一种人中性粒细胞载脂蛋白同源二聚体的定量装置的制作方法

本实用新型属于免疫学检测
技术领域：
，具体涉及一种人中性粒细胞载脂蛋白(HNL)同源二聚体的快速定量装置。
背景技术：
：人中性粒细胞脂质运载蛋白(humanneutrophillipocalin,HNL)也称中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinaseassociatedlipocalin，NGAL)，又称脂质运载蛋白-2(Lipocalin-2)，是一种脂质运载蛋白(J.Biol.Chem.1993,268:10425-10432；Scand.J.Clin.Lab.Invest.1994,54:365-376)。HNL以单体、同源二聚体及异源二聚体(单体与MMP9分子形成)等多种分子形式存在，不同分子形式HNL与不同的病理过程有关。如单体HNL可能与急性肾损伤有相对较高的相关性(Clin.Chim.Acta.2009,403:121-125；Lancet2005,365:1231-1238；Biomed.Res.Int.2015,2009,186:48-51；Am.J.Nephrol.2004,24:307-315；中国实用医药2015,24:46-47)，异源二聚体HNL可能与肿瘤侵袭性有关。蔡林君等人研究发现同源二聚体HNL反映尿道感染情况(Clin.J.Am.Soc.Nephrol.2010)；此外，VengePer和XuS.Y.等人研究发现同源二聚体HNL对区分诊断急性细菌感染和病毒感染有很高的特异性和灵敏度(J.Immunol.Methods2015,424:85-90；J.Clin.Lab.Invest.1995，55:125-131)。相对其他分子形式HNL，同源二聚体对诊断急性细菌感染有较高的特异性和灵敏度，可能是因为参与急性细菌感染过程的中性粒细胞分泌的HNL主要是同源二聚体(Clin.Chim.Acta.2009,403:121-125)。目前已有多种HNL测定方法公开，如RIA(国际专利WO/1995/029404A1和中国ZL200980155194等)、ELISA(欧洲专利EP2225268和中国专利ZL200980155194等)、Western-blotting、胶乳免疫比浊法(中国专利ZL201410431182)、化学发光免疫分析法(中国专利申请号201510184818)、免疫层析试纸条技术(中国专利ZL201220323587、ZL201420423962、ZL201220392399、ZL201220497401、ZL201220323586和ZL201220497401)等。以上各种HNL定量方法有各自优缺点和相应用途，但除Western-blotting能区分不同分子形式HNL外，上述HNL定量方法均不能特异性定量同源二聚体HNL，从而影响该蛋白作为一些疾病如急性细菌感染的诊断能力。虽然，Western-blotting能区分不同分子形式HNL，但是由于该技术本身的缺陷限制了该方法的实际应用。如操作复杂、测试周期长、每次分析样品数量有限以及准确定量困难等。综上，目前实验室研究和将来可能的临床应用急需建立快速、特异性定量同源二聚体HNL的装置及相应方法。技术实现要素：为了实现人中性粒细胞载脂蛋白HNL同源二聚体分子的特异性定量，本实用新型设计并开发出了一种基于夹心ELISA技术的HNL同源二聚体的快速定量装置。该装置具有制备方法简单(只需一种抗NHL抗体)、使用快捷(孵育过程只有两步)、检测限低(0.1ng/mL，能满足体液样本中HNL的检出)等优异性能，在急性细菌感染等疾病早期诊断实验室研究和临床检验领域有极大应用潜力。