蛋白质异二聚体及其用途的制作方法

背景

虽然针对肿瘤抗原的免疫应答(disis等(1997)j.clin.oncol.15:3363-3367)可被检测，但引起疾病的恶性细胞通常不能引起导致排斥的免疫应答。研究已显示，有可能通过将免疫调节分子(诸如细胞因子和共刺激分子)引入肿瘤细胞来增强其免疫原性；然而，根除残余癌细胞可能需要靶向广泛分散的微转移肿瘤沉积物，而这些微转移肿瘤沉积物不能直接进行基因转移。另外，引入的免疫调节分子的表达和稳定性通常远不令人满意。由免疫系统的细胞产生的免疫调节剂，诸如细胞因子，可以直接或间接激活适应性免疫反应的细胞，并且可在引发保护性抗肿瘤免疫中起重要作用。先天免疫系统可以通过导致促炎症细胞因子(诸如ifn-α、tnf-α和白细胞介素)释放的细菌产物或“危险”信号触发。

多项研究已表明，免疫调节剂可用于在动物模型和癌症患者中施加抗肿瘤作用。然而，与免疫调节剂的应用相关的短半衰期和系统性毒性极大地限制了它们的使用。在cn200880117225.8中，已描述了包含连接至靶向肿瘤相关抗原的抗体的c-末端的干扰素的嵌合构建体。然而，这种嵌合构建体表达的融合蛋白在体内通常是非常不稳定的，并且其表达产量通常不足够高至用于工业规模生产。

概述

因此，非常需要免疫调节剂的靶向表达，该免疫调节剂可在工业规模上以相对高的产量产生，并且在体内具有相对长的半衰期以用于治疗与细胞和/或组织过度增殖相关的病症或疾病，例如各种赘生物、不同类型的癌症和/或肿瘤。

本申请解决了这种需求并且也提供了相关的优势。本申请涉及可用于抑制肿瘤生长的蛋白质异二聚体，以及包含所述蛋白质异二聚体的组合物、药物和/或试剂盒。本申请还提供了用于生产蛋白质异二聚体的方法，以及蛋白质异二聚体在抑制肿瘤生长中的药物用途，包括但不限于癌症的治疗。

在一些方面，本申请的蛋白质异二聚体具有显著的抗肿瘤活性。在一些方面，本申请的蛋白质异二聚体具有高的表达产量。在一些方面，本申请的蛋白质异二聚体具有长的体内半衰期。在一些方面，本申请的蛋白质异二聚体特别适合于大规模工业化生产。

在一个方面，本申请提供了蛋白质异二聚体。在一些实施方案中，所述异二聚体的一个成员包含(i)轻链和(ii)重链，所述(i)轻链和(ii)重链复合以形成表现出对肿瘤抗原的结合特异性的靶向部分；并且，所述异二聚体的另一个成员包含多肽，该多肽从n末端到c末端包含与重链片段融合的免疫调节剂，其中所述重链片段与所述重链(ii)复合以形成所述异二聚体。

在一些实施方案中，所述靶向部分特异性结合肿瘤抗原，所述肿瘤抗原是膜蛋白。在一些实施方案中，所述靶向部分特异性结合肿瘤抗原，所述肿瘤抗原是细胞表面受体。例如，所述靶向部分可以特异性结合肿瘤抗原，所述肿瘤抗原是选自转化生长因子受体(tgfr)、表皮生长因子受体(egfr)、胰岛素样生长因子受体(igfr)、成纤维细胞生长因子受体(fgfr)、调蛋白受体、血小板衍生生长因子受体(pdgfr)、血管内皮生长因子受体(vegfr)和缺氧诱导因子受体(hifr)的细胞表面受体。

在一些实施方案中，所述靶向部分特异性结合肿瘤抗原，所述肿瘤抗原为生长因子、激素或细胞外基质分子。例如，所述靶向部分可以特异性结合肿瘤抗原，所述肿瘤抗原是选自下组的生长因子、激素或细胞外基质分子：转化生长因子(tgf)、表皮生长因子(egf)、胰岛素样生长因子(igf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、调蛋白、血小板衍生生长因子(pdgf)、血管内皮生长因子(vegf)、缺氧诱导因子(hif)、c-met、人绒毛膜促性腺激素、促性腺激素释放激素、雄激素、雌激素、促甲状腺激素、促卵泡激素、促黄体激素、催乳素、生长激素、促肾上腺皮质激素、抗利尿激素、催产素、促甲状腺素释放激素、生长激素释放激素、促肾上腺皮质激素释放激素、生长抑素、多巴胺、褪黑激素、甲状腺素、降钙素、甲状旁腺激素、糖皮质激素、盐皮质激素、肾上腺素、去甲肾上腺素、孕酮、胰岛素、胰高血糖素、胰岛淀粉样多肽、红细胞生成素、骨化三醇、钙化醇、心房钠尿肽、胃泌素、促胰液素、胆囊收缩素、神经肽y、胃饥饿素(ghrelin)、pyy3-36、瘦素、促血小板生成素、血管紧张肽原、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-19、il-20、il-21、il-22、il-23、il-24、il-25、il-26、il-27、il-28、il-29、il-30、il-31、il-32、il-33、il-34、il-35、il-36、胶原蛋白、弹性蛋白、双糖链蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、基膜聚糖、多功能蛋白聚糖、基底膜聚糖(perlecan)、c-反应蛋白、apoe和层粘连蛋白。

在一些实施方案中，所述靶向部分特异性结合选自以下组的肿瘤抗原：egfr突变体、her2/neu、her3、her4、cd4、cd19、cd20、cd22、cd29b、cd30、cd33、cd37、cd38、cd52、cd70、cd79b、cd123、cd138、cd200、cd276、cxcr3、cxcr5、ccr3、ccr4、ccr9、crth2、pmch、内质网素、cs1、cea、间皮素、g250、muc1、muc16、psma、adam17、epcam、epha2、mcsp、gpa33、napi2b、steap1、ceacam1、ceacam5、gpnmb和trop。例如，所述靶向部分可特异性结合egfr、egfr突变体或her2/neu。在一些实施方案中，所述靶向部分的所述(i)轻链包含互补决定区(cdr)，所述互补决定区包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的轻链的相应cdr中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述靶向部分的所述(i)轻链包含可变区，所述可变区包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的轻链可变区中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述靶向部分的所述(i)轻链包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的轻链中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述靶向部分的所述(ii)重链包含cdr，所述cdr包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的重链的相应cdr中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％，99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述靶向部分的所述(ii)重链包含可变区，所述可变区包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的重链的可变区中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述靶向部分的所述(ii)重链包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的重链中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，靶向部分的所述(i)轻链包含cdr，所述cdr包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的轻链的相应cdr中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；并且，所述靶向部分的(ii)重链包含cdr，所述cdr包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体重链的相应cdr中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述靶向部分的所述(i)轻链包含可变区，所述可变区包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的轻链的可变区中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；并且，所述靶向部分的所述(ii)重链包含可变区，所述可变区包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的重链的可变区中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述靶向部分的所述(i)轻链包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的轻链中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；并且所述靶向部分的所述(ii)重链包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的重链中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性针对肿瘤抗原的抗体选自以下组：抗-her2/neu、抗-her3、抗-her4、抗-cd4、抗-cd19、抗-cd20、抗-cd22、抗-cd29b、抗-cd30、抗-cd33、抗-cd37、抗-cd38、抗-cd52、抗-cd70、抗-cd79b、抗-cd123、抗-cd138、抗-cd200、抗-cd276、抗-cxcr3、抗-cxcr5、抗-ccr3、抗-ccr4、抗-ccr9、抗-crth2、抗-pmch、抗-内质网素抗体、抗-vegfr、抗-pdgfr、抗-cs1、抗-cea、抗-间皮素、抗-g250、抗-muc1、抗-muc16、抗-psma、抗-adam17、抗-epcam、抗-epha2、抗-mcsp、抗-gpa33、抗-napi2b、抗-steap1、抗-ceacam1、抗-ceacam5、抗-gpnmb、抗-trop、抗-tfgr、抗-egfr、抗-igfr、抗-fgfr、抗-hifr、抗-调蛋白受体、抗-vegf、抗-c-met、抗-tgf、抗-egf、抗-igf、抗-fgf、抗-调蛋白、抗-pdgf、抗-hif、抗-人绒毛膜促性腺激素、抗-促性腺激素释放激素、抗-雄激素、抗-雌激素、抗-促甲状腺激素、抗-促卵泡激素、抗-促黄体激素、抗-催乳素、抗-生长激素、抗-促肾上腺皮质激素、抗-抗利尿激素、抗-催产素、抗-促甲状腺素释放激素、抗-生长激素释放激素、抗-促肾上腺皮质激素释放激素、抗-生长抑素、抗-多巴胺、抗-褪黑激素、抗-甲状腺素、抗-降钙素、抗-甲状旁腺激素、抗-糖皮质激素、抗-盐皮质激素、抗-肾上腺素、抗-去甲肾上腺素、抗-孕酮、抗-胰岛素、抗-胰高血糖素、抗-胰岛淀粉样多肽、抗-红细胞生成素、抗-骨化三醇、抗-钙化醇、抗-心房钠肽、抗-胃泌素、抗-胰泌素、抗-胆囊收缩素、抗-神经肽y、抗-胃饥饿素、抗-pyy3-36、抗-瘦素、抗-促血小板生成素、抗-血管紧张肽原、抗-il-1、抗-il-2、抗-il-3、抗-il-4、抗-il-5、抗-il-6、抗-il-7、抗-il-8、抗-il-9、抗-il-10、抗-il-11、抗-il-12、抗-il-13、抗-il-14、抗-il-15、抗-il-16、抗-il-17、抗-il-18、抗-il-19、抗-il-20、抗-il-21、抗-il-22、抗-il-23、抗-il-24、抗-il-25、抗-il-26、抗-il-27、抗-il-28、抗-il-29、抗-il-30、抗-il-31、抗-il-32、抗-il-33、抗-il-34、抗-il-35、抗-il-36、抗-胶原蛋白、抗-弹性蛋白、抗-双糖链蛋白聚糖、抗-核心蛋白聚糖、抗-基膜聚糖、抗-多功能蛋白聚糖、抗-基底膜聚糖、抗-c-反应蛋白、抗-apoe和抗-层粘连蛋白。

例如，特异性针对肿瘤抗原的抗体可选自抗egfr、抗egfr突变体和抗-her2。

在一些实施方案中，包含在蛋白质异二聚体中的免疫调节剂增强免疫应答。在一些实施方案中，包含在蛋白质异二聚体中的免疫调节剂降低免疫应答。例如，所述免疫调节剂可以是细胞因子。在一些实施方案中，所述免疫调节剂是选自干扰素、白细胞介素、趋化因子、淋巴因子和肿瘤坏死因子的细胞因子。例如，所述免疫调节剂可以是干扰素α、干扰素λ或干扰素β。在一些实施方案中，所述免疫调节剂选自白细胞介素10、白细胞介素2和超白细胞介素2。

在一些实施方案中，当在哺乳动物宿主细胞中表达时，本申请的蛋白质异二聚体表现出为相应对照蛋白质的表达产量的至少3倍(例如，至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍或更多)更高的表达产量，其中所述对照蛋白包含两个成员的二聚体，每个成员包含形成特异性结合肿瘤抗原的靶向部分的轻链和重链，其中每个成员的重链还在c-末端包含免疫调节剂。例如，所述哺乳动物宿主细胞可以是hek293细胞。

在一些实施方案中，当在小鼠中表达时，本申请的蛋白质异二聚体表现出为相应的对照蛋白质的体内半衰期至少2倍(例如，至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍或更多)更长的体内半衰期，其中所述对照蛋白质包含两个成员的二聚体，每个成员包含形成特异性结合肿瘤抗原的靶向部分的轻链和重链，其中每个成员的重链还在c末端包含免疫调节剂。在一些实施方案中，所述蛋白质异二聚体的重链(ii)和所述重链片段各自包含介导一个成员与另一个成员的异源二聚化以形成所述异二聚体的二聚化序列。所述二聚化序列可以是异二聚化序列。在一些实施方案中，所述异二聚化序列包含一个或多个残基以通过共价键实现异源二聚化。在一些实施方案中，所述二聚化序列包含重链的fc区。例如，所述二聚化序列可包含选自igg1、igg2、igg3和igg4的免疫球蛋白的恒定区。

在一些实施方案中，异二聚化通过包含在所述重链(ii)和所述重链片段中的二聚化或异二聚化序列的非共价成对亲和力实现。

在一些实施方案中，所述重链片段与所述免疫调节剂在框内融合。例如，所述重链片段可通过接头与所述免疫调节剂在框内融合。

在一些实施方案中，所述另一个成员包含2个或更多个免疫调节剂，所述2个或更多个免疫调节剂彼此之间以及与所述重链片段框内融合。例如，所述另一个成员可以包含2个或更多个相同类型的免疫调节剂。在一些实施方案中，所述另一个成员包含2个或更多个不同类型的免疫调节剂。

在一个方面，本申请提供了编码本申请所述的蛋白质异二聚体的分离的多核苷酸。

在一个方面，本申请提供了包含本申请公开的分离的多核苷酸的载体。

在一个方面，本申请提供了包含本申请公开的分离的多核苷酸或载体的分离的宿主细胞。

在一个方面，本申请提供了包含药学上可接受的赋形剂和本申请公开的分离的蛋白质异二聚体的药物组合物。所述药物组合物可被配制用于口服施用、静脉内施用、肌内施用、在肿瘤部位的原位施用、吸入、直肠施用、阴道施用、经皮施用或通过皮下储库施用。

在一个方面，本申请提供了所述蛋白质异二聚体在制备用于抑制肿瘤或肿瘤细胞生长的药物和/或试剂盒中的用途。

在进一步的方面，本申请提供了抑制肿瘤或肿瘤细胞生长的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使肿瘤或肿瘤细胞与有效量的本申请公开的蛋白质异二聚体接触。在一些实施方案中，所述接触在体外发生。在一些实施方案中，所述接触在体内发生。

在一个方面，本申请提供了产生蛋白质异二聚体的方法，包括(i)在实现所述异二聚体表达的条件下培养本申请的宿主细胞，和(ii)收获所述表达的异二聚体。

根据以下详细描述，本申请的另外的方面和有利方面对于本领域技术人员将变得显而易见，其中仅显示和描述了本申请的说明性实施方案。如将认识到的，本申请能够具有其他和不同的实施例，并且其若干细节能够在各种显而易见的方面进行修改，而不脱离本申请所公开的内容。因此，附图和描述被认为是说明性质的，而不是限制性的。

通过引用并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指明通过引用并入。

附图说明

在所附权利要求中具体阐述了本申请的新颖的特征。将通过参考以下详细描述及其附图来获得对本申请的特征和有利方面的更好理解，所述详细描述阐述了说明性实施例，这些实施例利用了本申请的原理：

图1说明异二聚体erb-muifnb和对照c末端融合蛋白erbhc-muifnb的表达产量。

图2说明异二聚体erb-huifnb的药代动力学分析的结果。

图3说明异二聚体erb-huifnl的药代动力学分析的结果。

图4说明异二聚体erb-muifnb、erb-huifnb和erb-huifnl对egfr的特异性靶标结合亲和力。

图5说明异二聚体erb-muifnb(a)、erb-huifnl(b)和erb-huifna2(c)的抗病毒活性。

图6说明异二聚体erb-muifnb和erb-huifnl的体内抗肿瘤活性。

图7说明异二聚体erb-muifna4的体内抗肿瘤活性。

图8说明异二聚体tmab-huifna2针对mcf-7细胞系的体外抗肿瘤活性。

图9说明异二聚体erb-huifnb针对a431细胞系的体外抗肿瘤活性。

图10说明用于纯化erb-huil10和erb-(huil10)2异二聚体的sdspage测定结果。泳道1：erb-huil10(原始样品)；泳道2：erb-huil10(流过)；泳道3：erb-huil10(洗脱)；泳道4：蛋白质分子标记；泳道5：erb-(huil10)2(洗脱的)；泳道6：erb-(huil10)2(原始的)；泳道7：erb-(huil10)2(流过)；泳道8：标准；泳道9：对照；泳道10：空白；泳道11：erb-huil10(洗脱的，非还原性)；泳道12：erb-(huil10)2(洗脱的，非还原性)。

图11说明异二聚体erb-huil10和erb-(huil10)2的药代动力学分析的结果。

图12说明分别使用a431细胞系(a)和b16细胞系(b)的异二聚体erb-huil10和erb-(huil10)2与egfr的特异性靶标结合亲和力。

图13说明elisa测定中异二聚体erb-(huil10)2与egfr的特异性靶标结合亲和力。

图14说明异二聚体mab806-(huil10)2与egfr的特异性靶标结合亲和力。

图15说明分别使用mcf-7细胞系(a)和sk-br-3的细胞系时，异二聚体tmab-(huil10)2和tmab-huifna2与her2的特异性靶标结合亲和力。

图16说明使用sk-br-3细胞系时，异二聚体pmab-(huil10)2与her2的特异性靶标结合亲和力。

图17说明erb-huil10在抑制脂多糖(lps)刺激的人外周血单核细胞(pbmc)释放tnf-α中的活性。

图18说明erb-(huil10)2在抑制脂多糖(lps)刺激的人外周血单核细胞(pbmc)释放tnf-α中的活性。

图19说明mab806-(huil10)2在抑制脂多糖(lps)刺激的人外周血单核细胞(pbmc)释放tnf-α中的活性。

图20说明tmab-(huil10)2在抑制脂多糖(lps)刺激的人外周血单核细胞(pbmc)释放tnf-α中的活性。

图21说明pmab-(huil10)2在抑制脂多糖(lps)刺激的人外周血单核细胞(pbmc)释放tnf-α的活性。

图22说明腹膜内注射不同浓度的erb-muifna4后体内肿瘤生长的抑制。

图23说明腹膜内注射不同浓度的erb-(huil10)2后体内肿瘤生长的抑制。

图24说明肿瘤内注射不同浓度的erb-(huil10)2后肿瘤生长的剂量依赖性抑制。

图25说明通过erb-muifna4和erb-(huil10)2的腹膜内注射产生的体内肿瘤生长抑制情况的比较。

图26说明由不同剂量的erb-muifna4和erb-(huil10)2产生的体内肿瘤体消退的比较。

图27说明抗cd4、抗cd8和抗nk1.1对由erb-(huil10)2产生的体内肿瘤生长抑制的作用。

图28说明当静脉内注射时异二聚体erb-(huil10)2的药代动力学分析的结果。

图29说明食蟹猴中异二聚体erb-huifna2的药代动力学分析的结果。

图30说明erb-(huil10)2在小鼠中的体内分布。

图31说明在c57bl/6b16-egfr小鼠模型中erb-(huil10)2和tmab-(huil10)2之间的体内抗肿瘤作用的比较。

具体实施方案

在描述本申请的实施方案之前，应当理解，此类实施方案仅以示例的方式提供，并且在实践本申请时可采用本文描述的本申请公开的实施例的各种替代。在不脱离本申请的情况下，本领域技术人员将想到许多变化、改变和替换。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本申请的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。在矛盾的情况下，以专利说明书，包括定义，为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。在不脱离本申请的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替换。

除非上下文另外明确指出，否则本文所使用的单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”通常包括复数所指物。

如本文中所用，术语“蛋白质的”通常是指具有多肽或蛋白质、与多肽或蛋白质相关、类似或为多肽或蛋白质的材料或分子。例如，本申请的蛋白质异二聚体可以是异二聚体蛋白质，或包含两个或更多个多肽的异二聚体。

如本文中所用，术语“异二聚体”通常是指由两个不同成员组成的分子(例如蛋白质分子)。异二聚体的两个成员可在结构、功能、活性和/或组成方面不同。例如，两种不同的成员可以包含在形成这些多肽的氨基酸残基的顺序、数目或种类上不同的多肽。异二聚体的两个不同成员中的每一个可以独立地包含一个、两个或更多个单元、多肽链或部分。

如本文中所用，术语“靶向部分”通常是指与靶分子、细胞、颗粒、组织或聚集体特异性、选择性或优先结合的分子、复合物或聚集体。例如，靶向部分可以是抗体、抗原结合性抗体片段、双特异性抗体或其他基于抗体的分子或化合物。靶向部分的其他实例可以包括但不限于适体、高亲和性多聚体(avimers)、受体结合性配体、核酸、生物素-亲和素结合对、结合肽或蛋白质等。术语“靶向部分”和“结合部分”在本文中可互换使用。

如本文中所用，术语“肿瘤抗原”通常是指在肿瘤细胞中或由肿瘤细胞产生的抗原物质，其可具有在宿主中触发免疫应答的能力。例如，肿瘤抗原可以是构成肿瘤细胞的一部分并且能够诱导肿瘤特异性细胞毒性t淋巴细胞的蛋白质、多肽、肽或其片段。肿瘤抗原肽可以是作为肿瘤细胞中肿瘤抗原降解的结果而产生的肽，并且可通过与hla分子结合而在细胞表面上表达时诱导或活化肿瘤特异性细胞毒性的t淋巴细胞。在一些实施方案中，术语“肿瘤抗原”还可指在癌细胞上唯一地或优先地或差异地表达和/或经发现与癌细胞相关从而提供对癌症是优先的或特异性的靶标的生物分子(例如蛋白质、碳水化合物、糖蛋白等)。例如，优先表达可以是相较于生物体中的任何其他细胞的优先表达，或者在生物体的特定区域内(例如在特定器官或组织内)的优先表达。

