatusandprospects.osteoarthritiscartilage,2002.10(6):p.432-463].兔和人tgf-β1的序列比对揭示了tgf-β1不仅在两个物种之间高度保守，而且鉴定的肝素结合结构域几乎相同(图19)。已发现兔的关节液中tgf-β1的平均水平范围从年轻兔中的112.7pg/ml到成年兔中的52.3pg/ml[wei,x.和k.messner,age-andinjury-dependentconcentrationsoftransforminggrowthfactor-β1andproteoglycanfragmentsinrabbitkneejointfluid.osteoarthritisandcartilage,1998.6(1):p.10-18.]，而发现抗凝血的骨髓穿刺液的水平在成年兔(n＝20)中的范围为190-881.8pg/ml，(lim,z.x.h.,未出版数据)。单独的研究还报告了在血小板活化后高达纳克水平的tgf-β1的增加[coupes,b.m.等,plasmatransforminggrowthfactorβ1andplateletactivation:implicationsforstudiesintransplantrecipients.nephroldialtransplant,2001.16(2):p.361-367]，以及足够水平的tgf-β1在伤口中的存在以刺激软骨修复[shah,r.n.等人,supramoleculardesignofself-assemblingnanofibersforcartilageregeneration.procnatlacadsciusa,2010.107(8):p.3293-3298]。因此，我们的糖处理排除了外源性tgf-β1的使用。进行12周的研究从而比较下列组：(1)每个缺陷用60μl水凝胶处理的对照组(单独凝胶)；(2)用60μl水凝胶和10μghspm处理的缺陷(hspm)；(3)用60μl水凝胶和10μg的hs16+ve处理的缺陷(hs16+ve)，和(4)用60μl水凝胶和10μghs16-ve处理的缺陷(hs16-ve)。基于我们先前的工作，10μg/ml的gag被确定为对于增强1ng/mltgf-β1的作用是最佳的。因此，确定10μggag的剂量将足以在缺陷内实现该最佳浓度，即使在考虑滑膜腔内可能的扩散之后。如上所述创建缺陷。两只兔子在试验结束前死于胃潴留，因此被排除在分析之外。在试验结束时，从兔中收获整个股骨，在10％(v/v)nbf中固定，并在脱钙并进行组织学处理之前进行宏观成像。12周后宏观观察缺陷显示对照(单独凝胶)和处理组之间在组织填充方面的微小差异。虽然在每个治疗组内组织填充有相等量的变化，但是相对于其他组中的那些，在对照组中有更多的缺陷被不完全填充。用hspm，hs16+ve和hs16-ve治疗的组的中值分数高于单独的凝胶的那些(图20b)，表明使用hs16+ve可以提高愈合反应的一致性。来自o’driscoll和icrsii评分系统的组织学评分显示治疗组之间没有显著差异。通过首先识别软骨和软骨下空间的边界，在成像部分上叠加网格，然后测量每个组织学空间所填充的空间量，来确定缺损的组织填充。在组织填充方面，几乎所有的样品表现出完全的软骨下填充和高水平的软骨填充。所有治疗组的组织填充分数之间没有统计学差异。所有样品中软骨下填充的中值百分比相似。所有三种化合物(hspm，hs16-ve和hs16+ve)具有高于对照样品(gel，其为目前的临床标准护理治疗)的中值组织填充分数。体外数据表明，相对于hspm和hs16-ve，hs16+ve能够增强tgf-β1诱导的许多软骨形成标志物的表达。这表明可能需要在植入前用hs和tgfβ1预加载(例如，涂覆或浸渍)凝胶构建物。体内数据显示，用单剂量的糖治疗全深度软骨缺损，结合微裂缝和水凝胶植入，至少与目前的标准护理治疗一样好，并且不产生不期望的副作用。hs16+ve在体内数据中具有高于对照样品(gel，其是当前的临床标准护理治疗)的中值分数。当前第1页12当前第1页12