为了实现上述目标，本实用新型采取如下技术方案：一种人中性粒细胞载脂蛋白(HNL)同源二聚体的定量装置，其特征在于：由储存5倍样品稀释液的容器、储存25倍洗液的容器、储存HNL同源二聚体标准品母液的容器、抗HNL抗体包被的96孔酶标板、储存酶标抗HNL抗体溶液的容器、U型底96孔板、封板膜、储存酶底物溶液的容器及储存终止液的容器组成，所述抗HNL抗体包被的96孔酶标板和酶标抗HNL抗体所使用的抗HNL抗体完全相同；所述抗HNL抗体为单克隆抗体，所述抗HNL单克隆抗体为商品化的抗HNL单克隆抗体(如Abcam公司的ab63929或P&MVengeDiagnosticsDevelopment公司的HNLmab697等)或通过常规方法以HNL单体或HNL同源二聚体免疫动物制备的抗HNL单克隆抗体或基因工程方法制备的抗HNL单克隆抗体，所述抗HNL单克隆抗体所识别的抗原表位在单体HNL上只有一个；所述酶标抗HNL抗体所标记的酶可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。所述定量装置经两步法实现HNL同源二聚体的快速定量，所述两步法是指装置整个使用过程中孵育过程只需两次，所述两次孵育过程第一次是指将酶标抗HNL抗体加入到抗HNL抗体包被的96孔酶标板后快速加入预先准备的标准品浓度梯度溶液和经稀释后的样品液孵育20～60min，所述两次孵育过程第二次是指第一次孵育后将抗HNL抗体包被的96孔酶标板经洗液工作液清洗后再加入酶底物溶液孵育10～20min后加入终止液；所述预先准备的标准品浓度梯度溶液是指HNL同源二聚体标准品母液经2倍法稀释后制成，所述经稀释后的样品液是指经样品稀释液工作液稀释后的体液样本，所述体液样本包括尿液、血清、血浆、脑脊液、唾液等。将5倍样品稀释液用去离子水稀释5倍获得样品稀释液工作液；将25倍洗液用去离子水稀释25倍制成洗液工作液。本实用新型装置组成、制备及使用方法如下：1)本实用新型装置组成表1为本实用新型装置组成，图1和图2为本装置各组成部分的示意图。表1：本实用新型装置组成序号名称数量1抗HNL抗体包被的96孔酶标板1块25倍样品稀释液1瓶(80mL)3HNL同源二聚体标准品母液1管(300μL)4酶标抗HNL抗体溶液1管(5.5mL)525倍洗液1瓶35mL6酶底物溶液1套7终止液1瓶12mL8常规U型底96孔板1块9封板膜1张2)制备方法a)抗HNL抗体包被的96孔酶标板的制备(1)抗HNL抗体包被96孔酶标板将抗HNL抗体用50mmol/LNa2CO3-NaHCO3，pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释到1～5μg/mL制成抗体包被液；向96孔酶标板每孔加入100μL抗体包被液，37℃孵育2h或室温孵育4h或4℃过夜。(2)封闭酶标板弃抗体包被液，然后向上述96孔酶标板每孔中加入200～300μL封闭液(封闭液为含2％BSA(wt/vol)的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3，pH9.6的碳酸钠缓冲液)；37℃孵育2h或室温孵育4h或4℃过夜。(3)固定酶标板弃封闭液，然后向96孔酶标板每孔中加入200～300μL固定液(固定液为含50％(wt/vol)蔗糖、50％(wt/vol)海藻糖或25％(wt/vol)蔗糖和25％(wt/vol)海藻糖的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3，pH9.6的碳酸钠缓冲液，室温固定30min～2h。(4)密封酶标板弃固定液，室温晾干或25～30℃真空干燥；将酶标板和袋装干燥剂放入锡箔纸袋内然后抽真空，4℃保存；通过以上方法制备的抗HNL抗体包被酶标板经过37℃加速试验，可以保存32天。根据阿罗尼乌斯公式(Arrheniusequation)，本方法制备的酶标板在4℃条件下可以保存天数＝32×48天＝1536天。b)5倍样品稀释液的制备为含有1％BSA(wt/vol)、0.5％Tween-20(vol/vol)、0.25％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(wt/vol)和0.1％NaN3(wt/vol)的磷酸根摩尔浓度为50mmol/L、pH7.4的PBS缓冲液。