术语“肿瘤抗原表位”和“肿瘤抗原决定簇”在本文中可互换使用，并且通常是指存在于肿瘤抗原中的诱导肿瘤特异性细胞毒性t淋巴细胞的氨基酸序列的位点。

术语“免疫调节剂”和“免疫调控剂”在本文中可互换使用，并且通常指影响免疫系统功能的物质。免疫调节剂可以增强或减小免疫应答。例如，免疫调节剂可以是免疫疗法的活性剂，包括但不限于例如细胞因子、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、干扰素、咪喹莫特、来自细菌的细胞膜片段、趋化因子、白细胞介素、胞嘧啶磷酸-鸟苷(cpg)寡脱氧核苷酸和葡聚糖的重组、合成和/天然制剂。在一些实例中，所述免疫调节剂是细胞因子。

在一些实施方案中，所述免疫调节剂是选自干扰素、白细胞介素、趋化因子、淋巴因子和肿瘤坏死因子。例如，免疫调节剂可选自干扰素α、干扰素β、干扰素β、白细胞介素10、白细胞介素2和超白细胞介素2。

如本文中所用，术语“膜蛋白”通常是指与生物膜相互作用的蛋白质。膜蛋白可以是附着至细胞或细胞器的膜或与其结合的蛋白。例如，膜蛋白可以是膜内在蛋白、外周膜蛋白或膜结合肽。在一些实施方案中，膜蛋白是细胞表面受体。

如本文中所用，术语“细胞表面受体”通常是指结合生物活性分子(例如，配体)并介导配体对细胞的作用的细胞表面蛋白。细胞表面受体可以是具有多结构域结构的膜结合蛋白，其包含细胞外配体结合结构域和通常参与信号转导的细胞内效应结构域。配体与受体的结合可导致受体的构象变化，这导致效应结构域与细胞中的其它分子之间的相互作用。该相互作用又可导致细胞代谢的改变。与受体-配体相互作用相关的代谢事件可包括基因转录、磷酸化、去磷酸化、环腺苷酸产量的增加、细胞钙的动员、膜脂质的动员、细胞粘附、肌醇脂质的水解和磷脂的水解。

如本文中在蛋白质异二聚体的上下文中使用的术语“表达产量”通常是指当表达时，例如当由宿主细胞表达时，以功能形式表达产生的蛋白质异二聚体的量。

如本文中所用，术语“二聚化序列”通常是指能够形成二聚体或经历二聚化的氨基酸序列。二聚体可以是由两个相同成员形成的同源二聚体。二聚体可以是由两个不同成员形成的异二聚体。在一些情况下，异二聚体的两个不同成员可以包含相同的二聚化序列。

如本文中所用，术语“异源二聚化序列”通常是指优先导致异二聚体形成或经历异源二聚化的氨基酸序列。

如本文中所用，术语“共价键”通常是指通过共享电子在原子之间形成的化学键。例如，共价键可以是极性或非极性的。在一些实施方案中，共价键是二硫键。

如本文中所用，术语“非共价成对亲和力”通常是指能够通过非共价相互作用(例如经由离子对、氢键、偶极-偶极相互作用、电荷转移相互作用、π-π相互作用、阳离子-π-电子相互作用、范德华相互作用和分散相互作用、疏水(亲脂)相互作用、复合物形成(例如，过渡金属阳离子的复合物形成)或这些相互作用的组合)彼此结合的二聚化序列或异源二聚化序列。

如本文中所用，术语“接头”通常是指连接或联接两个多肽序列(例如联接两个多肽结构域)的合成氨基酸序列。接头可以通过肽键连接两个氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的接头将生物活性部分连接至线性序列中的第二部分。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以是线性的或枝状的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可被非氨基酸中断。该术语还包括已经例如通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作(诸如与标记组分的缀合)修饰的氨基酸聚合物。该术语可应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。该术语还可包括有关连接构成多肽的氨基酸的常规肽键的变体。例如，“肽”、“多肽”和“蛋白质”可以是α碳通过肽键连接的氨基酸链。因此，链的一个末端(氨基末端)上的末端氨基酸可具有游离氨基，而链的另一个末端(羧基末端)上的末端氨基酸可具有游离羧基。如本文所用，术语“氨基末端”(缩写为n-末端)通常是指肽的氨基末端上的氨基酸上的游离α-氨基或肽内任何其它位置上的氨基酸的α-氨基(当参与肽键时为亚胺基)。类似地，术语“羧基末端”通常是指肽的羧基末端上的游离羧基或肽内任何其它位置上的氨基酸的羧基。肽还可包括基本上任何聚氨基酸，包括但不限于肽模拟物，诸如通过醚而不是酰胺键连接的氨基酸。

如本文中所用，术语“氨基酸”通常是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括但不限于d或l光学异构体或两者、氨基酸类似物和模拟肽。将标准的单字母或三字母代码用于指定氨基酸。

如本文中所用，术语“天然l-氨基酸”通常是指甘氨酸(g)、脯氨酸(p)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、甲硫氨酸(m)、半胱氨酸(c)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)、组氨酸(h)、赖氨酸(k)、精氨酸(r)、谷氨酰胺(q)、天冬酰胺(n)、谷氨酸(e)、天冬氨酸(d)、丝氨酸(s)和苏氨酸(t)的l-旋光异构体形式。

如本文中所用，术语“非天然存在的”通常是指不具有野生型或天然存在的序列(例如，在受试者中发现的序列)的对应物，不与野生型或天然存在的序列互补或不具有与野生型或天然存在的序列的高度同源性的多肽或多核苷酸序列。例如，在适当地对齐时，相较于天然存在的多肽或片段，非天然存在的多肽或片段可具有小于99％、98％、95％、90％、80％、70％、60％、50％或更少的氨基酸序列同一性。或者，在适当地对齐时，相较于天然序列，非天然存在的多肽或片段可共有超过99％、98％、95％、90％、80％、70％、60％、50％或甚至更多的氨基酸序列同一性。

如本文中所用，术语“亲水的”和“疏水的”通常是指物质所具有的与水的亲和力的程度。亲水物质具有对水的强亲和力，倾向于溶解于水中，与水混合或被水润湿，而疏水物质基本上不具有对水的亲和性，倾向于排斥水，以及不吸收水，倾向于不溶于水或与水混合或被水润湿。氨基酸可基于其疏水性来表征。已经开发了许多量表。例如由levitt,m等，jmolbiol(1976)104:59开发的量表，其列于hopp,tp等，procnatlacadsciusa(1981)78:3824中。“亲水氨基酸”的实例是精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。特别感兴趣的是亲水氨基酸天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸，以及甘氨酸。“疏水氨基酸”的实例是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸，亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。

当在蛋白质分子(例如，多肽或蛋白质)的上下文中使用时，术语“片段”通常是指天然生物活性蛋白的截短形式，其可以保留或可以不保留一部分治疗和/或生物活性。

当在蛋白质分子(例如，多肽或蛋白质)的上下文中使用时，术语“变体”通常是指与天然生物活性蛋白质具有序列同源性的蛋白质性分子，其保留至少一部分生物活性蛋白的治疗和/或生物活性。例如，变体蛋白质相较于参照生物活性蛋白可共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，“变体”可以包括经有意地修饰(例如通过定点诱变、编码基因的合成、插入或偶然通过突变)的蛋白质。

术语“缀合的”、“连接的”、“融合的”和“融合”在本文中可互换使用，并且通常是指将两个或更多个化学元素、序列或组分连接在一起，例如通过包括化学缀合或重组手段。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指被连接的dna序列是连续的，并且处于阅读相或框内。“框内融合”是指以保持原始orf的正确阅读框的方式将两个或更多个开放阅读框(orf)连接以形成连续的更长orf。因此，所得的“融合多肽”是包含两个或更多个相应于由原始orf编码的多肽的片段的单一蛋白质(所述片段通常在自然界中不是这样连接的)。“融合位点”是指两个或更多个片段在其处连接在一起的序列。在一些情况下，融合位点可以是与所连接的两个或更多个片段中的序列相同的序列。在一些情况下，融合位点还可包含与所连接的两个或更多个片段的任一序列均不相同的间隙(gap)区段。

在多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”是多肽中按照氨基至羧基末端方向的氨基酸顺序，其中序列中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。“部分序列”是形成已知在一个或两个方向上包含额外残基的多肽的部分的线性序列。

术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用，它们通常是指具有任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区，从连锁分析定义的多个基因座(locus)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转运rna、核糖体rna、核酶、cdna、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的dna、任何序列的分离的rna、核酸探针和引物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可在聚合物组装之前或之后赋予核苷酸结构以修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。可在聚合后进一步修饰(诸如通过与标记组分的缀合)多核苷酸。

术语“基因”和“基因片段”在本文中可互换使用，并且通常是指含有至少一个开放阅读框的多核苷酸，所述阅读框在转录和翻译后能够编码特定蛋白质。基因或基因片段可以是基因组dna或cdna，只要所述多核苷酸含有至少一个可覆盖整个编码区或其区段的开放阅读框。“融合基因”是由至少两个连接在一起的异源多核苷酸组成的基因。

如本文中所用，术语“抗体”通常是指包含一个或多个基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽的蛋白质。免疫球蛋白基因可以包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。如本文所用，轻链可被分类为κ或λ。重链可被分类为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义免疫球蛋白类别：igg、igm、iga、igd和ige。本申请中使用的抗体可具有包含四聚体的结构单元。每个四聚体可由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kd)和一条“重链”(约50-70kd)。每个成员的n末端可以界定约100至110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。如本文中所用，术语轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)通常分别指轻链和重链的这些区域。抗体可作为完整免疫球蛋白存在或作为通过用各种肽酶消化或从头表达产生的许多充分表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶可以消化铰链区中二硫键以下的抗体以产生f(ab)'2(fab的二聚体，所述fab本身是通过二硫键连接至vh-ch1的轻链)。f(ab')2可在温和条件下被还原以断裂铰链区中的二硫键，从而将(fab')2二聚体转化为fab'单体。fab'单体基本上是具有铰链区的部分的fab(关于其它抗体片段的更详细描述，参见fundamentalimmunology，w.e.paul编辑，ravenpress,n.y.(1993))。虽然根据完整抗体的消化来定义各种抗体片段，但是本领域普通技术人员将理解，可以化学地或通过利用重组dna方法从头合成这样的fab'片段。因此，如本文中所用，术语抗体还可包括通过修饰整个抗体或使用重组dna方法从头合成产生的抗体片段，包括但不限于fab'2、igg、igm、iga、ige、scfv、dab、纳米抗体、单抗体和双链抗体。在一些实施方案中，抗体包括但不限于fab'2、igg、igm、iga、ige和单链抗体，例如单链fv(scfv)抗体，其中可变重链和可变轻链(直接地或通过肽接头)连接在一起以形成连续的多肽。

在一些实施方案中，本申请中的抗体和片段是双特异性的。在一些实施方案中，双特异性抗体或其片段对至少两个不同表位(例如，至少两个不同表位中的至少一个是肿瘤相关抗原)具有结合特异性。在一些实施方案中，抗体和片段也可以是异种抗体，例如它们可以是或可以包含两个或更多个连接在一起的抗体或抗体结合片段(例如fab)，其中每个抗体或片段具有不同的特异性。

在一些实施方案中，本文中使用的抗体及其片段可以是双特异性的。双特异性抗体或其片段可具有多种构型。例如，双特异性抗体可类似于单个抗体(或抗体片段)，但具有两个不同的抗原结合位点(可变区)。在各种实施方案中，双特异性抗体可通过化学技术(kranz等(1981)proc.natl.acad.sci.,usa,78:5807)，通过“多巢(polydoma)”(参见例如美国专利号4,474,893)技术，或通过重组dna技术产生。在一些实施方案中，本文使用的双特异性抗体可对至少两种不同的表位具有结合特异性，并且其中至少一种所述表位是肿瘤抗原。在一些实施方案中，抗体及其片段也可以是异种抗体。异种抗体是连接在一起的两个或更多个抗体或抗体结合片段(例如fab)，每个抗体或片段具有不同的特异性。

如本文中所用，术语“同源性”、“同源的”或“序列同一性”通常是指两个或多个多核苷酸序列之间或两个或多个多肽序列之间的序列相似性或可交换性。当使用程序(例如embossneedle或bestfit)来测定两个不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时，可以使用默认设置，或者可以选择合适的评分矩阵(诸如blosum45或blosum80)来最优化同一性、相似性或同源性得分。在一些实施方案中，同源的多核苷酸是在严格条件下杂交的那些序列，并且相较于那些序列具有至少60％，至少65％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少97％，至少98％，至少99％，甚至100％的序列同一性。当最佳地对准具有相当长度的序列时，同源的多肽具有至少80％，或至少90％，或至少95％，或至少97％，或至少98％的序列同一性，或具有至少99％的序列同一性。

如在多核苷酸序列的上下文中所用，术语“百分比同一性”和“％同一性”通常是指使用标准化算法对对准的至少两个多核苷酸序列之间的残基匹配的百分比。这样的算法可以以标准化和可再现的方式在待比较的序列中插入空位，从而最优化两个序列之间的比对，并且因此实现两个序列的更有意义的比较。百分比同一性可以在整个限定的多核苷酸序列的长度上测量，或者可以在更短的长度上测量，例如在从更大的限定的多核苷酸序列中取得的片段的长度上测量。应理解，由本文中、表、图或序列表中所示的序列支持的任何片段长度可用于描述可在其上测量百分比同一性的长度。

如在本文鉴定的多肽序列的上下文中所用，术语“百分比(％)序列同一性”通常是指查询序列中与第二参照多肽序列或其部分中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比；在对准序列和引入空位之后，如果必要的话，来获得最大百分比序列同一性，并且不考虑作为序列同一性的部分的任何保守取代。用于测定百分比氨基酸序列同一性的比对可以以在本领域技术人员的能力范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件诸如blast、blast-2、align、needle或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。可在整个限定的多肽序列的长度上测量，或者可以在更短的长度上测量，例如，在取自更大的限定的多肽序列的片段的长度上测量百分比同一性。应理解，由本文中、表、图或序列表中所示的序列支持的任何片段长度可用于描述可在其上测量百分比同一性的长度。

如本文所使用的术语“宿主细胞”通常包括可以是或已经是受试者质粒或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物，其包含本申请公开的多核苷酸，或表达本申请的蛋白质异二聚体(例如，异二聚体蛋白)。宿主细胞可以包括单个宿主细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态上或在基因组总dna互补体上)。宿主细胞可包括用本申请公开的载体在体外转染的细胞。宿主细胞可以是细菌细胞(例如大肠杆菌(e.coli))、酵母细胞或其它真核细胞，例如cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hela细胞或骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是hek293细胞。

如在本文中所用，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移至宿主细胞中和/或在宿主细胞之间转移。该术语可包括主要用于将dna或rna插入细胞的载体，主要用于dna或rna的复制的载体，以及用于dna或rna的转录和/或翻译的表达载体。还包括提供不止一种上述功能的载体。“表达载体”是当被引入合适的宿主细胞时可被转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常意味着合适的宿主细胞，其包含能够产生期望的表达产量的表达载体。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现预期应用(包括但不限于疾病治疗)的组合物(例如，本文所述的蛋白质异二聚体)的量。治疗有效量可根据预期的应用(例如，体外或体内)或所治疗的受试者和疾病状况，例如受试者的体重和年龄、疾病状况的严重性、施用方式等而变化，其可以容易地由本领域普通技术人员来确定。该术语还可应用于在靶细胞中诱导特定应答(例如，靶基因诱导、增殖和/或凋亡)的剂量。具体剂量将根据所选择的具体化合物、所遵循的给药方案、其是否与其它化合物组合施用、施用的时间安排、其所施用至的组织以及其所处的物理递送系统而变化。

术语“治疗”或“医治”或“缓解”或“改善”在本文中可互换使用，并且是指获得有益或所需的结果(包括但不限于治疗益处和/或预防益处)的方法。如本文中所用，治疗益处通常是指根除或减轻所治疗的潜在病症的严重性。此外，通过根除、减轻严重性或减少与潜在病症相关的一种或多种生理症状的发生率，以使得在受试者中观察到改善(尽管受试者仍然可能受到潜在病症折磨)来实现治疗益处。对于预防益处，可向处于发展特定疾病的风险中的受试者，或报告疾病的一种或多种生理症状的受试者施用组合物，即使可能尚未进行该疾病的诊断。

如本文中所用，术语“治疗作用”通常包括如上所述的治疗益处和/或预防益处。预防作用包括延迟或消除疾病或病况的出现，延迟或消除疾病或病况的症状的发作，减缓、停止或逆转疾病或病况的进展，或其任何组合。

如本文中所用，术语“共施用”、“与……组合施用”及其语法上等同物通常包括指向动物施用两种或更多种试剂，以使得试剂和/或其代谢物同时存在于受试者中。共施用包括在单独的组合物中同时施用，在单独的组合物中在不同时间施用，或在其中两种试剂均存在的组合物中施用。

术语“拮抗剂”和“抑制剂”在本文中可互换使用，并且它们通常是指通过抑制靶蛋白的活性或表达而具有抑制靶蛋白的生物学功能的能力的化合物。因此，在靶蛋白的生物学作用的上下文中定义术语“拮抗剂”和“抑制剂”。虽然本文优选的拮抗剂与靶特异性相互作用(例如，结合)，但是通过与靶蛋白是其成员的信号转导途径的其它成员相互作用来抑制靶蛋白的生物活性的化合物也特别包括在该定义内。拮抗剂抑制的优选生物活性与肿瘤的发展、生长或扩散相关。

如本文中所用，术语“激动剂”通常是指具有通过起始或增强靶蛋白的活性或表达而引发或增强靶蛋白的生物学功能的能力的化合物。因此，在靶多肽的生物学作用的上下文中定义术语“激动剂”。虽然本文中优选的激动剂与所述靶特异性相互作用(例如，结合)，但引发或增强靶多肽的生物活性的化合物也特别地包括在该定义内，该化合物与所述靶多肽是其成员的信号转导途径上的其它成员相互作用。

如本文中所用，术语“试剂”或“生物活性剂”通常是指生物部分、药物部分或化合物或其它部分。非限制性实例包括简单或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白质、寡核苷酸、抗体、抗体衍生物、抗体片段、维生素衍生物、碳水化合物、毒素或化疗化合物。可以合成各种化合物，例如小分子和寡聚物(例如，寡肽和寡核苷酸)和基于各种核心结构的合成有机化合物。另外，各种天然来源可提供用于筛选的化合物，诸如植物或动物提取物等。

如本文中所用，术语“抗癌剂”、“抗肿瘤剂”或“化学治疗剂”通常是指可用于治疗肿瘤病况的任何试剂。一类抗癌剂包括化疗剂。

如本文中所用，术语“化疗”通常是指通过各种方法向癌症患者施用一种或多种化疗药物和/或其它试剂，所述方法包括静脉内、口服、肌内、腹膜内、膀胱内、皮下、经皮、口腔或吸入或以栓剂的形式。

如本文中所用，术语“细胞增殖”通常是指细胞数目由于分裂而改变的现象。例如，细胞增殖可导致细胞数目的增加。该术语还包括细胞形态通过其已发生改变(例如，尺寸增加)的细胞生长，其与增殖信号一致。

如本文中所用，术语“体内”通常是指在受试者体内发生的事件。

如本文中所用，术语“体外”通常是指发生在受试者体外的事件。例如，体外测定包括在受试者外进行的任何测定。体外测定包括其中使用死细胞或活细胞的基于细胞的测定。体外测定还包括其中不使用完整细胞的无细胞测定。

如本文中所用，术语“干扰素”(ifn)通常是指响应于病原体(诸如，病毒、细菌、寄生虫或肿瘤细胞)的存在由宿主细胞产生和释放的信号蛋白。有三种主要类型的干扰素(即i型、ii型和iii型)，其中i型干扰素可包括ifn-α和ifn-β，ifn-α还可包含ifn-α亚型，例如ifn-α2、ifn-α4等。i型干扰素可抑制病毒复制，具有抗寄生虫活性，抑制细胞增殖，刺激免疫细胞的细胞毒性活性，参与免疫调节，并表现出抗肿瘤效果。ii型和iii型干扰素可包括ifn-γ、ifn-λ1(il-29)、ifn-λ2(il-28a)和ifn-λ3(il-28b)。如本文中所用，术语“干扰素”可包括全长干扰素或者其片段(例如，截短形式)或变体，所述其片段或变体基本上保持相应野生型干扰素的生物活性(例如，具有为相应的野生型干扰素的生物活性的至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或甚至至少100％)。如本文中所用，干扰素可来自任何哺乳动物物种。在一些实施方案中，干扰素来自选自人、马、牛、鼠、猪、兔、猫、狗、大鼠、山羊、绵羊和非人灵长类动物的物种。