c)标准品母液的制备为含有0.1％BSA(wt/vol)、0.1％Tween-20(vol/vol)、0.05％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(wt/vol)、0.02％NaN3(wt/vol)和12.8μg/L同源二聚体HNL的磷酸根摩尔浓度为10mmol/L、pH7.4的PBS缓冲液。d)酶标抗HNL抗体溶液的制备酶标抗HNL抗体是通过常规的方法(Abcam的ab102850、ab102890、ab102887等)将辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)等酶分子共价标记在抗HNL抗体上。酶标抗HNL抗体溶液为含有1％BSA(wt/vol)、0.1％NaN3(wt/vol)和0.2～2μg/mL酶标抗HNL抗体的磷酸根摩尔浓度为50mmol/L、pH7.4的PBS缓冲液。e)25倍洗液的制备为含有2.5％Tween-20(vol/vol)的磷酸根摩尔浓度为250mmol/L、pH7.4的PBS缓冲液。f)酶底物溶液和终止液的制备对应酶标抗HNL抗体所标记的酶采用不同的酶底物溶液和终止液。该体系是已经公开的常规方法。如表2。表2：不同体系酶标抗体、酶底物溶液及对应终止液的组成3)使用方法装置的具体使用步骤如下：(1)取出上述制备的溶液、抗体包被的96孔酶标板等，放置于室温环境；(2)将5倍样品稀释液和25倍洗液用蒸馏水分别稀释5倍和25倍，制成样品稀释液工作液和洗液工作液；(3)将生物样品(血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液等)用样品稀释液工作液稀释(血清和血浆通常稀释50倍、尿液通常稀释25倍、唾液和脑脊液通常5～10倍稀释)，得到稀释后的样品液；(4)将同源二聚体HNL标准品母液用样品稀释液工作液进行2倍梯度稀释，制成标准品浓度梯度溶液；(5)将上述100μL标准品浓度梯度溶液和稀释后的样品液加至U型底96孔板；(6)将50μL酶标抗HNL抗体溶液加至抗HNL抗体包被的96孔酶标板；(7)用多道移液器取50μL步骤(5)制备的U型底96孔板每孔中的标准品浓度梯度溶液和稀释后的样品液加至步骤(6)中的96孔酶标板上；(8)用封板膜盖住96孔酶标板，将96孔酶标板放置于酶标板震荡器上，150～180rpm,室温孵育20～60min；(9)倾倒96孔酶标板中的物质，用洗液工作液对酶标板进行3～5次清洗；(10)向96孔酶标板每孔中加入酶底物溶液100μL，避光条件下孵育10～20min；(11)向96孔酶标板每孔中加入终止液100μL，轻轻混匀，30min内利用常规的分光光度计测定450nm处的吸光值。(12)以标准品浓度梯度溶液的浓度值为横纵标，以标准品浓度梯度溶液450nm处的吸光值为纵坐标作标准曲线，再根据标准曲线及样品液的450nm处的吸光值计算出样品中同源二聚体HNL的浓度。本实用新型根据夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)技术具有高通量、特异性强及普及率高等优点，制造了一种基于ELISA的人中性粒细胞载脂蛋白同源二聚体(HNL)的快速定量装置。由于采用了上述技术方案，本实用新型在以下两方面与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。第一，本实用新型根据HNL同源二聚体是由两个相同的单体HNL形成的特点，与单体HNL相比，HNL同源二聚体有两套相同的抗原表位，每个HNL同源二聚体可以和两个完全相同的抗体结合，而一个单体HNL只能和一个同样抗体结合；另外，HNL异二聚体是一个HNL分子与MMP9分子共价结合，因此一个HNL异二聚体也只有一个相同的抗原表位只能与一个分子的同样抗体结合。所以本实用新型采用相同的固相包被抗体和酶标抗体构建HNLELISA检测装置，该装置特异性检测出HNL同源二聚体，而对于HNL单体和异二聚体则不检出(图3)。本实用新型可用于以HNL同源二聚体为标志物的疾病(如急性细菌感染)的检测和监控，因此具有巨大的实验室研究和临床应用价值。第二，考虑到常规ELISA操作步骤繁多，测试周期较长，而临床实际应用时需要快速获得目标分子的浓度信息，因此本实用新型通过对固相抗体包被浓度、反应试剂配方、酶标抗体浓度、孵育时间等多种因素进行优化，从而建立了两步法检测HNL同源二聚体的夹心ELISA方法，整个使用过程中孵育只需两步和清洗只需一步。从而使用本装置具有制备简单、使用快捷等优点，本装置使用只需常规ELISA测试时间的1/4至1/3。这是本实用新型的另一个具创造性发明。附图说明图1：为本实用新型一种人中性粒细胞载脂蛋白(HNL)同源二聚体的定量装置的抗HNL抗体包被的96孔酶标板、常规U型底96孔板和封板膜示意图。20代表抗HNL抗体包被的96孔酶标板，由21(96孔板支架)和22(包被抗HNL抗体的孔)组成，一共12列，每列8孔，孔为平底，是夹心ELISA反应的场所；30代表常规U型底96孔板，其中31为96孔板支架，32为U型孔，一共12列，每列8孔，孔为U型底，用于标准品浓度梯度溶液和稀释后的样品液的准备；40为封板膜，具有粘性，可与粘贴在20表面，用于防止20孵育时里边液体的蒸发。图2为本实用新型一种人中性粒细胞载脂蛋白(HNL)同源二聚体的定量装置所需的各种溶液储存溶液示意图。51代表储存5倍样品稀释液的容器，为透明的塑料瓶；52代表储存25倍洗液的容器，为透明的塑料瓶；53代表储存酶标抗HNL抗体溶液的容器，为透明的塑料瓶；54代表储存HNL同源二聚体标准品母液的容器，为透明的塑料瓶；55和56代表储存酶底物溶液的容器，为不透明的塑料瓶，55和56容器的个数根据表2酶底物溶液的组成确定；57为储存终止液的容器，为透明的塑料瓶。图3为本实用新型一种人中性粒细胞载脂蛋白(HNL)同源二聚体的定量装置能特异性快速定量HNL的原理图。其中24代表用于抗体包被的96孔酶标板的一个孔，25代表用于包被96孔酶标板的抗HNL抗体，26代表酶标抗HNL抗体，27代表HNL同源二聚体，28代表HNL单体，29代表HNL与MMP-9形成的异源二聚体；25和26所述的抗HNL抗体为同一抗体，且在HNL单体上只有一个对应的表位；HNL单体28、HNL同源二聚体27和异源二聚体29都能与包被在24上的抗HNL抗体25结合，但由于28和29只有一个可与25特异性结合的表位，因此不能与26结合，而HNL同源二聚体27因为具有两个相同的表位，因此除了一个与25结合外，还可以与抗HNL酶标抗体26特异性结合，从而26利用其上所标记的酶催化酶底物溶液产生有色产物，进而利用分光光度计获取特定波长下产物的吸光度值。图4为本实用新型一种人中性粒细胞载脂蛋白(HNL)同源二聚体的定量装置的标准曲线。具体实施方式下面将用实施例进一步说明本实用新型。本实用新型实施例是用于本实用新型的进一步解释而不是对本实用新型的限定。根据本实用新型的构思和实质进行的具体变动和润饰均属于本实用新型要求保护的范围。实施例1：一种人中性粒细胞载脂蛋白同源二聚体的定量装置的组成本实施例装置包含如下试剂和材料(见表3)。表3：实施例1装置的组成序号名称数量1抗HNL抗体包被的96孔酶标板1块(96孔)25倍样品稀释液1瓶(80mL)3HNL同源二聚体标准品母液1管(300μL)4酶标抗HNL抗体(HRP-抗HNL抗体)1管(5.5mL)525倍洗液1瓶35mL6-ATMB底物溶液A1瓶(6mL)6-BTMB底物溶液B1瓶(6mL)72mol/LH2SO4终止液1瓶(12mL)8常规U型底96孔板1块(96孔)9封板膜1张10使用说明书1本实施例2：一种人中性粒细胞载脂蛋白同源二聚体的定量装置的组成本实施例装置包含如下试剂和材料(见表4)。表4：实施例2装置的组成序号名称数量1抗HNL抗体包被的96孔酶标板1块(96孔)25倍样品稀释液1瓶(80mL)3HNL同源二聚体标准品母液1管(300μL)4酶标抗HNL抗体(ALP-抗HNL抗体)1管(5.5mL)525倍洗液1瓶(35mL)6-A碱性磷酸酶缓冲溶液1瓶(15mL)6-BNBT溶液1管(200μL)6-CBCIP溶液1管(100μL)73mol/LNaOH1瓶12mL8常规U型底96孔板1块(96孔)9封板膜1张10使用说明书1本实施例3一种人中性粒细胞载脂蛋白同源二聚体的定量装置的抗HNL抗体包被的96孔酶标板的制备以实施例1所包含的抗HNL抗体包被的96孔酶标板为例来说明抗HNL抗体包被的96孔酶标板的制备步骤。