如本文中所用，术语“白细胞介素”通常是指能够促进t和/或b淋巴细胞和/或造血细胞的发育和分化的分泌蛋白或信号分子。白细胞介素可由辅助cd4t淋巴细胞，以及通过单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞合成。如本文中所用，白细胞介素(il)可包括il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-19、il-20、il-21、il-22、il-23、il-24、il-25、il-26、il-27、il-28、il-29、il-30、il-31、il-32、il-33、il-34、il-35和/或il-36。如本文中所用，术语“白细胞介素”可包括全长白细胞介素或者其片段(例如，截短形式)或变体，所述其片段或变体基本上保持相应野生型白细胞介素的生物活性(例如，具有相应野生型白细胞介素的生物活性的至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或甚至至少100％)。如本文所使用的，白细胞介素可来自任何哺乳动物物种。在一些实施方案中，白细胞介素来自选自人、马、牛、鼠、猪、兔、猫、狗、大鼠、山羊、绵羊和非人灵长类动物的物种。在一些实施方案中，白细胞介素可呈突变形式(例如具有增加的或减小的对其受体的亲和力)。在具体实施方案中，白细胞介素可以是超il-2(也称为sil2，参见nature484,529-533，2012年4月26日)，其可通过修饰il-2以增加其对il-2rβ的结合亲和力来获得。sil-2中的突变主要在细胞因子的核心中，并且分子动力学模拟表明进化突变稳定il-2，将il-2rβ结合位点中的螺旋的柔性降低至与当与cd25结合时的构象相似的优化的受体结合构象。与il-2相比，sil-2诱导细胞毒性t细胞的优良扩增，导致改善的体内抗肿瘤反应，并引起t调节性细胞的成比例的较小扩增和减少肺水肿。

如本文中所用，术语“抗体”通常是指由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽组成的蛋白质。所识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及各种免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其分别依次定义免疫球蛋白类别为igg、igm、iga、igd和ige。

如本文中所用，术语“抗原结合位点”或“结合部分”通常是指参与抗原结合的抗体的一部分。抗原结合位点可以由重(“h”)链和/或轻(“l”)链的n-末端可变(“v”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的v区内的三个高度趋异的区段被称为“高变区”，其被插入在称为“框架区”或“fr”的更保守的侧翼区段之间。因此，如本文中所用，术语“fr”通常是指在免疫球蛋白中的高变区之间及其邻近天然发现的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中彼此相对地排列，以形成抗原结合“表面”。该表面可介导所述靶抗原的识别和结合。重链和轻链各自的所述三个高变区称为“互补决定区”或“cdr”并表征，例如由kabat等sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第4版u.s.dept.healthandhumanservices,publichealthservices,bethesda,md.(1987)。

如本文中所用，术语“抗-her2/neu抗体”通常是指特异性或优先结合her2/neu受体的抗体。例如，抗-her2/neu抗体或抗-her2抗体可以是曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或其抗原结合片段。

如本文中所用，术语“抗egfr抗体”通常是指特异性或优先结合egfr的抗体。在一些情况下，抗-egfr抗体可以结合egfr的突变形式(例如，egfr变异体iii(也称为egfrviii)，其是egfr的最常见的细胞外结构域突变，该突变导致egfr的外显子2-7的缺失，并使突变受体不能结合任何已知的配体)。例如，抗-egfr抗体可是西妥昔单抗、mab806或其抗原结合片段。

如本文中所用，术语“受试者”通常是指人或非人动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、牛、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠或猴。

如本文中所用，术语“抗egfr家族抗体”通常是指特异性结合表皮生长因子受体家族成员的抗体。例如，其可以是结合erbb-1(也称为表皮生长因子受体(egfr))、erbb-2(在人中也称为her2，在啮齿类动物中称为neu)、erbb-3作为her3)和/或erbb-4(也称为her4)。抗egfr家族抗体的实例包括但不限于以下抗体中的一种或多种：c6.5、c6ml3-9、c6mh3-b1、c6-b1d2、f5、her3.a5、her3.f4、her3.h1、her3.h3、her3.e12、her3.b12、egfr.e12、egfr.c10、egfr.b11、egfr.e8、her4.b4、her4.g4、her4.f4、her4.a8、her4.b6、her4.d4、her4.d7、her4.d11、her4.d12、her4.e3、her4.e7、her4.f8和her4.c7等，也参见，例如，美国专利公开文本us2006/0099205a1和us2004/0071696a1，所述专利公开通过引用并入本文。

如本文中所用，术语“单链fv”(“sfv”或“scfv”)多肽通常是指共价连接的vh(重链可变区):vl(轻链可变区)异二聚体，其可以可从包含直接连接或通过肽编码接头连接的vh-和vl-编码序列的核酸表达。(参见huston等proc.nat.acad.sci.usa,85:5879-5883(1988))。

当与癌细胞一起使用时，术语“抑制生长和/或增殖”通常是指癌细胞的生长速率和/或增殖速率的降低。例如，这可包括癌细胞的死亡(例如通过凋亡)。在一些实施方案中，该术语还可指抑制实体瘤的生长和/或增殖和/或诱导肿瘤的尺寸减小或消除。

如本文中所用，术语“癌细胞表面标志物”或“癌细胞相关标志物”通常是指排他地或优先地或差异地在细胞表面表达，和/或被发现与癌细胞相关，从而提供对于癌症是优先或特异性的靶标的生物分子，诸如蛋白质、碳水化合物、糖蛋白等。在一些实施方案中，优选表达可以是与生物体中的任何其他细胞相比的优先表达，或在生物体的特定区域内(例如在特定器官或组织内)的优先表达。

如本文中所用，术语“cd20”通常是指在成熟b细胞表面上表达的非糖基化磷蛋白(参见，例如，cragg等(2005)curr.dir.autoimmun.,8:140-174)。其还可以在b细胞淋巴瘤、多毛细胞白血病、皮肤/黑素瘤癌干细胞的b细胞慢性淋巴细胞白血病等中被发现。

蛋白质异二聚体、分离的多核苷酸、载体和宿主细胞

在一个方面，本申请提供了蛋白质异二聚体。异二聚体的一个成员可包含复合以形成对肿瘤抗原表现出结合特异性的靶向部分的(i)轻链和(ii)重链。异二聚体的另一个成员可包含从n末端到c末端包含与重链片段融合的免疫调节剂的多肽。所述重链片段可与所述重链(ii)复合以形成异二聚体。

在一些实施方案中，所述重链(ii)和所述重链片段各自包含介导一个成员和另一个成员的异源二聚化以形成异二聚体的二聚化序列。例如，所述重链(ii)和所述重链片段各自可包含能够形成二聚体或经历二聚化的氨基酸序列。这样的二聚体可通过两个相同的二聚化序列或通过两个不同的二聚化序列形成。

在一些实施方案中，所述二聚化序列是异二聚化序列，其中异二聚体通过两个不同二聚化序列的二聚化形成。在一些实施方案中，所述异二聚化序列包含经由共价键实现异源二聚化的一个或多个残基。

在一些实施方案中，所述二聚化序列包含重链(诸如抗体重链)的fc区。在一些实施方案中，每个二聚化序列独立地包含免疫球蛋白的恒定区(例如，来自选自igg1、igg2、igg3和igg4的免疫球蛋白)或其变体。在一些实施方案中，所述靶向部分的所述重链(ii)中的二聚化序列和所述重链片段中的二聚化序列各自包含相同亚型的免疫球蛋白的恒定区。例如，所述免疫球蛋白恒定区可包含如seqidno:45、seqidno:46、seqidno:47、seqidno:48所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与其共享超过50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或甚至更多氨基酸序列同一性。

在一些实施方案中，包含在所述重链片段中的二聚化序列可以是来自免疫球蛋白γ1(igg1)的恒定区的二聚化序列。在一些实施方案中，所述igg1是人igg1。在一些实施方案中，当与人igg1恒定区的氨基酸序列比较时，包含在重链片段中的二聚化序列在相应于人igg1恒定区的位置349、366、368和/或407的位置上包含点突变，诸如y349c、t366s、l368a和/或y407v。

在一些实施方案中，所述异二聚化通过包含在所述重链(ii)和所述重链片段中的二聚化或异二聚化序列的非共价成对亲和力来实现。

在一些实施方案中，将所述重链片段和免疫调节剂在框内融合。例如，可通过接头将所述重链片段与所述免疫调节剂框内融合。接头可以是例如通过肽键连接或联接两个多肽序列的合成氨基酸序列。在一些实施方案中，接头是包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸的肽。例如，接头可包含1-10个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸)、1-15个氨基酸(例如，1-11个、12个、13个、14个、15个氨基酸)、1-20个氨基酸、1-30个氨基酸或更多个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头包含如seqidno：27、seqidno：89、seqidno：90或seqidno：91中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述接头抗蛋白水解或大体上抗蛋白水解。

在一些实施方案中，蛋白质异二聚体的另一个成员包含彼此框内融合和与重链片段框内融合(例如，如在erb-(huil10)2、tmab-(huil10)2、mab806-(huil10)2或pmab-(huil10)2中)的两个或更多个(例如，2、3、4、5个或更多个)的免疫调节剂。例如，可通过接头将两个或更多个免疫调节剂彼此框内融合和/或与重链片段框内融合。所述接头可以是例如通过肽键连接或联接两个多肽序列的合成氨基酸序列。在一些实施方案中，接头是包含例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸的肽。两种或更多种免疫调节剂可以是相同类型或可以是不同类型。例如，两个或更多个免疫调节剂可以是两个或更多个il10，或者可以是一个或多个干扰素和一个或多个白细胞介素。在一些实施方案中，两个或更多个免疫调节剂中的一个或多个可选自在本申请中其它地方描述的任何免疫调节剂。

在一些实施方案中，所述靶向部分特异性结合作为膜蛋白的肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述靶向部分特异性结合作为细胞表面受体的肿瘤抗原。例如，所述细胞表面受体可选自转化生长因子受体(tgfr)、表皮生长因子受体(egfr)、胰岛素样生长因子受体(igfr)、成纤维细胞生长因子受体(fgfr)、调蛋白受体、血小板衍生生长因子受体(pdgfr)、血管内皮生长因子受体(vegfr)和缺氧诱导因子受体(hifr)。

在一些实施方案中，所述靶向部分特异性结合肿瘤抗原，所述肿瘤抗原是生长因子、激素或细胞外基质分子。例如，生长因子、激素或细胞外基质分子可选自转化生长因子(tgf)、表皮生长因子(egf)、胰岛素样生长因子(igf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、调蛋白、血小板衍生生长因子(pdgf)、血管内皮生长因子(vegf)、缺氧诱导因子(hif)、c-met、人绒毛膜促性腺激素、促性腺激素释放激素、雄激素、雌激素、促甲状腺激素、促卵泡激素、促黄体激素、催乳素、生长激素、促肾上腺皮质激素、抗利尿激素、催产素、促甲状腺素释放激素、生长激素释放激素、促肾上腺皮质激素释放激素、生长抑素、多巴胺、褪黑激素、甲状腺素、降钙素、甲状旁腺激素、糖皮质激素、盐皮质激素、肾上腺素、去甲肾上腺素、孕酮、胰岛素、胰高血糖素、胰岛淀粉样多肽、红细胞生成素、骨化三醇、钙化醇、心房钠尿肽、胃泌素、促胰液素、胆囊收缩素、神经肽y、胃饥饿素(ghrelin)、pyy3-36、瘦素、促血小板生成素、血管紧张肽原、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-19、il-20、il-21、il-22、il-23、il-24、il-25、il-26、il-27、il-28、il-29、il-30、il-31、il-32、il-33、il-34、il-35、il-36、胶原蛋白、弹性蛋白、双糖链蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、基膜聚糖、多功能蛋白聚糖、基底膜聚糖、c-反应蛋白、apoe和层粘连蛋白。

在一些实施方案中，所述靶向部分特异性结合选自下组的肿瘤抗原：egfr突变体(例如，egfr变体iii)、her2/neu、her3、her4、cd4、cd19、cd20、cd22、cd29b、cd30、cd33、cd37、cd38、cd52、cd70、cd79b、cd123、cd138、cd200、cd276、cxcr3、cxcr5、ccr3、ccr4、ccr9、crth2、pmch、内质蛋白、cs1、cea、间皮素、g250、muc1、muc16、psma、adam17、epcam、epha2、mcsp、gpa33、napi2b、steap1、ceacam1、ceacam5、gpnmb和trop。例如，靶向部分可以特异性结合egfr，egfr突变体(例如，egfr变体iii)或her2/neu。

在一些实施方案中，所述靶向部分的所述(i)轻链包含互补决定区(例如，cdr1、cdr2和/或cdr3)，所述互补决定区包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的轻链的相应cdr(例如，相应的cdr1、cdr2和/或cdr3)中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，同一性为至少80％，或至少90％。肿瘤抗原可以是本申请公开了中定义或列出的那些抗原中的任一种。在一些实施方案中，特异性针对肿瘤抗原的抗体是抗-egfr(例如，西妥昔单抗)、抗egfr突变体(例如，抗egfr变体iii，例如mab806)或抗-her2(例如，曲妥珠单抗或帕妥珠单抗)。例如，包含在特异性针对肿瘤抗原的抗体的轻链的cdr中的氨基酸序列可选自seqidno:31、seqidno:32、seqidno:33、seqidno:39、seqidno:40、seqidno:41、seqidno:64、seqidno:65、seqidno:66、seqidno:73、seqidno:74和seqidno:75。

在一些实施方案中，所述靶向部分的所述(i)轻链包含可变区，所述可变区包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的轻链可变区中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，同一性为至少80％，或至少90％。肿瘤抗原可以是本申请公开了中定义或列出的那些抗原的任一种。在一些实施方案中，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体选自抗egfr(例如，西妥昔单抗)、抗-egfr突变体(例如，抗egfr变体iii，例如mab806)或抗-her2(例如，曲妥珠单抗或帕妥珠单抗)。例如，特异性针对肿瘤抗原的抗体的轻链可变区中包含的氨基酸序列可选自seqidno:29、seqidno:37、seqidno:60和seqidno:71。

在一些实施方案中，所述靶向部分的所述(i)轻链包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的轻链中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，同一性为至少80％，或至少90％。所述肿瘤抗原可以是本申请中定义或列出的那些抗原中的任何一种。在一些实施方案中，特异性针对肿瘤抗原的抗体可以是抗-egfr(例如，西妥昔单抗)、抗-egfr突变体(例如，抗-egfr变体iii，例如mab806)或抗-her2(例如，曲妥单抗或帕妥珠单抗)。例如，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的轻链中包含的氨基酸序列可选自seqidno:11、seqidno:15、seqidno:57和seqidno:67。

在一些实施方案中，所述靶向部分的所述(ii)重链可包含cdr，所述cdr包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的重链的相应cdr中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，同一性为至少80％，或至少90％。肿瘤抗原可以是本申请中定义或列出的那些抗原中的任一种。在一些实施方案中，特异性针对肿瘤抗原的抗体是抗-egfr(例如，西妥昔单抗)、抗-egfr突变体(例如，抗-egfr变体iii，例如mab806)或抗-her2(例如，曲妥珠单抗或帕妥珠单抗)。例如，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的重链的cdr中包含的氨基酸序列可选自seqidno:34、seqidno:35、seqidno:36、seqidno:42、seqidno:43、seqidno:44、seqidno:61、seqidno:62、seqidno:63、seqidno:76、seqidno:77和seqidno:78。

在一些实施方案中，所述靶向部分的所述(ii)重链包含可变区，所述可变区包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的重链可变区中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，同一性为至少80％，或至少90％。肿瘤抗原可以是本申请中定义或列出的那些抗原中的任一种。在一些实施方案中，特异性针对肿瘤抗原的抗体是抗-egfr(例如，西妥昔单抗)、抗-egfr突变体(例如，抗-egfr变体iii，例如mab806)或抗-her2(例如，曲妥珠单抗或帕妥珠单抗)。例如，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的重链可变区中包含的氨基酸序列可选自seqidno:30、seqidno:38、seqidno:59和seqidno:72。

在一些实施方案中，所述靶向部分的所述(ii)重链包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的重链中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，同一性为至少80％，或至少90％。肿瘤抗原可以是本申请中定义或列出的那些抗原中的任一种。在一些实施方案中，特异性针对肿瘤抗原的抗体是抗-egfr(例如，西妥昔单抗)，抗-egfr突变体(例如，抗-egfr变体iii，例如mab806)或抗-her2(例如，曲妥珠单抗或帕妥珠单抗)。例如，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的重链中包含的氨基酸序列可选自seqidno:13、seqidno:17、seqidno:55和seqidno:69。

在一些实施方案中，所述靶向部分的所述(i)轻链包含cdr，所述cdr包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的轻链的相应cdr中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和靶向部分的所述(ii)重链包含cdr，所述cdr包含与特异性针对肿瘤抗原的相同抗体的重链的相应cdr中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，同一性为至少80％，或至少90％。所述肿瘤抗原可以是本申请中定义或列出的那些抗原中的任一种。在一些实施方案中，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体是抗-egfr(例如，西妥昔单抗)、抗-egfr突变体(例如，抗-egfr变体iii，例如mab806)或抗-her2(例如，曲妥珠单抗或帕妥珠单抗)。例如，特异性针对肿瘤抗原的抗体的轻链的cdr中包含的氨基酸序列可选自seqidno:31、seqidno:32和seqidno:33，并且特异性针对所述肿瘤抗原的相同抗体的重链的cdr中包含的氨基酸序列可以选自seqidno:34、seqidno:35和seqidno:36。在另一个实例中，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的轻链的cdr中包含的氨基酸序列可选自seqidno:39、seqidno:40和seqidno:41，并且特异性针对所述肿瘤抗原的相同抗体的重链的cdr中包含的氨基酸序列可选自seqidno:42、seqidno:43和seqidno:44。在另一个实例中，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的轻链的cdr中包含的氨基酸序列可选自seqidno:64、seqidno:65和seqidno:66，并且特异性针对所述肿瘤抗原的相同抗体的重链的cdr中包含的氨基酸序列可选自seqidno:61、seqidno:62和seqidno:63。在另一个实例中，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的轻链的cdr中包含的氨基酸序列可选自seqidno:73、seqidno:74和seqidno:75，并且特异性针对所述肿瘤抗原的相同抗体的重链的cdr中包含的氨基酸序列可选自seqidno:76、seqidno:77和seqidno:78。

在一些实施方案中，所述靶向部分的所述(i)轻链可包含可变区，所述可变区包含与特异性针对肿瘤抗原的抗体的轻链的可变区中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和所述靶向部分的所述(ii)重链包含可变区，所述可变区包含与特异性针对肿瘤抗原的相同抗体的重链的可变区中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，同一性为至少80％，或至少90％。所述肿瘤抗原可以是本申请中定义或列出的那些抗原中的任一种。在一些实施方案中，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体可以是抗-egfr(例如，西妥昔单抗)、抗-egfr突变体(例如，抗-egfr变体iii，例如mab806)或抗-her2(例如，曲妥单抗或帕妥珠单抗)。例如，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的轻链可变区中包含的氨基酸序列可以如seqidno：29所示的，并且特异性针对所述肿瘤抗原的相同抗体的重链的可变区中包含的氨基酸序列可以是如seqidno：30中所示的。在另一个实例中，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的轻链可变区中包含的氨基酸序列可以是如seqidno：37中所示的，并且特异性针对所述肿瘤抗原的相同抗体的重链可变区中包含的氨基酸序列可以如seqidno：38所示。在进一步地，例如，包含在特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的轻链可变区中的氨基酸序列可以如seqidno：60所示，并且特异性针对所述肿瘤抗原的相同抗体的重链可变区中包含的氨基酸序列可以是如seqidno：59所示的。在另一个实例中，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的轻链可变区中包含的氨基酸序列可以是如seqidno：71所示的，并且特异性针对所述肿瘤抗原的相同抗体的重链可变区中包含的氨基酸序列可以是如seqidno：72所示的。

在一些实施方案中，所述靶向部分的所述(i)轻链包含与特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的轻链中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和所述靶向部分的所述(ii)重链包含与特异性针对所述肿瘤抗原的相同抗体的重链中包含的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，同一性为至少80％，或至少90％。所述肿瘤抗原可以是本申请中定义或列出的那些抗原中的任一种。在一些实施方案中，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体是抗-egfr(例如，西妥昔单抗)、抗-egfr突变体(例如，抗-egfr变体iii，例如mab806)或抗-her2(例如，曲妥珠单抗或帕妥珠单抗)。例如，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的轻链中包含的氨基酸序列可以是如seqidno：11所示的，并且特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的重链中包含的氨基酸序列可以是如seqidno：13中所示的。在另一个实例中，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的轻链中包含的氨基酸序列可以是如seqidno：15所示的，并且特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的重链中包含的氨基酸序列可以是如seqidno：17所示的。在另一个实例中，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的轻链中包含的氨基酸序列可以是如seqidno：57所示的，并且特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的重链中包含的氨基酸序列可以是如seqidno：55所示的。在另一个实例中，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的轻链中包括的氨基酸序列可以是如seqidno：67所示的，并且特异性针对所述肿瘤抗原的抗体的重链中包含的氨基酸序列可以是如seqidno：69所示的。