具体步骤如下：(1)抗HNL抗体包被96孔酶标板将抗HNL单克隆抗体(Abcam公司的ab23477)用50mmol/LNa2CO3-NaHCO3，pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释到1μg/mL制成抗体包被液；向96孔酶标板(Nuncflat-bottom96wellplate)每孔加100μL抗体包被液；4℃过夜。(2)封闭酶标板弃抗体包被液；向96孔酶标板每孔加300μL封闭液(封闭液为含2％BSA(wt/vol)的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3，pH9.6的碳酸钠缓冲液)；37℃孵育2h。(3)固定酶标板弃固定液；向96孔酶标板每孔加300μL固定液(固定液为含50％(wt/vol)的蔗糖的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3,pH＝9.6的碳酸钠缓冲液；室温固定1h；(4)密封酶标板弃固定液液，25℃真空干燥；将酶标板和袋装干燥剂放入锡箔是袋内然后抽真空，4℃保存。实施例4：一种人中性粒细胞载脂蛋白同源二聚体的定量装置的酶标抗HNL抗体的制备本实施例以实施例1所包含的HRP-抗HNL抗体为例来说明酶标抗HNL抗体的制备步骤。本实施例采用过碘酸钠法将HRP与抗HNL单克隆抗体(Abcam公司的ab23477)共价连接制成酶标抗HNL抗体。具体步骤如下：(1)配制各种缓冲液a.0.1mol/L高碘酸钠(NaIO4)溶液:称取241mgNaIO4溶于10mL蒸馏水中。b.1mmol/L、pH＝4.4的醋酸钠(NaAc)缓冲液:取0.2mol/LNaAc(1.361克/50mL)3.7mL、0.2mol/L醋酸(HAc)溶液(0.601mL/50mL)6.3mL，加蒸馏水至2000mL。c.0.2mol/L、pH9.5碳酸盐缓冲液：Na2CO30.32克、NaHCO30.586克，加蒸馏水至50mL。d.0.01mol/L、pH9.5碳酸盐缓冲液：0.2mol/L、pH9.5碳酸盐缓冲液用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01mol/L、pH9.5碳酸盐缓冲液。e.4mg/mL硼氢化钠(NaBH4)溶液：使用时称取NaBH44mg溶于1mL蒸馏水中。f.0.1mol/L、pH7.4的PBS缓冲液：NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO4.12H2O3.58g、KH2PO40.24g、蒸馏水溶解定容至100毫升。g.酶标抗体保存缓冲液：将0.1mol/L、pH7.4的PBS缓冲液用蒸馏水稀释10倍得到0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液，加入0.2％BSA(wt/vol)、0.1％Tween-20(vol/vol)及0.02％NaN3(wt/vol)。(2)酶标抗体制备a.称取5mgHRP(Sigma公司，V900503)溶解于1mL蒸馏水中。b.加入0.2mL新配的0.1mol/LNaIO4溶液，室温下避光搅拌20min。c.将上述溶液装入透析袋中，用1mmol/L、pH＝4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。d.加20μl的0.2mol/L、pH＝9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.5，立即加入1mL、5mg/mL抗HNL单克隆抗体(Abcam公司的ab23477)0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2h。