在一些实施方案中，特异性针对所述肿瘤抗原的抗体是选自以下的抗体：抗-her2/neu、抗-her3、抗-her4、抗-cd4、抗-cd19、抗-cd20、抗-cd22、抗-cd29b、抗-cd30、抗-cd33、抗-cd37、抗-cd38、抗-cd52、抗-cd70、抗-cd79b、抗-cd123、抗-cd138、抗-cd200、抗-cd276、抗-cxcr3、抗-cxcr5、抗-ccr3、抗-ccr4、抗-ccr9、抗-crth2、抗-pmch、抗-内质网素抗体、抗-vegfr、抗-pdgfr、抗-cs1、抗-cea、抗-间皮素、抗-g250、抗-muc1、抗-muc16、抗-psma、抗-adam17、抗-epcam、抗-epha2、抗-mcsp、抗-gpa33、抗-napi2b、抗-steap1、抗-ceacam1、抗-ceacam5、抗-gpnmb、抗-trop、抗-tfgr、抗-egfr、抗-igfr、抗-fgfr、抗-hifr、抗-调蛋白受体、抗-vegf、抗-tgf、抗-egf、抗-igf、抗-fgf、抗调蛋白(anti-heregulin)、抗-pdgf、抗-hif、抗c-met、抗-人绒毛膜促性腺激素、抗-促性腺激素释放激素、抗-雄激素、抗-雌激素、抗-促甲状腺激素、抗-促卵泡激素、抗-促黄体生成激素、抗-催乳素、抗-生长激素、抗-促肾上腺皮质激素、抗-抗利尿激素、抗-催产素、抗-促甲状腺素释放激素、抗-生长激素释放激素、抗-促肾上腺皮质激素释放激素、抗-生长抑素、抗-多巴胺、抗-褪黑激素、抗-甲状腺素、抗-降钙素、抗-甲状旁腺激素、抗-糖皮质激素、抗-盐皮质激素、抗-肾上腺素、抗-去甲肾上腺素、抗-孕酮、抗-胰岛素、抗-胰高血糖素、抗-淀粉状蛋白毒素、抗-红细胞生成素、抗-骨化三醇、抗-钙化醇、抗-心房钠尿肽、抗-胃泌素、抗-胰泌素、抗-胆囊收缩素、抗-神经肽y、抗-胃饥饿素、抗pyy3-36、抗-瘦素、抗-促血小板生成素、抗-血管紧张肽原、抗-il-1、抗-il-2、抗-il-3、抗-il-4、抗-il-5、抗-il-6、抗-il-7、抗-il-8、抗-il-9、抗-il-10、抗-il-11、抗-il-12、抗-il-13、抗-il-14、抗-il-15、抗-il-16、抗-il-17、抗-il-18、抗-il-19、抗-il-20、抗-il-21、抗-il-22、抗-il-23、抗-il-24、抗-il-25、抗-il-26、抗-il-27、抗-il-28、抗-il-29、抗-il-30、抗-il-31、抗-il-32、抗-il-33、抗-il-34、抗-il-35、抗-il-36、抗-胶原蛋白、抗-弹性蛋白、抗-双糖蛋白聚糖、抗-核心蛋白聚糖、抗-基膜聚糖、抗-多功能蛋白聚糖、抗-基底膜聚糖、抗-c反应蛋白、抗-apoe和抗-层粘连蛋白。例如、特异性针对肿瘤抗原的抗体可以是抗-egfr、抗-egfr突变体(例如，抗-egfr变异体iii)或抗-her2。

在一些实施方案中，所述免疫调节剂增强免疫应答。能增强免疫应答的所述免疫调节剂的实例包括但不限于il-2、ifnα、ifnβ、ifnγ、ifnλ、肿瘤坏死因子(tnf)α、il-12和il-10。

在一些实施方案中，所述免疫调节剂减少免疫应答。能够减少免疫应答的所述免疫调节剂的非限制性实例包括il-10和转化生长因子(tgf)-β。

在一些实施方案中，所述免疫调节剂是细胞因子。例如，所述免疫调节剂可以是选自干扰素、白细胞介素、趋化因子、淋巴因子和肿瘤坏死因子的细胞因子。在一些实施方案中，免疫调节剂是干扰素α、干扰素λ或干扰素β。在一些实施方案中，免疫调节剂是白细胞介素10、白细胞介素2或超白细胞介素2。

在一些实施方案中，当在宿主细胞中表达时，本申请的蛋白质异二聚体表现出为相应的对照蛋白的表达产量的至少2倍更高的表达产量。例如，本申请的蛋白质异二聚体可表现出为相应的对照蛋白的表达产量的至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍或更多倍更高的表达产量。宿主细胞可以是植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或细菌细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是hek293细胞。对照蛋白可包含两个成员的二聚体，并且每个成员可包含形成特异性结合肿瘤抗原的靶向部分的轻链和重链。例如，肿瘤抗原可以与被蛋白质异二聚体中包含的靶向部分结合的抗原相同。在一些实施方案中，对照蛋白的每个成员的重链还在其c末端进一步包含免疫调节剂。例如，免疫调节剂可与蛋白质异二聚体中包含的免疫调节剂相同。

在一些实施方案中，当在受试者中表达或向其施用时，本申请的蛋白质异二聚体表现出为相应的对照蛋白的体内半衰期至少2倍的更长的体内半衰期。例如，当在受试者中表达或向其施用时，本申请的蛋白质异二聚体可以表现出为相应的对照蛋白的体内半衰期的至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍或更多倍更长的体内半衰期。受试者可以是哺乳动物，诸如啮齿类动物(例如，小鼠、兔或大鼠)、家畜(例如，猫、猪、狗、牛、马或绵羊)、自然界中的野生动物(例如，鹿、狐狸、狼或猞猁)或灵长类动物(例如，猴或人类)。对照蛋白可包含两个成员的二聚体，并且每个成员可包含形成特异性结合肿瘤抗原的靶向部分的轻链和重链。例如，肿瘤抗原可与被蛋白质异二聚体中包含的靶向部分结合的抗原相同。在一些实施方案中，每个成员的重链还在其c末端上包含免疫调节剂。例如，免疫调节剂可与蛋白质异二聚体中包含的免疫调节剂相同。

在一些实施方案中，本申请提供了异二聚体蛋白，其包含第一个成员(例如，多肽)和不同于所述第一个成员的第二个成员(例如，多肽)。所述第一个成员可包含能够结合肿瘤相关抗原、癌细胞表面标志物或癌细胞相关标志物的靶向部分。所述第二个成员可包含免疫球蛋白的fc区和干扰素、白细胞介素或任何其它的免疫调节剂。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白的fc区与干扰素、白细胞介素或所述任何其它免疫调节剂化学偶联。例如，它们可与接头偶联。所述接头可以是多肽接头，其可以包含数个至数十个氨基酸。例如，所述接头可包含1-10个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸)、1-15个氨基酸(例如，1-11、12、13、14、15个氨基酸)、1-20个氨基酸、1-30个氨基酸或更多。在一些实施方案中，接头可包含如seqidno：27、seqidno：89、seqidno：90或seqidno：91所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述接头是抗蛋白水解或基本上抗蛋白水解的。

免疫调节剂的实例包括但不限于细胞因子、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、干扰素、淋巴因子、肿瘤坏死因子、咪喹莫特、来自细菌的细胞膜级分片段、趋化因子、白细胞介素、胞嘧啶磷酸鸟苷(cpg)寡脱氧核苷酸和葡聚糖的重组、合成和/或天然制剂。在一些实施方案中，干扰素选自i型干扰素、ii型干扰素和iii型干扰素，例如干扰素α、干扰素β或干扰素λ。例如，干扰素可以是小鼠干扰素β、人干扰素β、小鼠干扰素α4、人干扰素α2或人干扰素λ。在一些实施方案中，白细胞介素选自il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-19、il-20、il-21、il-22、il-23、il-24、il-25、il-26、il-27、il-28、il-29、il-30、il-31、il-32、il-33、il-34、il-35和il-36。例如，白细胞介素可以是白细胞介素10、白细胞介素2和/或超白细胞介素2。

在一些实施方案中，所述靶向部分是能够结合肿瘤相关抗原的抗体。在一些实施方案中，所述靶向部分能够特异性结合癌细胞表面标志物或癌细胞相关标志物。例如，所述靶向部分可以是特异性结合egfr家族成员的抗体，诸如特异性结合egfr的抗体(例如，西妥昔单抗)；或特异性结合her-2的抗体(例如，曲妥珠单抗)。在一些实施方案中，所述靶向部分是能够特异性结合选自egfr、her2/neu、her4、her3、muc-1、g250、间皮素、gp100、cs1、酪氨酸酶和mage的靶标的标记。在一些实施方案中，靶向部分是或包含选自以下的抗体：帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、奈昔木单抗、abt-806、sym004、帕妥珠单抗、马帕木单抗、帕曲妥单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、obinutuzumab、ocrelizumab、ibritumoma、托西莫单抗、ocaratuzumab、维妥珠单抗、rtxm-83、阿仑单抗、吉姆单抗、daratumumab、依帕珠单抗、brentuximab、利妥木单抗、雷珠单抗、雷莫芦单抗、贝伐单抗、卡妥索单抗、达帕妥珠单抗、盖尼塔单抗、gemtuxumab、吉瑞昔单抗、wx-g250、cc49、t84.66、拉贝珠单抗、anetumab、hu7d9.v3、yyp-218、yp-223、yp-3、sd1、sd2,111in-ss1-scfvsa、mdx-1382、rg-7787、mdx-1459、tf-10、m170、pankomab、hmab16、依洛珠单抗及其片段。在一些实施方案中，靶向部分是单链抗体，并且其可以包含选自西妥昔单抗、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、帕木单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、奈昔木单抗、abt-806、sym004、帕妥珠单抗、马帕木单抗、mage-101、帕曲妥单抗、奥法木单抗、阿托珠单抗、奥瑞珠单抗、ibritumoma、奥卡土珠单抗、维帕妥珠单抗、rtxm-83、campath-1h(阿仑珠单抗)、mylotarg^tm(吉帕妥珠单抗，针对cd33)、daratumumab、依帕珠单抗、brentuximab、rilotumumab、雷珠单抗、雷莫芦单抗、贝伐单抗(avastin^tm)、卡妥索单抗、达洛珠单抗、盖尼塔单抗、吉非替康(针对g250)、wx-g250(针对g250)、cc49(针对tag-72)、t84.66(针对cea)、拉贝珠单抗(针对cea)、anetumab(针对间皮素)、hu7d9.v3(针对间皮素)、yyp-218、yp-223、yp-3、sd1、sd2,111in-ss1-scfvsa、mdx-1382、rg-7787、mdx-1459、tf-10、m170(针对muc1)、pankomab(针对muc1)、hmab16(针对muc1)和依洛珠单抗(针对cs1)。

在一些实施方案中，所述靶向部分是或包含选自以下的抗体：利妥昔单抗、if5、b1、1h4、cd19、b4、b43、fvs191、hll2、ll2、rfb4、m195、hum195、at13/5、4d5、hucc49及其片段。在一些实施方案中，靶向部分是或包含能够结合egfr家族成员的抗体。在一些实施方案中，能够结合egfr家族成员的抗体选自c6.5、c6ml3-9、c6mh3-b1、c6-b1d2、f5、her3.a5、her3.f4、her3.hi、her3.h3、her3.e12、her3.b12、egfr.e12、egfr.c10、egfr.b11、egfr.e8、her4.b4、her4.g4、her4.f4、her4.a8、her4.b6、her4.d4、her4.d7、her4.d1u、her4.d12、her4.e3、her4.e7、her4.f8和her4.c7。在一些实施方案中，靶向部分是或包含抗体西妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或mab806。在一些实施方案中，靶向部分是在相应于西妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或mab806的重链的位置354和/或366的位置上包含点突变s354c和/或t366w的抗体。点突变可以包含在蛋白质异二聚体的所述(ii)重链或异二聚体蛋白的所述第一个成员的重链恒定区中。

在一些实施方案中，能够结合肿瘤相关抗原的抗体包含西妥昔单抗、曲妥单抗、mab806或帕妥珠单抗的重链可变区(vh)中的3个cdr序列和/或轻链可变区(vl)中的3个cdr序列。在一些情况下，所述抗体可包含西妥昔单抗、曲妥单抗、mab806或帕妥珠单抗的vh和/或vl序列。例如，所述抗体可包含重链和轻链，其中其vl的氨基酸序列可以是如seqidno：29所示的，和/或其vh的氨基酸序列可以是如seqidno：30所示的。在另一个实例中，所述抗体可包含重链和轻链，其中其vl中的三个cdr的氨基酸序列可以分别是如seqidno：31(cdr-l1)、seqidno：32(cdr-l2)和seqidno：33(cdr-l3)中所示的，和/或其vh中的三个cdr的氨基酸序列可以分别是如seqidno：34(cdr-h1)，seqidno：35(cdr-h2)和seqidno：36(cdr-h3)中所示的。在另一个实例中，所述抗体可包含重链和轻链，其中其vl的氨基酸序列可以是如seqidno：37所示的，和/或其vh的氨基酸序列可以是如seqidno：38所示的。在另一个实例中，所述抗体可包含重链和轻链，其中其vl中的三个cdr的氨基酸序列可以分别是如seqidno：39(cdr-l1)、seqidno：40(cdr-l2)和seqidno：41(cdr-l3)所示的，和/或其vh中的三个cdr的氨基酸序列可以分别是如seqidno：42(cdr-h1)、seqidno：43(cdr-h2)和seqidno：44(cdr-h3)所示的。在一些实施方案中，所述抗体可包含重链和轻链，其中其vl的氨基酸序列可以是如seqidno：60所示的，和/或其vh的氨基酸序列可以是如seqidno：59所示的。在一个实例中，所述抗体可包含重链和轻链，其中其vl中的三个cdr的氨基酸序列可分别是如seqidno：64(cdr-l1)、seqidno：65(cdr-l2)和seqidno：66(cdr-l3)所示的，和/或其vh中的三个cdr的氨基酸序列可以分别是如seqidno：61(cdr-h1)、seqidno：62(cdr-h2)和seqidno：63(cdr-h3)所示。在另一个实例中，所述抗体可以包含重链和轻链，其中其vl的氨基酸序列可以是如seqidno：71所示的，和/或其vh的氨基酸序列可以是如seqidno：72所示的。在另一个实例中，抗体可包含重链和轻链，其中其vl中的三个cdr的氨基酸序列可以分别是如seqidno：73(cdr-l1)、seqidno：74(cdr-l2)和seqidno：75(cdr-l3)中所示的，和/或其vh中的三个cdr的氨基酸序列可以分别是如seqidno：76(cdr-h1)、seqidno：77(cdr-h2)和seqidno：78(cdr-h3)所示的。在一些实施方案中，抗体在相应于西妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或mab806的重链的位置354和/或位置366的位置上包含点突变s354c和/或t366w。

在一些实施方案中，能够结合肿瘤相关抗原的抗体是或包含选自以下的抗体：单链fv(scfv)、fab、(fab')2、(scfv)2和全长免疫球蛋白。

在一些实施方案中，能够结合肿瘤相关抗原的抗体包含：i)具有如seqidno：11所示的氨基酸序列的轻链，和/或ii)具有如seqidno：13所示的氨基酸序列的重链。在另一个实例中，能够结合肿瘤相关抗原的抗体可包含：i)具有如seqidno：15所示的氨基酸序列的轻链，和/或ii)具有如seqidno：17所示的氨基酸序列的重链。在另一个实例中，能够结合肿瘤相关抗原的所述抗体可包含：i)具有如seqidno：57所示的氨基酸序列的轻链，和/或ii)具有如seqidno：55所示的氨基酸序列的重链。在另一个实例中，能够结合肿瘤相关抗原的所述抗体可以包含：i)具有如seqidno：67所示的氨基酸序列的轻链，和/或ii)具有如seqidno：69所示的氨基酸序列的重链。

在一些实施方案中，包含在所述异二聚体的所述第二个成员中的免疫球蛋白的fc区选自以下免疫球蛋白的恒定区：igg1、igg2、igg3和igg4。在一些实施方案中，异二聚体的第一个成员中包含的所述靶向部分是或包含抗体，并且所述抗体可包含来自与异二聚体的第二个成员中包含的fc区的亚型相同的免疫球蛋白的恒定区的fc区。例如，免疫球蛋白恒定区可包含如seqidno：45、seqidno：46、seqidno：47、seqidno：48所示的氨基酸序列，或与其具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99％氨基酸序列同一性的其同源物。在一些实施方案中，同源物的序列同一性为至少80％，或至少90％。

在一些实施方案中，异二聚体的第二个成员中的免疫球蛋白fc区包含与免疫球蛋白γ1(igg1)恒定区中的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述igg1是人igg1。在一些实施方案中，当与人igg1恒定区的氨基酸序列相比时，异二聚体的第二个成员中的免疫球蛋白fc区包含在相应于人igg1恒定区的位置349、366、368和/或407的位置上具有点突变y349c、t366s、l368a和/或y407v的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述异二聚体的所述第二个成员包含如seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:49、seqidno:51所示的氨基酸序列或与其具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的其同源物。在一些实施方案中，所述同源物的序列同一性为至少80％，或至少90％。在一些实施方案中，所述靶向部分是或包含能够特异性或优先结合由靶细胞表达的标志物(例如，在靶细胞表面上表达的标志物)或与靶细胞结合的标志物。尽管靶细胞实际上可以是任何类型的细胞，但其可特别地涉及与以细胞过度增殖为特征的疾病或病症(即，过度增殖性病症)相关的细胞。过度增殖性疾病的实例包括但不限于银屑病、中性白细胞增多症、红细胞增多症、血小板增多症和癌症。

过度增殖性病症(例如，被表征为癌症的那些病症)的其它非限制性实例包括实体瘤，诸如乳腺癌、呼吸道癌、脑癌、生殖器官癌、消化道癌、泌尿道癌、眼癌、肝癌、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌及其远端转移灶。过度增殖性病症的其它实例还包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。乳腺癌的非限制性实例包括浸润性导管癌、浸润性小叶癌、原位导管癌和原位小叶癌。呼吸道癌症的实例包括但不限于小细胞和非小细胞肺癌，以及支气管腺瘤和胸膜肺母细胞瘤。脑癌的实例包括但不限于脑干和下丘脑神经胶质瘤、小脑和大脑星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤以及神经外胚层和松果体瘤。雄性生殖器官的肿瘤包括但不限于前列腺癌和睾丸癌。雌性生殖器官的肿瘤包括但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌，以及子宫肉瘤。消化道的肿瘤包括但不限于肛门癌、结肠癌、结直肠癌、食道癌、胆囊癌、胃癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌和唾液腺癌。泌尿道肿瘤包括但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌和尿道癌。眼癌包括但不限于眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤。肝癌的实例包括但不限于肝细胞癌(具有或不具有纤维板层变体的肝细胞癌)、胆管癌(肝内胆管癌)和混合的肝细胞胆管癌。皮肤癌包括但不限于鳞状细胞癌、卡波西氏肉瘤、恶性黑素瘤、梅克尔细胞皮肤癌和非黑素瘤皮肤癌。头颈癌包括但不限于喉/下咽/鼻咽/口咽癌，以及唇和口腔癌。淋巴瘤包括但不限于aids相关淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、霍奇金病和中枢神经系统淋巴瘤。肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤。白血病包括但不限于急性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病和多毛细胞白血病。

在一些实施方案中，所述靶向部分是结合癌症标志物(例如，肿瘤相关抗原)的部分。这些所述标志物对于癌细胞不一定是唯一的，但当癌细胞中的标志物表达升高(如与正常健康细胞相比的)时或当周围组织中不存在相当水平的标志物时(尤其是当局部递送本申请的蛋白质异二聚体或异二聚体蛋白时)尤其有效。

癌症标志物的实例包括但不限于被nd4单克隆抗体识别的肿瘤标志物。在低分化的结直肠癌以及胃肠神经内分泌肿瘤中发现该标志物(参见，例如，tobi等(1998)cancerdetectionandprevention,22(2):147-152)。癌症免疫疗法的靶标的其它实例包括膜结合的补体调节糖蛋白，诸如cd46、cd55和cd59，已发现其在体内和体外在大多数肿瘤细胞上表达。人粘蛋白(例如muc1)也是肿瘤标志物的实例，如在黑素瘤中发现的gp100、酪氨酸酶和mage。野生型维尔姆斯肿瘤基因wt1不仅在大多数急性骨髓性、急性淋巴细胞性和慢性骨髓性白血病中，而且在各种类型的实体瘤(包括肺癌)中以高水平表达。

急性淋巴细胞性白血病已由肿瘤相关抗原(taa)hla-dr、cd1、cd2、cd5、cd7、cd19和cd20表征。急性髓性白血病已经由taashla-dr、cd7、cd13、cd14、cd15、cd33和cd34表征。乳腺癌已经由标志物egfr、her2、muc1、tag-72表征。各种癌已经由标志物muc1、tag-72和cea表征。慢性淋巴细胞白血病已由标志物cd3、cd19、cd20、cd21、cd25和hla-dr表征。多毛细胞白血病已由标志物cd19、cd20、cd21、cd25表征。霍奇金病已由leu-m1标志物表征。各种黑素瘤已由hmb45标志物表征。非霍奇金淋巴瘤已经由cd20、cd19和ia标志物表征。并且各种前列腺癌已由psma和se10标志物表征。

在一些实施方案中，肿瘤细胞可展示对于细胞类型和/或其环境是不适当的，或仅在生物体发育期间正常存在的异常抗原(例如，胎儿抗原)。此类抗原的实例包括鞘糖脂gd2(通常仅在神经元细胞的外表面膜上以显著水平表达的双唾液酸神经节苷脂)，其中其对免疫系统的暴露受血脑屏障限制。gd2在包括神经母细胞瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、小细胞肺癌、骨肉瘤和其它软组织肉瘤的广泛范围的肿瘤细胞的表面上表达。因此gd2是用于免疫疗法的方便的肿瘤特异性靶标。

其他类型的肿瘤细胞可展示在健康细胞的表面上稀少或不存在的细胞表面受体，并且其负责激活引起肿瘤细胞的不受调节的生长和分裂的细胞信号传导途径。实例包括(erbb2)her2/neu(在乳腺癌肿瘤细胞的表面上以异常高的水平产生的组成型活性细胞表面受体)。靶标的其它有用实例包括但不限于cd20、cd52、cd33、表皮生长因子受体等。

上文讨论的任何标志物可被本申请的异二聚体中包含的靶向部分靶向。在一些实施方案中，靶向标志物是egfr家族的一个或多个成员(例如，her2、her3、egfr、her4)、cd1、cd2、cd3、cd5、cd7、cd13、cd14、cd15、cd19、cd20、cd21、cd23、cd25、cd33、cd34、cd38、5e10、cea、hla-dr、hm1.24、hmb45、la、leu-m1、muc1、pmsa、tag-72、磷脂酰丝氨酸，cs1等。

在一个方面，本申请提供了编码本申请的蛋白质异二聚体、其成员或其片段的分离的多核苷酸。在一些实施方案中，本申请提供了编码本申请的异二聚体蛋白、其成员或其片段的分离的多核苷酸。可使用本领域熟知的重组技术合成多核苷酸。例如，多核苷酸可通过使用自动化dna合成仪来合成。

标准重组dna和分子克隆技术包括由sambrook,j.,fritsch,e.f.和maniatis,t.molecularcloning:alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress:coldspringharbor,(1989)(maniatis)和由t.j.silhavy,m.l.bennan和l.w.enquist,experimentswithgenefusions,coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,n.y.(1984)以及由ausubel,f.m.等，currentprotocolsinmolecularbiology,pub.bygreenepublishingassoc.andwiley-interscience(1987)描述的那些技术。简而言之，可从基因组dna片段、cdna和rna制备所述核酸，所有这些核酸可直接从细胞中提取或通过各种扩增方法(包括但不限于pcr和rt-pcr)重组产生。

核酸的直接化学合成通常涉及将3'-封闭的和5'-封闭的核苷酸单体依次添加至生长中的核苷酸聚合物链的末端5'-羟基，其中每次添加通过亲核攻击所添加的单体的3'-位上的生长链的末端5'-羟基来实现，所述单体通常是磷衍生物，诸如磷酸三酯、亚磷酰胺等。参见，例如，matteuci等，tet.lett.521:719(1980)；属于caruthers等的美国专利第4,500,707号；和属于southern等的美国专利第5,436,327号和第5,700,637号；在另一方面，本申请提供了包含本申请的分离的多核苷酸的载体。所述载体可以是任何线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒、rna载体、病毒载体等。病毒载体的非限制性实例可包括逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。在一些实施方案中，所述载体是表达载体，例如，噬菌体展示载体。

表达载体可适用于特定类型的宿主细胞，而不适用于其它宿主细胞。例如，可将表达载体引入宿主生物体，然后监测其的载体中包含的任何基因/多核苷酸的生存力和表达。

表达载体还可含有一个或多个选择标记基因，其在表达后赋予可用于选择或以其它方式鉴定携带表达载体的宿主细胞的一个或多个表型性状。用于真核细胞的合适的选择标记的非限制性实例包括二氢叶酸还原酶和新霉素抗性。

可通过多种已建立的技术将所述载体稳定地或瞬时引入宿主细胞。例如，一种方法涉及氯化钙处理，其中通过钙沉淀引入表达载体。也可以按照类似方法使用其它盐，例如磷酸钙。另外，可以用电穿孔(即，施加电流以增加细胞对核酸的渗透性)。转化方法的其它实例包括显微注射、deae葡聚糖介导的转化和在乙酸锂存在下的热休克。脂质复合物、脂质体和树状聚合物也可用于转染宿主细胞。

在将异源序列引入宿主细胞中时，可实施多种方法来鉴定已向其中引入了载体的宿主细胞。一种示例性选择方法包括将单个细胞继代培养以形成单个菌落，然后测试所需蛋白质产物的表达。另一种方法需要基于通过表达载体内包含的选择标记基因的表达赋予的表型性状选择含有异源序列的宿主细胞。

例如，将本申请的各种异源序列引入宿主细胞可通过方法诸如pcr、southern印迹或northern印迹杂交来确认。例如，可从所得宿主细胞制备核酸，并且可使用对目标序列是特异的引物，通过pcr扩增特定目标序列。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳，然后用溴化乙锭、sybrgreen溶液等染色，或用uv检测来检测dna。或者，可在杂交反应中使用对目标序列是特异的核酸探针。特定基因序列的表达可以通过与pcr，northern印迹杂交或通过使用与编码的基因产物反应的抗体的免疫测定的反转录检测相应的mrna来确定。示例性免疫测定包括但不限于elisa、放射免疫测定和夹心免疫测定。

此外，将本申请的各种异源序列引入宿主细胞可以通过异源序列编码的酶(例如，酶促标志物)的酶促活性来确认实。可通过本领域已知的多种方法测定酶。通常，酶促活性可通过产物的形成或正在研究的酶促反应的底物的转化来确定。所述反应可在体外或体内进行。

在另一方面，本申请提供了包含本文中其它地方描述的多核苷酸或载体和/或能够表达本申请的蛋白质异二聚体的细胞(例如，宿主细胞)，和/或编码蛋白质异二聚体的分离的多核苷酸。在一些实施方案中，所述细胞表达本申请的异二聚体蛋白和/或编码异二聚体蛋白的分离的多核苷酸。细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的细胞可用本申请的多核苷酸或载体转化或转染，并用于异二聚体蛋白的表达和/或分泌。例如，所述细胞可以是大肠杆菌细胞、其它细菌宿主细胞、酵母细胞或各种高等真核细胞(例如，永生化杂交瘤细胞、nso骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢细胞、hela细胞、cos细胞等)。在一些实施方案中，编码蛋白质异二聚体的多核苷酸(例如，异二聚体蛋白)可操作地连接至适于在特定宿主细胞中表达的表达控制序列。

制备蛋白质异二聚体的方法

在一个方面，本申请提供了用于产生蛋白质异二聚体的方法。在一些实施例中，该方法包括以下步骤：

(1)提供异二聚体的一个成员，其中所述一个成员包含(i)轻链和(ii)重链，所述(i)轻链和(ii)重链复合以形成表现出对肿瘤抗原的结合特异性的靶向部分；

(2)提供所述异二聚体的另一个成员，其中所述包含多肽，所述多肽从n末端到c末端包含与重链片段融合的免疫调节剂，其中，所述重链片段与所述重链(ii)复合以形成所述异二聚体；并且，

(3)获得蛋白质异二聚体。

在一些实施方案中，用于产生蛋白质异二聚体的方法包括以下步骤：在实现异二聚体表达的条件下培养本申请的宿主细胞，和收获表达的异二聚体。

在一些实施方案中，本申请提供了用于产生本申请的异二聚体蛋白的方法。在一些实施例中，该方法包括以下步骤：

(1)提供第一个成员(例如，第一多肽)，其中所述第一个成员包含能够结合肿瘤相关抗原的靶向部分、癌细胞表面标志物或癌细胞相关标志物；

(2)提供第二个成员(例如，第二多肽)，其中所述第二个成员包括免疫球蛋白的fc区和干扰素、白细胞介素或任何其它免疫调节剂；和

(3)获得蛋白质异二聚体。

在一些实施方案中，用于产生本申请的异二聚体蛋白的方法包括以下步骤：在实现异二聚体蛋白表达的条件下培养本申请的宿主细胞，和收获表达的异二聚体蛋白。

在一些实施方案中，所述方法还进一步包括分离和/或纯化蛋白质异二聚体或异二聚体蛋白质的步骤。

在一些实施方案中，所述方法还进一步包括用编码/表达本申请的异二聚体、其一个或多个成员或其片段的多核苷酸/载体转染/转化宿主细胞的步骤。

在一些实施方案中，本申请的蛋白质异二聚体或异二聚体蛋白质通过在适于蛋白质表达的条件下在细胞中表达载体来产生。

可在用于蛋白质表达的合适条件之间变化的因素包括因素，诸如培养时间、温度和培养基，并且可取决于细胞类型，并且将由本领域技术人员容易地确定。

在一些实施方案中，在生产本申请的蛋白质异二聚体或异二聚体蛋白的过程中，在培养物中和在可用于生长培养物的任何装置(包括发酵罐)中生长宿主细胞。可将细胞作为单层或附着于表面生长。或者，可悬浮生长宿主细胞。可在无血清的培养基中生长细胞。培养基可以是商购可得的培养基，例如但不限于补充有谷氨酰胺，诸如8mml-谷氨酰胺的opti-cho(invitrogen，目录号#12681)；补充有10％牛血清、10.5ng/mlmil-3和l-谷氨酰胺的rpmi1640培养基；或5％fcs培养基。

药物组合物

在一个方面，本申请提供了药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含本申请的分离的蛋白质异二聚体(例如，分离的异二聚体蛋白)或分离的多核苷酸。所述药物组合物还可包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的实例包括但不限于惰性固体稀释剂和填充剂、稀释剂、无菌水溶液和各种有机溶剂、渗透促进剂、增溶剂和佐剂。

在一些实施方案中，将所述药物组合物配制用于口服施用、静脉内施用、肌内施用、在肿瘤部位的原位施用、吸入、直肠施用、阴道施用、经皮施用或通过皮下储库施用。

所述药物组合物可用于抑制肿瘤生长。例如，药物组合物、药物和/或试剂盒可抑制或延迟疾病的发展或进展，可减小肿瘤大小(并且甚至基本上消除肿瘤)，并且可缓解和/或稳定疾病状况。

下面描述了非限制性的示例性药物组合物及其制备方法。

所述药物组合物可以例如呈适于口服施用的形式，如片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、缓释制剂、溶液、悬浮剂、用于胃肠外注射的形式如无菌溶液、悬浮剂或乳液，用于局部施用的形式如软膏或霜剂或用于直肠施用的形式如栓剂。药物组合物可以以适于精确剂量的单次施用的单元剂型存在。药物组合物还可包含根据本申请的蛋白质异二聚体(例如，异二聚体蛋白)作为活性成分，并且可包括常规药物载体或赋形剂。此外，其还可包括其它药物或药剂、载体、佐剂等。

示例性肠胃外施用形式包括但不限于活性蛋白质异二聚体(例如，异二聚体蛋白)在无菌水溶液例如丙二醇或葡萄糖水溶液中的溶液或悬浮剂。如果需要，这样的剂型可适当地用盐诸如组氨酸和/或磷酸盐来缓冲。

在一些实施方案中，本申请提供了用于注射的药物组合物，其含有本申请的蛋白质异二聚体(例如，异二聚体蛋白)和适于注射的药物赋形剂。所述组合物中试剂的组分和量是如本文所述的。

为了注射施用，本申请的药物组合物水性或油性悬浮液或乳液的形式中可掺入包括芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油，以及酏剂、甘露醇、葡萄糖或无菌水溶液和类似的药物媒介物。

盐水中的水溶液也可用于注射。还可使用乙醇、甘油、丙烯、丙二醇、液体聚乙二烯等(及其合适的混合物)、环糊精衍生物和植物油。可以例如通过使用包衣诸如卵磷脂(用于在分散体的情况下维持所需的粒度)以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。微生物作用的预防可通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。

无菌可注射溶液可通过将本申请的蛋白质异二聚体(例如，异二聚体蛋白)以合适的量与如上列举的各种其它成分一起掺入适合的溶剂，(根据需要)随后进行过滤灭菌来制备。通常，根据需要或期望，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和来自上面列举的那些成分的其它成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，某些所需的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术产生活性成分加上来自其先前无菌滤液的任何额外所需成分的粉末。

在一些实施方案中，本申请提供了用于口服施用的药物组合物，其包含本申请的蛋白质异二聚体(例如，异二聚体蛋白)和适合于口服施用的药物赋形剂。

在一些实施方案中，本申请提供了用于口服施用的固体药物组合物，其包含：(i)一定量的本申请的蛋白质异二聚体(例如，异二聚体蛋白)；任选地(ii)一定量的第二试剂；和(iii)适于口服给药的药物赋形剂。在一些实施方案中，组合物还包含：(iv)一定量的第三试剂。在一些实施方案中，蛋白质异二聚体、第二试剂和任选的第三试剂的量是单独或组合地在疗受试者的病况中是有效的量。

在一些实施方案中，所述药物组合物可以是适于口服消费的液体药物组合物。适于口服施用的本申请的药物组合物可呈现为离散剂型诸如胶囊、扁囊剂或片剂，或液体或气溶胶喷雾剂(各自含有预定量的活性成分，所述活性成分呈粉末或存在于颗粒、溶液中，或水性或非水性液体中的悬浮液、水包油乳液或油包水液体乳液中)。这样的剂型可以通过任何药学方法制备，但所有方法通常包括使活性成分与载体结合的步骤，所述载体构成一种或多种其它成分。通常，通过将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀且紧密地混合，然后，如果需要，将产品成塑造成所需的形式，来制备组合物。

本申请还包括包含活性成分(例如，本申请的蛋白质异二聚体或异二聚体蛋白)的无水药物组合物和剂型，因为水可以促进一些多肽的降解。例如，在制药领域中可以加入水(例如，5％)作为模拟长期储存的手段，以便确定特征，诸如制剂随时间的保质期或稳定性。本申请的无水药物组合物和剂型可使用无水或低水分含量的成分和低水分或低湿度条件来制备。如果预期在制造、包装和/或储存期间与水分和/或湿度充分接触，则含有乳糖的本申请的药物组合物和剂型可以是无水的。可以制备和储存无水药物组合物，以使得保持其无水性质。因此，可使用已知防止暴露于水的材料包装无水组合物，以使得可将它们包含在合适的制剂套盒中。合适的包装的实例包括但不限于气密密封箔、塑料等、单元剂量容器、泡罩包装和条状包装。

可以按照常规药物复合技术将本申请的蛋白质异二聚体(例如，异二聚体蛋白)与药物载体在紧密混合物中组合。根据施用所需的制剂形式，所述载体可以采取多种形式。在制备用于口服剂型的组合物中，在口服液体制剂(诸如悬浮剂、溶液和酏剂)或气溶胶的情况下，可使用任何常用的药物介质作为载体，诸如水、乙二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等；或在一些不使用乳糖的实施方案中，在口服固体制剂的情况下，可使用载体诸如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。例如，对于固体口服制剂，合适的载体包括粉剂、胶囊剂和片剂。如果需要，片剂可通过标准水性或非水性技术进行包衣。

适用于药物组合物和剂型的粘合剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉或其它淀粉、明胶、天然和合成树胶诸如阿拉伯胶、海藻酸钠、海藻酸、其它海藻酸盐、粉末状黄蓍胶、瓜尔胶、纤维素及其衍生物(例如，乙基纤维素、乙酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、预胶化淀粉、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素及其混合物。

用于本文公开的药物组合物和剂型的合适的填充剂的实例包括但不限于滑石、碳酸钙(例如，颗粒或粉末)、微晶纤维素、粉末纤维素、葡萄糖结合剂、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨醇、淀粉、预胶化淀粉及其混合物。

崩解剂可用于本申请的组合物以提供当暴露于水性环境时崩解的片剂。过多的崩解剂可能产生可能在瓶中崩解的片剂。太少可能不足以发生崩解，因此可改变活性成分从剂型释放的速率和程度。因此，可使用既不太少也不太多(太少或太多会不利地改变活性成分的释放)的足够量的崩解剂来形成本文公开的化合物的剂型。所使用的崩解剂的量可根据制剂的类型和施用模式而变化，并且可由本领域普通技术人员容易地辨别。在药物组合物中可以使用按重量计约0.5％至约15％的崩解剂或按重量计约1％至约5％的崩解剂。可用于形成本申请的药物组合物和剂型的崩解剂包括但不限于琼脂-琼脂、海藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、波拉克林钾、淀粉羟乙酸钠、马铃薯或木薯淀粉、其他淀粉、预胶化淀粉、其它淀粉、粘土、其它藻胶、其它纤维素、树胶或其混合物。

可用于形成本申请的药物组合物和剂型的润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其它甘油醇、月桂基硫酸钠、滑石、氢化植物油(例如，花生油、棉籽油、向日葵油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂及其混合物。另外的润滑剂包括例如syloid硅胶、合成二氧化硅的凝结气溶胶及其混合物。可以任选地以小于按重量计约1％的药物组合物的量添加润滑剂。

当需要水性混悬剂和/或酏剂用于口服施用时，可将其中的活性成分与各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料以及如果需要，乳化剂和/或悬浮剂，连同这样的稀释剂诸如水、乙醇、丙二醇、甘油及其各种组合一起组合。

所述片剂可以未被包衣的或通过已知技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在更长的时间内提供持续作用。例如，可使用时间延迟材料，诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。用于口服使用的制剂也可呈现为硬明胶胶囊，其中将活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或作为软胶胶囊，其中将活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

可用于形成本申请的药物组合物和剂型的表面活性剂包括但不限于亲水性表面活性剂、亲脂性表面活性剂及其混合物。可使用亲水性表面活性剂的混合物，可使用亲脂性表面活性剂的混合物，或可使用至少一种亲水性表面活性剂和至少一种亲脂性表面活性剂的混合物。

具有较低亲水-亲脂平衡(hlb)值的表面活性剂是更亲脂或疏水的，并且在油中具有更大的溶解度，而具有更高hlb值的表面活性剂更亲水，并且在水溶液中具有更大的溶解度。亲水性表面活性剂通常被认为是具有大于约10的hlb值的那些化合物，以及对于其hlb量表通常不适用的阴离子、阳离子或两性离子化合物。类似地，亲脂性(即，疏水性)表面活性剂是具有等于或小于约10的hlb值的化合物。然而，表面活性剂的hlb值仅仅是通常用于能够配制工业、药物和化妆品乳液的粗略指导。

亲水性表面活性剂可以是离子型或非离子型的。合适的离子表面活性剂包括但不限于烷基铵盐；夫西地酸盐；氨基酸、寡肽和多肽的脂肪酸衍生物；氨基酸、寡肽和多肽的甘油酯衍生物；卵磷脂和氢化卵磷脂；溶血卵磷脂和氢化溶血卵磷脂；磷脂及其衍生物；溶血磷脂及其衍生物；肉碱脂肪酸酯盐；烷基硫酸盐；脂肪酸盐；多库酯钠；酰基乳酸盐；单-和二-甘油酯的单-和二-乙酰化酒石酸酯；琥珀酰化的单甘油酯和二甘油酯；单甘油酯和二甘油酯的柠檬酸酯；及其混合物。

在上述组内，离子表面活性剂包括，例如：卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂、溶血磷脂及其衍生物；肉碱脂肪酸酯盐；烷基硫酸盐；脂肪酸盐；多库酯钠；酰基乳酸盐(acylactylates)；单-和二-甘油酯的单-和二-乙酰化酒石酸酯；琥珀酰单甘油酯和二甘油酯；单甘油酯和二甘油酯的柠檬酸酯；及其混合物。

离子表面活性剂可以是卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰丝氨酸、peg-磷脂酰乙醇胺、pvp-磷脂酰乙醇胺、脂肪酸乳酸酯、硬脂酰-2-乳酸酯、硬脂酰乳酸酯、琥珀酰单甘油酯、单/二甘油酯的单/二乙酰化酒石酸酯、单/二甘油酯的柠檬酸酯、胆酸肌氨酸、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、月桂酸盐、肉豆蔻酸盐、棕榈酸盐、油酸盐、蓖麻油酸盐、亚油酸盐、亚麻酸盐、硬脂酸盐、月桂基硫酸盐、四鲸蜡基硫酸盐、多库酯、月桂酰肉碱、棕榈酰肉碱、肉豆蔻酰肉碱及其盐和混合物。

亲水性非离子表面活性剂的实例包括但不限于烷基葡糖苷；烷基麦芽糖苷；烷基硫代葡糖苷；月桂基聚乙二醇甘油酯；聚氧化烯烷基醚诸如聚乙二醇烷基醚；聚氧化烯烷基酚诸如聚乙二醇烷基酚；聚氧化烯烷基苯酚脂肪酸酯，诸如聚乙二醇脂肪酸单酯和聚乙二醇脂肪酸二酯；聚乙二醇甘油脂肪酸酯；聚甘油脂肪酸酯；聚氧化烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，诸如聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯；多元醇与甘油酯、植物油、氢化植物油、脂肪酸和固醇中的至少一种的亲水性酯交换产物；聚氧乙烯固醇，其衍生物和类似物；聚氧乙烯维生素及其衍生物；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；及其混合物；聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯和多元醇与由甘油三酯、植物油和氢化植物油组成的组的至少一个成员的亲水性酯交换产物。多元醇可以是甘油、乙二醇、聚乙二醇、山梨醇、丙二醇、季戊四醇或糖。