e.加0.1mL新配的4mg/mLNaBH4液，混匀，再置4℃、2h。f.将上述溶液液装入透析袋中，用0.1mol/L的PBS溶液透析，4℃、过夜。g.将透析袋里的抗体稀释在含酶标抗体保存缓冲液。h.计算酶标抗体浓度：HRP-抗HNL抗体量(mg/mL)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62。i.将HRP-抗HNL抗体配制成1mg/mL,分装保存在-20～-80℃环境；使用时将HRP-抗HNL抗体用样品稀释液稀释至0.5μg/mL。实施例5：一种人中性粒细胞载脂蛋白同源二聚体的定量装置的使用现以实施例1装置的使用为例说明本装置的具体使用步骤。(1)取出上述制备的溶液、抗体包被的96孔酶标板等，放置于室温环境平衡；(2)将5倍样品稀释液和25倍洗液用蒸馏水分别稀释5倍和25倍，制成样品稀释液工作液和洗液工作液。(3)将生物样品如尿液用样品稀释液工作液稀释25倍，得到稀释后的样品液。(4)将同源二聚体HNL标准品母液用样品稀释液工作液进行2倍法梯度稀释，制成标准品浓度梯度溶液。(5)将上述梯度浓度标准品浓度梯度溶液和稀释后的样品液各100μL至U型底96孔板。(6)将50μLHRP-抗HNL抗体加至96孔酶标板。(7)用多道移液器取50μL步骤(5)制备的U型底96孔板中的标准品梯度、相应对照溶液及样品至步骤(6)中的96孔酶标板上。(8)用封板膜盖住96孔酶标板，将酶标板放置于酶标板震荡器上，180rpm,室温孵育30min。(9)倾倒酶标板中的物质，用洗液工作液对酶标板进行3次清洗，最后一次清洗后将酶标板倒扣在吸水滤纸上10s。(10)在清洗结束前，将TMB底物溶液A和TMB底物溶液B分别通过颠倒试剂瓶混匀，取等体积溶液A和溶液B混匀制成TMB底物工作液。(11)加入100μLTMB底物工作液至96孔酶标板，盖上封板膜和锡箔纸，孵育15min；(12)加入100μL、2mol/LH2SO4的终止液，轻轻混匀30S，30min内利用常规的分光光度计以540nm波长为参考、读取450nm波长下的吸光值。(13)以浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线趋势线公式计算样品中HNL浓度。表5为实施例5装置测得的各浓度同源二聚体HNL标准品对应的450nm波长下的吸光度值，根据表5绘制参考标准曲线(如图4所示)表5：不同浓度同源二聚体HNL标准品浓度梯度溶液对应的450nm波长处的吸光度值同源二聚体HNL浓度(ng/mL)O.D.1O.D.2平均值00.0120.0090.01050.100.0380.0410.03950.200.0690.0690.0690.400.140.1320.1360.800.3180.3240.3211.600.6210.6030.6123.201.2651.2341.24956.402.3532.4012.377由表5可以得出本装置定量同源二聚体的浓度可低至0.1ng/mL，结合图4可以得出本装置定量同源二聚体的线性范围为0.1ng.mL～6.4ng/mL。本实施例装置的批内差异CV平均值为4.31％(范围0.54％～7.40％,n＝12)，批间差异CV平均值为7.96％(范围为1.69％～12.50％,n＝3)。通过向已知同源二聚体浓度(C0)的尿液中加入已知浓度(C1)的同源二聚体HNL、单体HNL及MMP9/HNL,利用本实施例获得尿溶液中的同源二聚体HNL的测定值浓度(C2)；理论值浓度为C3。根据公式(1)回收率1(％)＝C3÷C2×100％和公式(2)回收率2(％)＝(C2-C0)÷C1×100％计算得到以上分子在尿样中的回收率(表6)。表6：HNL同源二聚体、HNL单体及MMP9/HNL在尿液中的回收率表6数据显示本装置能特异性定量尿液样本中的HN同源二聚体L，而对HNL单体和HNL异源二聚体则几乎不检出。由此可以得出本方法具有很高的特异性和灵敏度。当前第1页1 2 3