亲水-非离子表面活性剂的其它实例包括但不限于peg-10月桂酸酯、peg-12月桂酸酯、peg-20月桂酸酯、peg-32月桂酸酯、peg-32二月桂酸酯、peg-12油酸酯、peg-15油酸酯、peg-20油酸酯、peg-20二油酸酯、peg-32油酸酯、peg-200油酸酯、peg-400油酸酯、peg-15硬脂酸酯、peg-32二硬脂酸酯、peg-40硬脂酸酯、peg-100硬脂酸酯、peg-20二月桂酸酯、peg-25三油酸甘油酯、peg-32二油酸酯、peg-20月桂酸甘油酯、peg-30月桂酸甘油酯、peg-20硬脂酸甘油酯、peg-20油酸甘油酯、peg-30油酸甘油酯、peg-30月桂酸甘油酯、peg-40月桂酸甘油酯、peg-40棕榈仁油、peg-50氢化蓖麻油、peg-40蓖麻油、peg-35蓖麻油、peg-60蓖麻油、peg-40氢化蓖麻油、peg-60氢化蓖麻油、peg-60玉米油、peg-6癸酸/辛酸甘油酯、peg-8癸酸/辛酸甘油酯、聚甘油-10月桂酸酯、peg-30胆固醇、peg-25植物甾醇、peg-30大豆甾醇、peg-20三油酸酯、peg-40山梨糖醇酐油酸酯、peg-80山梨糖醇酐月桂酸酯、聚山梨酯20、聚山梨酯80、poe-9月桂基醚、poe-23月桂基醚、poe-10油基醚、poe-20油基醚、poe-20硬脂基醚、生育酚-100琥珀酸酯、peg-24胆固醇、聚甘油-10油酸酯、tween40、tween60、蔗糖单硬脂酸酯、蔗糖单月桂酸酯、蔗糖单棕榈酸酯、peg10-100壬基酚系列、peg15-100辛基酚系列和泊洛沙姆。

合适的亲脂性表面活性剂包括，仅举实例为：脂肪醇；脂肪酸甘油酯；乙酰化脂肪酸甘油酯；低级醇脂肪酸酯；丙烯丙二醇酯；山梨糖醇酐脂肪酸酯；聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯；甾醇和甾醇衍生物；聚氧乙烯化甾醇和甾醇衍生物；聚乙二醇烷基醚；糖酯；糖醚；单甘油酯和二甘油酯的乳酸衍生物；多元醇与由甘油酯、植物油、氢化植物油、脂肪酸和甾醇组成的组中的至少一个成员的疏水性酯交换产物；油溶性维生素/维生素衍生物；及其混合物。在该组内，优选的亲脂性表面活性剂包括脂肪酸甘油酯、脂肪酸丙二醇酯及其混合物，或是多元醇与植物油、氢化植物油和甘油三酯中的至少一个成员的疏水性酯交换产物。

在一些实施方案中，所述组合物包括增溶剂以确保本申请的蛋白质异二聚体的良好增溶和/或溶解，并使本申请的蛋白质异二聚体的沉淀最小化。这对于非口服使用的组合物，例如注射用组合物，可以是特别重要的。还可添加增溶剂以增加亲水性药物和/或其它组分诸如表面活性剂的溶解度，或者将组合物保持为稳定或均匀的溶液或分散体。

合适的增溶剂的实例包括但不限于以下：醇和多元醇，诸如乙醇、异丙醇、丁醇、苄醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇及其异构体、甘油、季戊四醇、山梨醇、甘露醇、卡必醇、二甲基异山梨醇、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素和其它纤维素衍生物、环糊精和环糊精衍生物；平均分子量为约200至约6000的聚乙二醇的醚，诸如四氢糠醇peg醚(糖原质)或甲氧基peg；酰胺和其它含氮化合物如2-吡咯烷酮、2-哌啶酮、ε-己内酰胺、n-烷基吡咯烷酮、n-羟烷基吡咯烷酮、n-烷基哌啶酮、n-烷基己内酰胺、二甲基乙酰胺和聚乙烯吡咯烷酮；酯诸如丙酸乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酯基柠檬酸三乙酯、乙酰基柠檬酸三丁酯、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、三乙酸甘油酯、丙二醇单乙酸酯、丙二醇二乙酸酯、ε-己内酯及其异构体、δ-戊内酯及其异构体、β-丁内酯及其异构体；和本领域已知的其它增溶剂，诸如二甲基乙酰胺、二甲基异山梨醇、n-甲基吡咯烷酮、单辛酸酯、二甘醇乙基醚和水。

也可以使用增溶剂的混合物。实例包括但不限于三乙酸甘油酯、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、二甲基乙酰胺、n-甲基吡咯烷酮、n-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、聚乙二醇200-100、糖原质、卡必醇、丙二醇和二甲基异山梨醇。特别优选的增溶剂包括山梨醇、甘油、三乙酸甘油酯、乙醇、peg-400、糖原质和丙二醇。

可以包括的增溶剂的量没有特别限制。给定的增溶剂的量可受限于生物可接受的量，其可以由本领域技术人员容易地确定。在一些情况下，可能有利的是包括远远超过生物可接受量的增溶剂的量，例如以最大化药物的浓度，使用常规技术诸如蒸馏或蒸发在向受试者提供组合物之前除去过量增溶剂。因此，如果存在增溶剂，则基于药物和其它赋形剂的组合重量，所述增溶剂可以为按重量计10％、25％、50％、100％或高达约200％的重量比。如果需要，也可使用非常少量的增溶剂，诸如5％、2％、1％或甚至更少。通常，所述增溶剂可以以按重量计约1％至约100％，更典型地以约5％至约25％的量存在。

所述组合物还可包括一种或多种药学上可接受的添加剂和赋形剂。此类添加剂和赋形剂包括但不限于防粘剂、消泡剂、缓冲剂、聚合物、抗氧化剂、防腐剂、螯合剂、粘度调节剂、张力调节剂、调味剂、着色剂、气味剂、遮光剂、悬浮剂、粘合剂、填充剂、成形剂、润滑剂及其混合物。

另外，可将酸或碱掺入所述组合物中以促进加工，增强稳定性或出于其它原因。药学上可接受的碱的实例包括氨基酸、氨基酸酯、氢氧化铵、氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸氢钠、氢氧化铝、碳酸钙、氢氧化镁、硅酸镁铝、合成硅酸铝、合成水滑石、氢氧化镁铝、二异丙基乙胺、乙醇胺、乙二胺、三乙醇胺、三乙胺、三异丙醇胺、三甲胺、三(羟甲基)氨基甲烷(tris)等。还合适的是作为药学上可接受的酸的盐的碱，诸如乙酸、丙烯酸、己二酸、海藻酸、烷基磺酸、氨基酸、抗坏血酸、苯甲酸、硼酸、丁酸、碳酸、柠檬酸、脂肪酸、甲酸、富马酸、葡糖酸、氢醌磺酸、异抗坏血酸、乳酸、马来酸、草酸、对溴苯磺酸、丙酸、对甲苯磺酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、鞣酸、酒石酸、巯基乙酸、甲苯磺酸、尿酸等。也可以使用多元酸的盐，诸如磷酸钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。当碱是盐时，阳离子可以是任何方便的和药学上可接受的阳离子，诸如铵、碱金属、碱土金属等。实例可包括但不限于钠、钾、锂、镁、钙和铵。

合适的酸是药学上可接受的有机或无机酸。合适的无机酸的实例包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、硼酸、磷酸等。合适的有机酸的实例包括乙酸、丙烯酸、己二酸、海藻酸、烷基磺酸、氨基酸、抗坏血酸、苯甲酸、硼酸、丁酸、碳酸、柠檬酸、脂肪酸、甲酸、富马酸、葡萄糖酸、氢醌磺酸、异抗坏血酸、乳酸、马来酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、丙酸、对甲苯磺酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、丹宁酸、酒石酸、巯基乙酸、甲苯磺酸、尿酸等。

在一些实施方案中，本申请的药物组合物可包含另外的治疗上和/或药学上所需的试剂。例如，所述另外的治疗和/或药学上所需的试剂可以是抗肿瘤剂，包括但不限于烷化剂(例如，氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、噻替派、白消胺、洛莫司汀、卡莫司汀、链佐星、达卡巴嗪、顺铂(cis-platinum)、顺铂(cisplatin)、卡铂、六甲蜜胺等)、抗代谢药(例如，甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、5-氟脱氧尿苷、卡培他滨、氟达拉滨、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、吉西他滨、克拉屈滨、脱氧柯福霉素、喷司他丁等)、抗生素(例如多柔比星、柔红霉素、伊达比星、戊柔比星、米托蒽醌、放线菌素d、光辉霉素、普卡霉素、丝裂霉素c、博来霉素、丙卡巴肼等)、有丝分裂抑制剂(例如紫杉酚、多西他赛、硫酸长春花碱、硫酸长春新碱、硫酸长春瑞滨等)、核染色质功能抑制剂(例如，托泊替康、伊立替康、依托泊苷、替尼泊苷等)、激素和激素抑制剂(例如己烯雌酚、雌二醇、雌激素、酯化雌激素、雌氮芥、他莫昔芬、托瑞米芬、阿那曲唑、来曲唑、17-oh-孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、戈舍瑞林、亮丙瑞林、睾酮、甲基睾酮、氟甲睾酮、氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特等)、合成的抑制剂(例如，氨鲁米特、酮康唑等)、免疫调节剂(例如，利妥昔单抗、曲妥珠单抗、土尼白细胞介素2(denileukindiftitox)、左旋咪唑、卡介苗、干扰素α-2a、干扰素α-2b、白细胞介素-2、阿地白介素等)和其它试剂诸如1-天冬酰胺酶、培门冬酶、羟基脲、亚叶酸、米托坦、卟吩姆钠，维甲酸等。

本申请的药物组合物可包含治疗有效量的所述活性剂(例如，本申请的蛋白质异二聚体或异二聚体蛋白)。治疗有效量是能够在患有所述病况或病症或具有发展所述疾病的风险的受试者中预防和/或治愈(至少部分地)所述病况或病症(例如，癌症)和/或其任何并发症的所述药物组合物的量。所包含的活性剂的具体量/浓度可以根据施用方法和患者的需要而变化，并且可以基于例如患者的体积、粘度和/或体重等来确定。例如，合适的剂量可以是约0.1mg或1mg/kg/天至约50mg/kg/天；有时，剂量甚至可以更高。在一些实施方案中，所施用的剂量可以是约3mg/kg/天至约3.5mg/kg/天、3.5mg/kg/天至约7.2mg/kg/天、约7.2mg/kg/天至约11.0mg/kg/天、约11.0mg/kg/天至约15.0mg/kg/天。在一些实施方案中，所施用的剂量为约10mg/kg/天至约50mg/kg/天，例如约20mg至约50mg/天，每天施用2次。应当理解，本领域技术人员(例如，医生或药剂师)可基于特定患者、制剂和/或疾病的情况方便地调整这些具体剂量。

医疗用途和治疗方法

在一个方面，本申请提供本申请的蛋白质异二聚体(例如，异二聚体蛋白)、分离的多核苷酸或药物组合物在制备用于抑制肿瘤或肿瘤细胞生长的药剂和/或试剂盒中的用途。

在一些实施方案中，所述药剂和/或试剂盒用于特异性和/或优先抑制靶细胞(例如，癌细胞)的生长或分化或杀死靶细胞(例如，癌细胞)。

在一个方面，本申请提供了抑制肿瘤或肿瘤细胞生长的方法。所述方法可包括将肿瘤或细胞与有效量的本申请的蛋白质异二聚体或异二聚体蛋白接触。在一些实施方案中，所述接触在体外发生。在一些实施方案中，所述接触在体内发生。

在一些实施方案中，所述接触包括向受试者(例如，哺乳动物)系统性或局部施用本申请的蛋白质异二聚体(例如，异二聚体蛋白)、药物组合物或药剂。在一些实施方案中，所述接触包括直接在肿瘤部位施用本申请的蛋白质异二聚体(例如，异二聚体蛋白)、药物组合物或药剂。在一些实施方案中，通过口服施用、静脉内施用、肌内施用、在肿瘤部位的原位施用、吸入、直肠施用、阴道施用、经皮施用或通过皮下储库施用来进行施用。

在一些实施方案中，所述肿瘤(例如，癌症)或肿瘤细胞(例如，癌细胞)是或来自实体瘤。例如，癌症可以选自b细胞淋巴瘤、肺癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、周围神经系统癌、食管癌、宫颈癌、黑素瘤、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽癌、肝癌、肾癌、胆管癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、脂肪肉瘤、睾丸癌和恶性纤维组织细胞瘤。

在一些实施方案中，所述癌症或癌细胞在受试者体内，例如人或非人动物(例如，哺乳动物)中的癌症或癌细胞。

在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，哺乳动物是小鼠、大鼠、猫、狗、兔、猪、绵羊、马、牛、山羊、沙鼠、仓鼠、豚鼠、猴或任何其他哺乳动物。许多这样的哺乳动物可以是本领域已知作为某些疾病或病症(包括实体瘤和/或其他癌症)的临床前模型的受试者(例如，talmadge等2007am.j.pathol.170:793；kerbel,2003canc.biol.therap.2(4suppl1):s134；man等，2007canc.met.rev.26:737；cespedes等，2006clin.transloncol.8∶318)。

虽然本文已显示并描述了本申请的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，此类实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本申请的情况下，本领域技术人员将想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实践本申请时可采用本文所述的本申请的实施方案的各种替代。以下权利要求旨在限定本申请的范围，并由此涵盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。

实施例

以下提供的实施例和制剂进一步说明和举例说明了本申请的蛋白质异二聚体及其使用和制备方法。应当理解，本申请的范围不以任何方式受以下实施例和制备的范围限制。

实施例1多肽的修饰和制备

1.1西妥昔单抗的制备

获得西妥昔单抗(也称为erbitux或erb，其是抗表皮生长因子受体egfr的抗体)的重链和轻链的全长氨基酸序列，并使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)获得编码这些氨基酸序列的相应dna序列。然后，合成编码西妥昔单抗轻链(erb-lc)的核酸分子。erb-lc的氨基酸序列如seqidno：11所示，编码其的相应多核苷酸序列如seqidno：12所示。然后，将点突变(s354c、t366w)引入编码西妥昔单抗重链基因的fc区的多核苷酸序列中，并合成编码经修饰的西妥昔单抗重链的核酸分子(本文称为erb-knob)，相应的编码其的多肽被命名为erb-knob。erb-knob的氨基酸序列如seqidno：13所示，编码其的多核苷酸序列如seqidno：14所示。

1.2曲妥珠单抗的制备

根据美国专利us7879325b2(通过引用并入本文)获得曲妥珠单抗的重链和轻链的全长氨基酸序列。然后，使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)获得编码这些氨基酸序列的相应dna序列。然后合成编码曲妥珠单抗轻链(t-lc)的核酸分子。t-lc的氨基酸序列如seqidno：15所示，编码其的相应多核苷酸序列如seqidno：16所示。然后，将点突变(s354c，t366w)引入编码曲妥珠单抗重链基因的fc区的多核苷酸序列中，并合成编码经修饰的曲妥珠单抗重链的核酸分子(本文称为t-knob)，相应的编码其的多肽被命名为t-knob。t-knob的氨基酸序列如seqidno：17所示，编码其的多核苷酸序列如seqidno：18所示。

1.3muifna4-fc-hole的制备

首先，从国家生物技术信息中心(ncbi)获得小鼠干扰素α4(ifna4)(nm_010504.2)的序列信息，以及获得编码其的全长多核苷酸序列。然后，根据来自蛋白质数据库uniprot的人免疫球蛋白γ1(igg1)恒定区(p01857)的氨基酸序列，获得人igg1-fc的氨基酸序列(即p01857的残基104至残基330)。然后，将点突变(y349c、t366s、l368a和y407v)引入igg1-fc片段，由此获得的多肽称为fc-hole。然后，将接头序列“gsggg”(seqidno：27)添加至fc-hole的n末端，得到接头-fc-hole。然后使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码其的相应dna序列。将编码小鼠ifnα4的多核苷酸序列添加至编码接头-fc-hole的多核苷酸序列的5'末端，从而获得并合成编码融合蛋白muifna4-fc-hole的多核苷酸序列。muifna4-fc-hole的氨基酸序列如seqidno：1所示，编码它的多核苷酸序列如seqidno：2所示。

1.4huifna2-fc-hole的制备

首先，从国家生物技术信息中心(ncbi)获得人干扰素α2(ifna2)(nm_000605.3)的序列信息，并获得编码其的全长多核苷酸序列。然后，根据来自蛋白质数据库uniprot的人免疫球蛋白γ1(igg1)恒定区(p01857)的氨基酸序列，获得人igg1-fc的氨基酸序列(即p01857的残基104至残基330)。然后，将点突变(y349c，t366s，l368a和y407v)引入igg1-fc片段，由此获得的多肽称为fc-hole。然后，将接头序列“gsggg”(seqidno：27)添加至fc-hole的n末端，得到接头-fc-hole。然后使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码其的相应dna序列。将编码人ifnα2的多核苷酸序列添加至编码接头-fc-hole的多核苷酸序列的5'端，从而获得并合成编码融合蛋白huifna2-fc-hole的多核苷酸序列。huifna2-fc-hole的氨基酸序列如seqidno：3所示，编码其的多核苷酸序列如seqidno：4所示。

1.5muifnb-fc-hole的制备

首先，从国家生物技术信息中心(ncbi)获得小鼠干扰素β(ifnβ)(nm_005018.2)的序列信息，获得编码其的全长多核苷酸序列。然后，根据来自蛋白质数据库uniprot的人免疫球蛋白γ1(igg1)恒定区(p01857)的氨基酸序列，获得人igg1-fc的氨基酸序列(即p01857的残基104至残基330)。然后，将点突变(y349c，t366s，l368a和y407v)引入igg1-fc片段，由此获得的多肽称为fc-hole。然后，将接头序列“gsggg”(seqidno：27)添加至fc-hole的n末端，得到接头-fc-hole。然后使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码其的相应dna序列。将编码小鼠ifnβ的多核苷酸序列添加至编码接头-fc-hole的多核苷酸序列的5'端，从而获得并合成编码融合蛋白muifnb-fc-hole的多核苷酸序列。muifnb-fc-hole的氨基酸序列如seqidno：5所示，编码其的多核苷酸序列如seqidno：6所示。

1.6huifnb-fc-hole的制备

首先，从国家生物技术信息中心(ncbi)获得人干扰素β(ifnβ)(ef064725.1)的序列信息，获得编码其的全长多核苷酸序列。然后，根据来自蛋白质数据库uniprot的人免疫球蛋白γ1(igg1)恒定区(p01857)的氨基酸序列，获得人igg1-fc的氨基酸序列(即p01857的残基104至残基330)。然后，将点突变(y349c，t366s，l368a和y407v)引入igg1-fc片段，由此获得的多肽称为fc-hole。然后，将接头序列“gsggg”(seqidno：27)添加至fc-hole的n末端，得到接头-fc-hole。然后使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码其的相应dna序列。将编码人ifnβ的多核苷酸序列添加至编码接头-fc-hole的多核苷酸序列的5'末端，从而获得并合成编码融合蛋白huifnb-fc-hole的多核苷酸序列。huifnb-fc-hole的氨基酸序列如seqidno：9所示，编码其的多核苷酸序列如seqidno：10所示。

1.7huifnl-fc-hole的制备

首先，从国家生物技术信息中心(ncbi)获得人干扰素λ(ifnl)(bc117482.1)的序列信息，并获得编码其的全长多核苷酸序列。然后，根据来自蛋白质数据库uniprot的人免疫球蛋白γ1(igg1)恒定区(p01857)的氨基酸序列，获得人igg1-fc的氨基酸序列(即p01857的残基104至残基330)。然后，将点突变(y349c，t366s，l368a和y407v)引入igg1-fc片段，由此获得的多肽称为fc-hole。然后，将接头序列“gsggg”(seqidno：27)加入到fc-hole的n末端，得到接头-fc-hole。然后使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码其的相应dna序列。将编码人ifnl的多核苷酸序列添加至编码接头-fc-hole的多核苷酸序列的5'端，从而获得并合成编码融合蛋白huifnl-fc-hole的多核苷酸序列。huifnl-fc-hole的氨基酸序列如seqidno：7所示，编码其的多核苷酸序列如seqidno：8所示。

1.8对照c末端或n末端融合蛋白的制备

首先，获得西妥昔单抗轻链和重链的全长氨基酸序列。然后使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码其的相应dna序列，并合成编码西妥昔单抗轻链和重链的核酸分子。将接头序列“sggggsggggsggggsgggg”(seqidno：28)添加至重链的c末端，从而获得西妥昔单抗重链-接头。然后，使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码小鼠ifnβ(nm_005018.2)的dna序列。然后将编码小鼠ifnβ的dna序列添加至所获得的西妥昔单抗重链-接头的3'末端，以产生并合成编码融合蛋白erbhc-muifnb的多核苷酸序列。erbhc-muifnb的氨基酸序列如seqidno：19所示，编码其的多核苷酸序列如seqidno：20所示。

类似地，获得西妥昔单抗轻链和重链的全长氨基酸序列。然后使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码其的相应dna序列，并合成编码西妥昔单抗轻链和重链的核酸分子。将接头序列“gsggg”添加至重链的n末端，从而获得接头-西妥昔单抗重链。然后，使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码人ifnλ(bc117482.1)的dna序列。然后将编码人ifnl的dna序列添加至所获得的接头-西妥昔单抗重链的5'端，以产生并合成编码融合蛋白ifnl-erbhc的多核苷酸序列。ifnl-erbhc的氨基酸序列如seqidno：21所示，编码其的多核苷酸序列如seqidno：22所示。

获得西妥昔单抗轻链和重链的全长氨基酸序列。然后使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码其的相应dna序列，并合成编码西妥昔单抗轻链和重链的核酸分子。将接头序列“sggggsggggsggggsgggg”(seqidno：28)添加至重链的c末端，从而获得西妥昔单抗重链-接头。然后，使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码人ifnβ(ef064725.1)的dna序列。然后将编码人ifnβ的dna序列添加至所获得的西妥昔单抗重链-接头的3'末端，以产生并合成编码融合蛋白erbhc-huifnb的多核苷酸序列。erbhc-huifnb的氨基酸序列如seqidno：23所示，编码其的多核苷酸序列如seqidno：24所示。

获得西妥昔单抗轻链和重链的全长氨基酸序列。然后使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码其的相应dna序列，并合成编码西妥昔单抗轻链和重链的核酸分子。将接头序列“gsggg”添加至重链的n末端，从而获得接头-西妥昔单抗重链。然后，使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码人ifnβ(ef064725.1)的dna序列。然后将编码人ifnβ的dna序列添加至所获得的接头-西妥昔单抗重链的5'端，以产生并合成编码融合蛋白huifnb-erbhc的多核苷酸序列。huifnb-erbhc的氨基酸序列如seqidno：25所示，编码其的多核苷酸序列如seqidno：26所示。

1.9huil10-fc-hole的制备

首先，从国家生物技术信息中心(ncbi)获得人白细胞介素10(huil10)(p22301)的序列信息，并获得编码其的全长多核苷酸序列。然后，根据来自蛋白质数据库uniprot的人免疫球蛋白γ1(igg1)恒定区(p01857)的氨基酸序列，获得人igg1-fc的氨基酸序列(即p01857的残基104至残基330)。然后，将点突变(y349c，t366s，l368a和y407v)引入igg1-fc片段，由此获得的多肽称为fc-hole。然后，将接头序列“(ggggs)3”(seqidno：89)添加至fc-hole的n末端，以获得接头-fc-hole。然后使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码其的相应dna序列。将编码huil10的多核苷酸序列添加至编码接头-fc-hole的多核苷酸序列的5'端，从而获得并合成编码融合蛋白huil10-fc-hole的多核苷酸序列。huil10-fc-hole的氨基酸序列如seqidno：49所示，编码其的多核苷酸序列如seqidno：50所示。

1.10(huil10)2-fc-hole的制备

首先，从国家生物技术信息中心(ncbi)获得人白细胞介素10(huil10)(p22301)的序列信息，并获得编码其的全长多核苷酸序列。然后，根据来自蛋白质数据库uniprot的人免疫球蛋白γ1(igg1)恒定区(p01857)的氨基酸序列，获得人igg1-fc的氨基酸序列(即p01857的残基104至残基330)。然后，将点突变(y349c，t366s，l368a和y407v)引入igg1-fc片段，由此获得的多肽称为fc-hole。然后，将接头序列“(ggggs)3”(seqidno：89)添加至fc-hole的n末端，以获得接头-fc-hole。然后使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码其的相应dna序列。然后，在两个拷贝的huil10之间添加接头序列“(ggggs)3”(seqidno：89)，以获得(huil10)2。然后将编码(huil10)2的多核苷酸序列添加至编码接头-fc-hole的多核苷酸序列的5'端，从而获得并合成编码融合蛋白(huil10)2-fc-hole的多核苷酸序列。(huil10)2-fc-hole的氨基酸序列如seqidno：51所示，编码其的多核苷酸序列如seqidno：52所示。

1.11帕妥珠单抗的制备

根据us7879325(通过引用并入本文)获得帕妥珠单抗的重链和轻链的全长氨基酸序列。然后，使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)获得编码这些氨基酸序列的相应dna序列。然后合成编码帕妥珠单抗轻链(p-lc)的核酸分子。p-lc的氨基酸序列如seqidno：57所示，编码其的相应多核苷酸序列如seqidno：58所示。然后，将点突变(s354c，t366w)引入编码帕妥珠单抗重链基因的fc区的多核苷酸序列中，合成编码经修饰的帕妥珠单抗重链的核酸分子(本文称为p-knob)，相应的编码其的多肽被命名为p-knob。p-knob的氨基酸序列如seqidno：55所示，编码其的多核苷酸序列如seqidno：56所示。

1.12mab806的制备

根据us7879325(通过引用并入本文)获得mab806的重链和轻链的全长氨基酸序列。然后，使用在线工具dnaworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)获得编码这些氨基酸序列的相应dna序列。然后合成编码mab806轻链(mab806-lc)的核酸分子。mab806-lc的氨基酸序列如seqidno：67所示，编码其的相应多核苷酸序列如seqidno：68所示。然后，将点突变(s354c，t366w)引入编码mab806重链基因的fc区的多核苷酸序列中，合成编码经修饰的mab806重链的核酸分子(本文称为mab806-knob)，相应的编码其的多肽被命名为mab806-knob。mab806-knob的氨基酸序列如seqidno：69所示，编码其的多核苷酸序列如seqidno：70所示。

实施例2重组质粒的构建

将根据实施例1获得的培核酸分子(分别编码huifnb-erbhc、erbhc-huifnb、ifnl-erbhc、erbhc-muifnb、t-knob、曲妥珠单抗轻链(命名为t-lc)、erb-knob、西妥昔单抗轻链(命名为erb-lc)、muifna4-fc-hole、huifna2-fc-hole、muifnb-fc-hole、huifnb-fc-hole、huifnl-fc-hole、huil10-fc-hole、(huil10)2-fc-hole、帕妥珠单抗轻链(命名为p-lc)、p-knob、mab806轻链(命名为mab806-lc)和mab806-knob)用hindiii和ecori(takara)消化，随后将其分别亚克隆至载体pcdna4/myc-hisa(invitrogen,v863-20)中。通过测序验证获得的质粒，将正确的重组质粒分别命名为：pcdna4-huifnb-erbhc、pcdna4-erbhc-huifnb、pcdna4-huifnl-erbhc、pcdna4-erbhc-muifnb、pcdna4-t-knob、pcdna4-tlc、pcdna4-erb-knob、pcdna4-erblc、pcdna4-muifna4-fc-hole、pcdna4-huifna2-fc-hole、pcdna4-muifnb-fc-hole、pcdna4-huifnb-fc-hole、pcdna4-huifnl-fc-hole、pcdna4-huil10-fc-hole、pcdna4-(huil10)2-fc-hole、pcdna4-plc、pcdna4-p-knob、pcdna4-mab806-lc和pcdna4-mab806-knob。

实施例3蛋白质异二聚体的表达和纯化

在转染前两天，制备12×600ml悬浮的驯化的hek293(atcc，crl-1573^tm)细胞以用于瞬时转染，以0.8×10⁶个细胞/ml的密度接种细胞。两天后，将三等分的细胞悬浮液离心，然后重悬于600mlfreestyle293培养基中。

将从实施例2获得的重组表达载体分成以下组：

组1：pcdna4-erb-knob(200μg)+pcdna4-erblc(200μg)+pcdna4-muifna4-fc-hole(200μg)；

组2：pcdna4-erb-knob(200μg)+pcdna4-erbcl(200μg)+pcdna4-huifna2-fc-hole(200μg)；

组3：pcdna4-erb-knob(200μg)+pcdna4-erblc(200μg)+pcdna4-muifnb-fc-hole(200μg)；

组4：pcdna4-erb-knob(200μg)+pcdna4-erblc(200μg)+pcdna4-huifnb-fc-hole(200μg)；

组5：pcdna4-erb-knob(200μg)+pcdna4-erblc(200μg)+pcdna4-huifnl-fc-hole(200μg)；

组6：pcdna4-t-knob(200μg)+pcdna4-tlc(200μg)+pcdna4-huifna2-fc-hole(200μg)；

组7：pcdna4-t-knob(200μg)+pcdna4-tcl(200μg)+pcdna4-huifnb-fc-hole(200μg)；

组8：pcdna4-t-knob(200μg)+pcdna4-tlc(200μg)+pcdna4-(huil10)2-fc-hole(200μg)；

组9：pcdna4-erb-knob(200μg)+pcdna4-erblc(200μg)+pcdna4-huil10-fc-hole(200μg)；

组10：pcdna4-erb-knob(200μg)+pcdna4-erblc(200μg)+pcdna4-(huil10)2-fc-hole(200μg)；

组11：pcdna4-mab806-knob(200μg)+pcdna4-mab806-lc(200μg)+pcdna4-(huil10)2-fc-hole(200μg)；

组12：pcdna4-p-knob(200μg)+pcdna4-plc(200μg)+pcdna4-(huil10)2-fc-hole(200μg)；

用6mlfreestyle293培养基稀释每组质粒混合物，并添加pei(聚乙烯亚胺)溶液以进行转染。分别将每组的质粒/pei混合物添加至600ml细胞悬浮液中，然后在37℃，10％co2，90rpm下培养，培养基补充有50μg/ligf-1(胰岛素样生长因子i)。4小时后，用600mlex293培养基，2mm谷氨酰胺和50μg/ligf-1补充培养基，并在135rpm下培养。24小时后，加入3.8mmvpa。5-6天后，收集5×1200ml细胞的上清液，通过蛋白a亲和层析纯化粗蛋白质异二聚体样品。首先用sds-page检查所获得的样品，清楚地观察到目标条带(实例示于图10中)。所获得的蛋白质异二聚体命名为(分别从组1至组12)：erb-muifna4、erb-huifna2、erb-muifnb、erb-huifnb、erb-huifnl、tmab-huifna2、tmab-huifnb、tmab-(huil10)2、erb-huil10、erb-(huil10)2、mab806-(huil10)2和pmab-(huil10)2。

实施例4蛋白质异二聚体的表达产量

4.1异二聚体erb-muifnb与c末端融合蛋白erbhc-muifnb的表达的比较

转染前两天，制备2×100ml悬浮的驯化的hek293(atcc，crl-1573^tm)细胞以用于瞬时转染，将细胞以0.8×10⁶个细胞/ml的密度接种。两天后，离心细胞悬浮液，然后重悬于100mlfreestyle293培养基中。将表达质粒分成“异二聚体组”和“c-末端融合蛋白组”，其中异二聚体组包含：pcdna4-erb-knob(33μg)+pcdna4-erblc(33μg)+pcdna4-muifnb-fc-hole(33μg)；并且c-末端融合蛋白组包含：pcdna4-erb-lc(50μg)+pcdna4-erbhc-muifnb(50μg)。每组质粒混合物用1mlfreestyle293培养基稀释，加入pei(聚乙烯亚胺)溶液以进行转染。将每组质粒/pei混合物分别添加至100ml细胞悬浮液中，然后在37℃，10％co2，90rpm下培养，培养基补充有50μg/ligf-1。4小时后，用100mlex293培养基，2mm谷氨酰胺和50μg/ligf-1补充培养物，并在135rpm下培养。24小时后，加入3.8mmvpa。5-6天后，收集来自瞬时表达的培养物上清液，通过elisa(酶联免疫吸附测定)检测异二聚体和c末端融合蛋白的表达水平。

如图1所示，erb-muifnb异二聚体的表达产量为83mg/l，c-末端融合蛋白erbhc-muifnb的表达产量为3mg/l。

类似地，检查本申请公开了的其它蛋白质异二聚体以及对照c末端融合蛋白和/或n末端融合蛋白的表达产量，结果概述于下表1中：

表1

-*：不可检测的

实施例5蛋白质异二聚体的体内稳定性

5.1异二聚体erb-huifnb的药代动力学特征

将12只雌性8周龄balb/c小鼠分成3组(组a/b/c)，每组4只小鼠。将50μg(2.5mg/kg)erb-huifnb蛋白质异二聚体静脉内注射至每只小鼠中，在施用异二聚体后的13个不同时间点上分别取100μl血液。在每个时间点，从一组小鼠中取血，并且三组轮流取血。分离血清，然后使用elisa测定血清中异二聚体的浓度。简言之，如下进行elisa测定：用小鼠抗-higg(jacksonimmunoresearch：209-005-082)涂覆平板，然后加入适当稀释的血清样品。随后，添加小鼠抗hifnb-生物素(ebioscience：bms1044bt)，然后添加链霉抗生物素蛋白-hrp(sigma：s2438)以用于tmb显色。将erb-huifnb用作标准品，以获得标准曲线。使用winnolin计算药代动力学参数。获得的平均c-t曲线如图2所示。异二聚体erb-huifnb的计算的半衰期(t1/2)为27.468小时，而据报道erb与huifnβ之间的c-末端融合蛋白的t1/2仅为8小时。

5.2异二聚体erb-huifnl的药代动力学特征

将12只雌性，8周龄balb/c小鼠分成3组(组a/b/c)，每组4只小鼠。将200μg(10mg/kg)erb-huifnl蛋白质异二聚体静脉内注射至每只小鼠中，在施用异二聚体后的13个不同时间点上分别取100μl血液。在每个时间点，从一组小鼠中取血，并且将三组轮流取血。分离血清，然后，使用elisa分别测定血清中fc片段和huifnl的浓度。简言之，对于fc片段，如下进行elisa测定：用抗-higg-fc片段抗体(bethyl：a80-104a)涂覆平板，然后加入适当稀释的血清样品。然后，添加抗人iggfchrp(bethyl：a80-104p)，然后进行tmb显色。对于huifnl，使用huifnlelisa试剂盒(ebioscience：88-7296)。将erb-huifnl用作标准品，得到标准曲线。使用winnolin计算药代动力学参数。获得的平均c-t曲线是如图3所示的。异二聚体erb-huifnl的计算的半衰期(t1/2)为57.308小时。

5.3异二聚体erb-huil10和erb-(huil10)2的药代动力学特征

将12只雌性8周龄c57bl/6小鼠分成3组(a/b/c组)，每组4只小鼠。将20μg(1mg/kg)erb-huil10或erb-(huil10)2蛋白质异二聚体腹膜内注射至小鼠(对于erb-huil10和erb-(huil10)2各12只小鼠)中，在异二聚体施用后13个不同时间点上分别取100μl血。在每个时间点，从一组小鼠中取血，并且将三组轮流取血。分离血清，然后，使用elisa分别测定血清中erb-huil10或erb-(huil10)2的浓度。简言之，如下进行elisa测定：用5μg/ml纯化的抗人il-10(biolegend，目录号：501505)涂覆平板，然后加入适当稀释的血清样品。然后，添加抗人igghrp(sigma，a0170)，然后进行tmb显色。使用winnolin计算药代动力学参数。得到平均c-t曲线，如图11所示。异二聚体erb-huil10的计算的半衰期(t1/2)为17.63小时，而异二聚体erb-(huil10)2的计算的半衰期为33.56小时。

通过将20μg(1mg/kg)erb-(huil10)2静脉内注射至c57bl/6小鼠中来进一步检查异二聚体erb-(huil10)2的药代动力学特征。与针对腹膜内注射所描述的那些类似地进行实验。如下进行elisa测定：用5μg/ml纯化的抗人il-10抗体(biolegend，目录号：501505)涂覆平板，然后加入适当稀释的血清样品。然后，添加egfr-生物素和sa-hrp，随后进行tmb显色。使用winnolin计算药代动力学参数。得到平均c-t曲线，如图28所示。异二聚体erb-(huil10)2的计算的半衰期(t1/2)为49.8小时。

5.4异二聚体erb-huifna2的药代动力学

以0.2mg/kg用蛋白质异二聚体erb-huifna2静脉内注射一只雄性食蟹猴。在施用异二聚体后两周内在13个不同的时间点分别取500μl血液，然后使用elisa测定血清中异二聚体的浓度。简言之，如下进行elisa测定：用0.8μg/mlegfr-fc蛋白涂覆板，然后加入适当稀释的血清样品。然后，添加抗-人ifnα生物素抗体(ebioscince，bms-1016bt)，然后添加链霉抗生物素蛋白-hrp(sigma：s2438)以用于tmb显色。使用winnolin计算药代动力学参数。得到平均c-t曲线，如图29所示。在食蟹猴中异二聚体erb-huifna2的计算的半衰期(t1/2)为41.6小时。

5.5本申请公开的其它蛋白质异二聚体的药代动力学特征

类似地，测定异二聚体erb-muifnb的体内半衰期(在小鼠中)，erb-muifnb的计算的半衰期(t1/2)为34.5小时(数据未显示)。

实施例6蛋白质异二聚体与相应靶标的结合

6.1erb-干扰素蛋白质异二聚体与egfr的结合

将稳定地表达人egfr抗原的小鼠黑素瘤细胞系(b16细胞系，atcc，crl-6475^tm)用于检查蛋白质异二聚体与egfr的结合。使用流式细胞术，其中将本申请的系列稀释的erb-干扰素蛋白质异二聚体(或对照erb抗体西妥昔单抗(merck，erbitux))和抗-人iggfc特异性pe(ebioscience：12-4998-82)第二抗体顺序地添加至细胞中。然后进行流式细胞术，并用来自pe通道的蛋白质浓度和中等荧光强度(mfi)产生剂量-效应曲线。如图4所示，本申请的各种erb-干扰素蛋白质异二聚体(例如，erb-muifnb、erb-huifnl和erb-huifnb)可以特异性结合egfr，并且结合亲和力与对照抗体西妥昔单抗的结合亲和力并无显著不同。

6.2erb-白细胞介素蛋白质异二聚体与egfr的结合

将人鳞状细胞癌a431细胞系用于检查erb-白细胞介素蛋白质性异质二聚体与egfr的结合。使用流式细胞术分析，其中将本申请的系列稀释的erb-白细胞介素蛋白质异二聚体(或对照erb抗体(merckerbitux))和抗-人iggfc特异性pe(ebioscience：12-4998-82)第二抗体顺序添加至细胞中。然后进行流式细胞术分析，用来自pe通道的蛋白质浓度和中等荧光强度(mfi)产生剂量-效应曲线。如图12的图(a)所示，蛋白质异二聚体erb-huil10和erb-(huil10)2以与对照抗体西妥昔单抗类似的方式特异性结合靶egfr。

还使用稳定表达人egfr的小鼠黑素瘤细胞系(b16细胞系)检查erb-(huil10)2与其靶egfr的结合亲和力，结果示于图12的图(b)中。可以看出，erb-(huil10)2以与对照抗体西妥昔单抗类似的方式特异性结合靶egfr。

erb-(huil10)2与egfr的特异性结合也通过elisa来确认，如图13所示的。

6.3mab806-白细胞介素蛋白质异二聚体与egfr的结合

类似地，还使用稳定表达人egfr的小鼠黑素瘤细胞系(b16细胞系)检查mab806-(huil10)2与egfr的结合亲和力。mab806是靶向egfrviii突变体的抗体，然而，其也可以以低亲和力结合野生型egfr。进行流式细胞术，结果示于图14。如可从图14看出的，mab806-(huil10)2以剂量依赖性方式结合egfr。

6.4tmab-干扰素和tmab-白细胞介素蛋白质异二聚体与her2的结合

还检查了tmab-huifna2和tmab-(huil10)2与其靶her2的结合亲和力，使用人乳腺癌细胞系mcf-7(atcc，htb-22^tm)和人乳腺癌细胞系sk-br-3进行实验。结果分别示于图15的图(a)(对于人乳腺癌细胞系mcf-7)和图15的图(b)(对于人乳腺癌细胞系sk-br-3)中。如图15所示，tmab-huifna2和tmab-(huil10)2均以与对照抗体曲妥珠单抗类似的方式特异性结合her-2。

6.5pmab-白细胞介素蛋白质异二聚体与her2的结合

使用人乳腺癌细胞系sk-br-3检查pmab-(huil10)2与其靶her2的结合亲和力。结果如图16所示，pmab-(huil10)2特异性结合her-2，尽管其结合亲和力不如对照抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗好。

实施例7包含在蛋白质异二聚体中的免疫调节剂的生物活性

7.1干扰素在erb-干扰素异二聚体中的生物活性

用egfp(增强绿色荧光蛋白)标记的水泡性口炎病毒(vsv)感染小鼠成纤维细胞系l929或人肝癌细胞系hepg2，检查干扰素在增加细胞的抗病毒能力中的活性。分别检查muifnb、huifna2和huifnl的活性。简言之，在本申请的系列稀释的蛋白质异二聚体存在的情况下下将细胞培养8小时，然后添加适量的用vsv-egfp感染的细胞。24小时后，用流式细胞术分析测定感染细胞的百分比，计算蛋白质异二聚体对病毒感染的保护率。然后根据蛋白质异二聚体的保护率和浓度的剂量-效应曲线获得ec50。如图5所示，异二聚体erb-muifnb、erb-huifna2和erb-huifnl保护细胞免受病毒感染。

7.2白细胞介素在erb-白细胞介素异二聚体中的生物活性

白细胞介素可以抑制脂多糖(lps)刺激的tnf-α从巨噬细胞释放(davidf.等，1991，thejournalofimmunology.第147卷3815-3822)。为了测试白细胞介素在本申请的蛋白质异二聚体中的该活性，将人外周血单核细胞(pbmc)接种在96孔板中，3-4小时后洗去悬浮的细胞。然后，添加不同浓的本申请公开了的erb-huil10或erb-(huil10)2，2小时后，添加2μg/mllps以进行24小时的刺激。收集上清液，并使用elisa检查tnf-α的释放。根据tnf-α试剂盒(ebioscience，88-7346)中的说明书进行elisa。简言之，用涂覆缓冲液稀释捕获抗体，然后涂覆costar9018elisa板；随后，添加标准和适当稀释的样品。然后，使用检测抗体检测反应，并用tmb显色。结果示于图17和图18中。如图17所示，erb-huil10以剂量依赖性方式抑制tnf-α的释放。图18显示本申请的erb-(huil10)2也以剂量依赖性方式有效抑制tnf-α的释放，并且与erb-huil10相比，剂量依赖性抑制更加明显。

7.3免疫调节剂在其他蛋白质异二聚体中的生物活性

类似地检查了免疫调节剂在本申请公开的其它蛋白质异二聚体中的生物活性。图19显示本申请的mab806-(huil10)2以剂量依赖性方式有效抑制tnf-α的释放。图20显示本申请公开了的tmab-(huil10)2对tnf-α释放的剂量依赖性抑制。图21显示本申请公开了的pmab-(huil10)2以剂量依赖性方式有效抑制tnf-α的释放。

实施例8蛋白质异二聚体的体外抗肿瘤活性

将表达低水平her2抗原的人乳腺癌细胞系mcf-7(atcc，htb-22^tm)用于评价tmab-huifna2异二聚体的体外抗肿瘤作用。简言之，在系列稀释的抗体曲妥珠单抗、干扰素α或tmab-huifna2异二聚体存在的情况下培养细胞72小时，然后使用cck8(细胞计数试剂盒8)测定法检查细胞增殖。计算细胞增殖抑制率，获得剂量-效应曲线。用7aad染色和流式细胞术测定检查细胞凋亡。从图8可以看出，单独的曲妥珠单抗不抑制肿瘤细胞增殖，而本申请的蛋白质异二聚体以剂量依赖性方式显著抑制mcf7细胞生长。蛋白质异二聚体的抑制作用与干扰素的抑制作用相当。细胞凋亡结果在各组之间没有显著差异(数据未显示)，表明本申请公开了的蛋白质异二聚体可以有效抑制肿瘤细胞生长，而不影响细胞凋亡。

类似地，使用表达egfr的肿瘤细胞系a431来评估erb-huifnb异二聚体的抗肿瘤活性。简言之，将细胞在系列稀释的抗体西妥昔单抗或erb-huifnb异二聚体存在的情况下培养72小时，使用mtt比色法检查细胞增殖。计算细胞增殖抑制率，获得剂量-效应曲线。如可从图9看出，本申请公开了的蛋白质异二聚体的抗肿瘤作用显著强于西妥昔单抗，并且抑制是剂量依赖性的。

实施例9蛋白质异二聚体的体内抗肿瘤活性

9.1本申请的erb-干扰素异二聚体的体内抗肿瘤活性

使用b16-egfr小鼠模型来检查本申请的蛋白质异二聚体的活性。简言之，用7x10⁵个b16-egfr-siy细胞皮下注射8周龄雌性c57bl/6小鼠。14天后，测量肿瘤体积为约70mm³。在肿瘤部位(25μg/次，每两天一次，共3次)分别原位施用erb-muifnb异二聚体、c末端融合蛋白erbhc-muifnb、erb-huifnl异二聚体或n-末端融合蛋白ifnl-erbhc。每三天测量肿瘤大小，计算肿瘤的体积以获得肿瘤生长的曲线。结果示于图6中。如可从图6看到的，本申请的蛋白质异二聚体的体内抗肿瘤活性与相应的融合蛋白相当。

在人中，egfr不仅在肿瘤部位高度表达，而且其在正常组织中也以低基线水平表达。为了获得更接近地模拟人类病症的动物模型，也将用b16-egfr肿瘤细胞接种的egfr转基因小鼠用作模型系统来评价本申请的异二聚体的作用。简言之，对8周龄的雌性egfr转基因c57bl/6小鼠皮下注射5×10⁵个b16-egfr-siy细胞。14天后，测量肿瘤体积为约70mm³。静脉内(200μg/次，每三天一次，共2次)施用erb-muifna4异二聚体或对照西妥昔单抗抗体。每三天测量肿瘤大小，计算肿瘤的体积以获得肿瘤生长的曲线。结果示于图7。可在图7中看到的，本申请的蛋白质异二聚体的体内抗肿瘤活性非常显著。另外，在该实验中，全身系统性地而非仅在肿瘤部位地施用本申请的蛋白质异二聚体，因此，观察到的优异的抗肿瘤作用表明蛋白质异二聚体在体内有效地靶向肿瘤细胞。

还使用c57bl/6野生型小鼠模型测试erb-muifna4异二聚体的体内抗肿瘤活性。简言之，用7x10⁵个b16-egfr-siy细胞皮下注射8周龄雌性c57bl/6小鼠。7天后，测量肿瘤体积为约45mm³。腹膜内(i.p.)注射erb-muifna4异二聚体或对照抗体西妥昔单抗(erbitux，merck)。以三种不同剂量(分别为5mg/kg、0.5mg/kg和0.05mg/kg)注射erb-muifna4异二聚体，西妥昔单抗的剂量为5mg/kg，两者每周施用两次，共三个剂量。每周测量肿瘤大小两次，计算肿瘤的体积以获得肿瘤生长的曲线。对于所施用的每个剂量，结果示于图22中，erb-muifna4异二聚体在体内有效地减小肿瘤体积。

9.2本申请的erb-白细胞介素异二聚体的体内抗肿瘤活性

类似于实施例9.1，使用c57bl/6小鼠模型测试erb-(huil10)2的体内抗肿瘤活性。简言之，用7x10⁵个b16-egfr-siy细胞皮下注射8周龄雌性c57bl/6小鼠。7天后，测量肿瘤体积为约45mm³。腹膜内(i.p.)注射erb-(huil10)2异二聚体或对照抗体西妥昔单抗(erbitux，merck)。以四种不同剂量(分别为1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg和6mg/kg)注射erb-(huil10)2异二聚体，西妥昔单抗的剂量为5mg/kg，共三个剂量。每周测量肿瘤大小两次，计算肿瘤的体积以获得肿瘤生长的曲线。结果示于图23中。erb-(huil10)2以剂量依赖性方式在体内有效地减小肿瘤体积。另外，在该实验中，全身性而非在肿瘤部位施用本申请的蛋白质异二聚体，因此，观察到的优异的抗肿瘤作用表明蛋白质异二聚体在体内有效地靶向肿瘤细胞。

还通过在肿瘤部位原位注射异二聚体erb-(huil10)2来检查erb-(huil10)2的体内抗肿瘤效应。如实施例9.2中所述制备小鼠肿瘤模型。从肿瘤接种后第7天以三个不同剂量(分别为0.2mg/kg、0.4mg/kg和1mg/kg)注射erb-(huil10)2异二聚体，每3天施用，总共施用三个剂量。使用磷酸盐缓冲盐水(pbs)作为阴性对照。结果示于图24中。如可从图24看到的，当在肿瘤部位注射时，erb-(huil10)2以剂量依赖性方式有效地减小体内肿瘤体积。

erb-(huil10)2与erb-muifna4之间的体内抗肿瘤作用的比较示于图25中。如实施例9.2中所述制备小鼠肿瘤模型。分别以5mg/kg的剂量腹膜内(i.p.)注射erb-(huil10)2和erb-muifna4。从肿瘤接种后第7天注射它们，每3天施用，总共施用三个剂量。pbs用作阴性对照。如图25所示，erb-(huil10)2和erb-muifna4均有效抑制肿瘤大小的增加，erb-(huil10)2的作用更显著。

在该研究中，发现虽然erb-(huil10)2和erb-muifna4都有效地抑制肿瘤大小的增加，但只有erb-(huil10)2在部分治疗的小鼠中导致完全肿瘤消退，并且肿瘤消退的小鼠的百分比以剂量依赖性增加。肿瘤消退率的分析示于图26中。erb-muifna4抑制小鼠中的肿瘤生长，但未观察到完全的肿瘤消退，而erb-(huil10)2施用在高达50％的测试小鼠中导致完全肿瘤消退。

进一步研究了导致erb-(huil10)2的抗肿瘤活性的机制。如9.2中所述制备小鼠肿瘤模型。在肿瘤接种后第7天，以4mg/kg腹膜内(i.p.)注射异二聚体erb-(huil10)2，每3天施用一次，共施用三个剂量。pbs用作阴性对照。在第5天在指定的组中施用200μgcd8、cd4和nk细胞耗尽抗体，每3天重复施用耗尽抗体，并且对于每种耗尽抗体总共施用五个剂量。如可从图27看到的，用抗cd8抗体消除erb-(huil10)2的抗肿瘤作用，而cd4或nk1.1抗体的耗尽不显著影响erb-(huil10)2的抗肿瘤活性，表明erb-(huil10)2的抗肿瘤活性可能是cd8+t细胞依赖性的。

实施例10蛋白质异二聚体体内的靶向行为

类似于实施例9.1中所示的方法，使用c57bl/6b16-egfr小鼠模型检查erb-(huil10)2的体内分布。简言之，用7x10⁵个b16-egfr-siy细胞皮下注射8周龄雌性c57bl/6小鼠。7天后，测量肿瘤体积为约45mm³。腹膜内(i.p)注射alexafluor750(af750)标记的erb-(huil10)2异二聚体或对照异二聚体tmab-(huil10)2。注射后24小时，用ivis光谱体内成像系统(perkinelmer)体内筛选或在取出肿瘤后体外筛选af750免疫荧光信号。结果(如图30所示)表明，在egfr阳性肿瘤中，erb-(huil10)2的浓度远高于tmab-(huil10)2的浓度。因此，本申请的蛋白质异二聚体可在体内有效地针对靶向组织(例如，肿瘤)。

为了进一步检查肿瘤靶向对蛋白质异二聚体的抗肿瘤效应的重要性，使用c57bl/6b16-egfr小鼠模型测试erb-(huil10)2和tmab-(huil10)2的体内抗肿瘤作用。所述方法类似于实施例9.1中所述的那些方法。简言之，用7x10⁵个b16-egfr-siy细胞皮下注射8周龄雌性c57bl/6小鼠。7天后，测量肿瘤体积为约45mm³。以4mg/kg腹膜内(i.p.)注射异二聚体erb-(huil10)2、tmab-(huil10)2或pbs(阴性对照)。每周进行两次注射，总共注射三个剂量。每周两次测量肿瘤大小，计算肿瘤的体积以获得肿瘤生长曲线，如图31所示。结果表明，仅erb-(huil10)2有效抑制肿瘤生长，表明肿瘤靶向对于其体内治疗作用的重要性。

序列表

<110>苏州丁孚靶点生物技术有限公司

<120>蛋白质异二聚体及其用途

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tacaagtgcaaggtgtctaataaggcactgccagcccccatagagaagacaatctctaaa1020

gctaaaggccaaccacgcgagcctcaggtctacacactgccaccatccagggacgaactg1080

accaagaatcaggtgagcctgacttgtctcgtcaaaggattctacccaagcgacatcgcc1140

gtggagtgggaatccaacggccaaccagagaacaactacaagaccaccccaccagtcctg1200

gactctgatgggagctttttcctgtattccaagctgacagtggacaagtctcggtggcaa1260

cagggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcatgaagccctgcataaccactatacccag1320

aaaagcctcagcctgtcccccgggaaaagcggcggcggcggcagcgggggcggcggcagc1380

ggaggaggcggcagcggaggaggcggcatgagctacaacttgcttggattcctacaaaga1440

agcagcaattttcagtgtcagaagctcctgtggcaattgaatgggaggcttgaatactgc1500

ctcaaggacaggatgaactttgacatccctgaggagattaagcagctgcagcagttccag1560

aaggaggacgccgcattgaccatctatgagatgctccagaacatctttgctattttcaga1620

caagattcatctagcactggctggaatgagactattgttgagaacctcctggctaatgtc1680

tatcatcagataaaccatctgaagacagtcctggaagaaaaactggagaaagaagatttc1740

accaggggaaaactcatgagcagtctgcacctgaaaagatattatgggaggattctgcat1800

tacctgaaggccaaggagtacagtcactgtgcctggaccatagtcagagtggaaatccta1860

aggaacttttacttcattaacagacttacaggttacctccgaaac1905

<210>25

<211>641

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

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metthrasnlyscysleuleuglnilealaleuleuleucyspheser

151015

thrthralaleusermetsertyrasnleuleuglypheleuglnarg

202530

serserasnpheglncysglnlysleuleutrpglnleuasnglyarg

354045

leuglutyrcysleulysaspargmetasnpheaspileprogluglu

505560

ilelysglnleuglnglnpheglnlysgluaspalaalaleuthrile

65707580

tyrglumetleuglnasnilephealailepheargglnaspserser

859095

serthrglytrpasngluthrilevalgluasnleuleualaasnval

100105110

tyrhisglnileasnhisleulysthrvalleugluglulysleuglu

115120125

lysgluaspphethrargglylysleumetserserleuhisleulys

130135140

argtyrtyrglyargileleuhistyrleulysalalysglutyrser

145150155160

hiscysalatrpthrilevalargvalgluileleuargasnphetyr

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pheileasnargleuthrglytyrleuargasnglyserglyglygly

180185190

glnvalglnleulysglnserglyproglyleuvalglnprosergln

195200205

serleuserilethrcysthrvalserglypheserleuthrasntyr

210215220

glyvalhistrpvalargglnserproglylysglyleuglutrpleu

225230235240

glyvaliletrpserglyglyasnthrasptyrasnthrprophethr

245250255

serargleuserileasnlysaspasnserlysserglnvalphephe

260265270

lysmetasnserleuglnserasnaspthralailetyrtyrcysala

275280285

argalaleuthrtyrtyrasptyrgluphealatyrtrpglyglngly

290295300

thrleuvalthrvalseralaalaserthrlysglyproservalphe

305310315320

proleualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleu

325330335

glycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrp

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asnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleu

355360365

glnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproser

370375380

serserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislyspro

385390395400

serasnthrlysvalasplysargvalgluprolyssercysasplys

405410415

thrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglypro

420425430

servalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileser

435440445

argthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasp

450455460

progluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasn

465470475480

alalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargval

485490495

valservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglu

500505510

tyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulys

515520525

thrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthr

530535540

leuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthr

545550555560

cysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpglu

565570575

serasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleu

580585590

aspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplys

595600605

serargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglu

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alaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserprogly

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lys

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<212>dna

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atcaacaaggacaacagcaagagccaggtgttcttcaagatgaacagcctgcagagcaac840

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agcaacaccaaggtggacaagcgcgtggagcccaagagctgcgataagacacacacctgc1260

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aaa1923

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<223>合成

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<211>20

<212>prt

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<223>合成

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serglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser

151015

glyglyglygly

20

<210>29

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

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151015

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202530

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

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gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglypheasnilelysaspthr

202530

tyrilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

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505560

lysglyargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

serargtrpglyglyaspglyphetyralametasptyrtrpglygln

100105110

glythrleuvalthrvalserser

115120

<210>31

<211>11

<212>prt

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<220>

<223>合成

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argalaserglnaspvalasnthralavalala

1510

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

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seralaserpheleutyrser

15

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<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

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glnglnhistyrthrthrproprothr

15

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<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

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aspthrtyrilehis

15

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<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

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151015

gly

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<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<212>prt

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151015

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100105

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<212>prt

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<220>

<223>合成

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glnvalglnleulysglnserglyproglyleuvalglnprosergln

151015

serleuserilethrcysthrvalserglypheserleuthrasntyr

202530

glyvalhistrpvalargglnserproglylysglyleuglutrpleu

354045

glyvaliletrpserglyglyasnthrasptyrasnthrprophethr

505560

serargleuserileasnlysaspasnserlysserglnvalphephe

65707580

lysmetasnserleuglnserasnaspthralailetyrtyrcysala

859095

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100105110

thrleuvalthrvalserala

115

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<211>11

<212>prt

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<220>

<223>合成

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1510

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<212>prt

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<220>

<223>合成

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15

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

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15

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<212>prt

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<220>

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asntyrglyvalhis

15

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<212>prt

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<220>

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valiletrpserglyglyasnthrasptyrasnthrprophethrser

151015

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<211>11

<212>prt

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<220>

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1510

<210>45

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

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alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys

151015

serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr

202530

pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser

354045

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505560

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100105110

proalaprogluleuleuglyglyproservalpheleuphepropro

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valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrp

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tyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglu

165170175

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180185190

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leuthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr

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<212>prt

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leuserservalvalthrvalproserserasnpheglythrglnthr

65707580

tyrthrcysasnvalasphislysproserasnthrlysvalasplys

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thrvalgluarglyscyscysvalglucysproprocysproalapro

100105110

provalalaglyproservalpheleupheproprolysprolysasp

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serthrpheargvalvalservalleuthrvalvalhisglnasptrp

180185190

leuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleupro

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260265270

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275280285

leuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercys

290295300

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305310315320

serleuserproglylys

325

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<212>prt

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<220>

<223>合成

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tyrthrcysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys

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100105110

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cysprogluprolyssercysaspthrproproprocysproargcys

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325330335

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lysserleuserleuserproglylys

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505560

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65707580

tyrthrcysasnvalasphislysproserasnthrlysvalasplys

859095

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100105110

glupheleuglyglyproservalpheleupheproprolysprolys

115120125

aspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalval

130135140

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leuserleuserleuglylys

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lysleuglnglulysglyiletyrlysalametserglupheaspile

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gly

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<210>69

<211>446

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>69

aspvalglnleuglngluserglyproserleuvallysprosergln

151015

serleuserleuthrcysthrvalthrglytyrserilethrserasp

202530

phealatrpasntrpileargglnpheproglyasnlysleuglutrp

354045

metglytyrilesertyrserglyasnthrargtyrasnproserleu

505560

lysserargileserilethrargaspthrserlysasnglnphephe

65707580

leuglnleuasnservalthrilegluaspthralathrtyrtyrcys

859095

valthralaglyargglypheprotyrtrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalseralaalaserthrlysglyproservalpheproleuala

115120125

proserserlysserthrserglyglythralaalaleuglycysleu

130135140

vallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnsergly

145150155160

alaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserser

165170175

glyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserserleu

180185190

glythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthr

195200205

lysvalasplysargvalgluprolyssercysasplysthrhisthr

210215220

cysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproservalphe

225230235240

leupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrpro

245250255

gluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluval

260265270

lyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthr

275280285

lysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalserval

290295300

leuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscys

305310315320

lysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthrileser

325330335

lysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleupropro

340345350

cysargaspgluleuthrlysasnglnvalserleutrpcysleuval

355360365

lysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasngly

370375380

glnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspserasp

385390395400

glyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrp

405410415

glnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhis

420425430

asnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

435440445

<210>70

<211>1338

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>70

gacgtgcagctgcaggagagcggccccagcctggtgaagcccagccagagcctgagcctg60

acctgcaccgtgaccggctacagcatcaccagcgacttcgcctggaactggatccgccag120

ttccccggcaacaagctggagtggatgggctacatcagctacagcggcaacacccgctac180

aaccccagcctgaagagccgcatcagcatcacccgcgacaccagcaagaaccagttcttc240

ctgcagctgaacagcgtgaccatcgaggacaccgccacctactactgcgtgaccgccggc300

cgcggcttcccctactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgccgccagcaccaag360

ggccccagcgtgttccccctggcccccagcagcaagagcaccagcggcggcaccgccgcc420

ctgggctgcctggtgaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggc480

gccctgaccagcggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagc540

ctgagcagcgtggtgaccgtgcccagcagcagcctgggcacccagacctacatctgcaac600

gtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagcgcgtggagcccaagagctgcgac660

aagacccacacctgccccccctgccccgcccccgagctgctgggcggccccagcgtgttc720

ctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccgcacccccgaggtgacctgc780

gtggtggtggacgtgagccacgaggaccccgaggtgaagttcaactggtacgtggacggc840

gtggaggtgcacaacgccaagaccaagccccgcgaggagcagtacaacagcacctaccgc900

gtggtgagcgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgc960

aaggtgagcaacaaggccctgcccgcccccatcgagaagaccatcagcaaggccaagggc1020

cagccccgcgagccccaggtgtacaccctgcccccctgccgcgacgagctgaccaagaac1080

caggtgagcctgtggtgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgg1140

gagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccccgtgctggacagcgac1200

ggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagagccgctggcagcagggcaac1260

gtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctg1320

agcctgagccccggcaag1338

<210>71

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>71

aspileleumetthrglnserprosersermetservalserleugly

151015

aspthrvalserilethrcyshisserserglnaspileasnserasn

202530

ileglytrpleuglnglnargproglylysserphelysglyleuile

354045

tyrhisglythrasnleuaspaspgluvalproserargphesergly

505560

serglyserglyalaasptyrserleuthrileserserleugluser

65707580

gluaspphealaasptyrtyrcysvalglntyralaglnpheprotrp

859095

thrpheglyglyglythrlysleugluilelys

100105

<210>72

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>72

aspvalglnleuglngluserglyproserleuvallysprosergln

151015

serleuserleuthrcysthrvalthrglytyrserilethrserasp

202530

phealatrpasntrpileargglnpheproglyasnlysleuglutrp

354045

metglytyrilesertyrserglyasnthrargtyrasnproserleu

505560

lysserargileserilethrargaspthrserlysasnglnphephe

65707580

leuglnleuasnservalthrilegluaspthralathrtyrtyrcys

859095

valthralaglyargglypheprotyrtrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserala

115

<210>73

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>73

hisserserglnaspileasnserasnilegly

1510

<210>74

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>74

hisglythrasnleuaspasp

15

<210>75

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>75

valglntyralaglnpheprotrpthr

15

<210>76

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>76

seraspphealatrpasn

15

<210>77

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>77

tyrilesertyrserglyasnthrargtyrasnproserleulysser

151015

<210>78

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>78

alaglyargglypheprotyr

15

<210>89

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>89

glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser

151015

<210>90

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>90

glyglyglyglyser

15

<210>91

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>91

glyalaproglygly

15