柑橘类病毒cDNA二聚体及其侵染性克隆的快速制备新方法与流程

本发明属于分子生物学领域，涉及一种柑橘类病毒cdna二聚体及其侵染性克隆的快速制备新方法。

背景技术：

类病毒是一类246～401-nt大小的闭合环状的单链小分子rna，能在敏感寄主上引发严重病症，是一种重要的植物病原物。柑橘裂皮类病毒(citrusexocortisviroid,cevd)属于马铃薯块茎类病毒科(pospiviroidae)马铃薯块茎类病毒属(pospiviroid)，是柑橘裂皮病的病原，可在枳和枳橙砧木上引起严重的裂皮症状，是威胁世界柑橘产业发展的重要病害之一。柑橘树皮裂纹类病毒(citrusbarkcrackingviroid,cbcvd)属于马铃薯块茎类病毒科(pospiviroidae)椰子死亡类病毒属(cocadviroid)，可在无cevd的情况下与其他柑橘类病毒复合侵染枳橙砧木引起类似柑橘裂皮病的症状。由cbcvd引起的啤酒花矮缩病是啤酒花上一种毁灭性病害，症状包括叶片卷曲，黄化，过早开花和球果尺寸变小，干根腐烂，植株发育迟缓甚至死亡。

另外，前人研究表明，cevd和cbcvd在某些敏感寄主上存在交叉保护现象，然研究者对其互作机理尚不清楚。两种类病毒复合侵染能明显降低cevd在敏感砧木上的症状，这为预防柑橘裂皮病提供了交叉保护的新思路。最近研究表明，来源于类病毒的小rna在类病毒致病性上扮演了重要角色。前期研究表明，由cevd和cbcvd负链产生的小rna主要来自于两者基因组具有高度序列同源性的区域，分析交叉保护现象与这些小rna可能有紧密联系。

方便快捷的植物病原物侵染性克隆构建方法，是研究病原致病性的基础和保证，可用于植物和病原之间的互作，外源基因的表达以及由其引起的基因沉默研究等。类病毒侵染性克隆的构建方法可广泛应用在其侵染性研究，症状分析，致病性研究，以及类病毒在寄主中的移动途径研究等。

传统的类病毒构建方法操作步骤繁琐，耗时费力，且所用载体和试剂复杂多样，成本较高。以下是常见的类病毒侵染性克隆构建方法：选择合适的酶切位点设计引物扩增类病毒全长目标片段，克隆测序后筛选优势序列用于构建侵染性克隆，通常选用pgem-t载体，类病毒单体质粒构建完成后进行酶切并回收目的片段和载体(目的片段用于连接成二聚体，回收载体经脱磷后与二聚体进行连接)。将回收的单体片段加入连接酶后进行连接，得到含有类病毒全长二聚体的连接混合液，向此混合液中加入回收并且脱磷的载体，再一次进行连接处理。之后转化连接产物，涂板培养后挑选单克隆进行酶切或者菌液pcr鉴定，最后通过测序鉴定是否得到正确的二聚体重组质粒。根据插入片段的方向，选择合适的酶进行单酶切，使用rna聚合酶体外转录目标片段获得具有侵染活性的类病毒二聚体rna。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述技术问题，提供一种柑橘类病毒cdna二聚体及其侵染性克隆的快速制备新方法。

本发明实现其目的的技术方案为：

一种柑橘类病毒cdna二聚体的快速制备新方法，包括如下步骤：

(1)提取柑橘类病毒的总rna；

(2)利用一步法rt-pcr对提取的总rna进行扩增，pcr反应体系包括：primescript1stepenzymemix、mgcl2、类病毒全长扩增引物、总rna、无rna酶的水；扩增完毕即得柑橘类病毒cdna二聚体。

在上述技术方案中，所述的柑橘类病毒为cevd，使用的类病毒全长扩增引物对为：cevd-for/cevd-rev，引物序列为cevd-for：5'-ggaaacctggaggaagtcgag-3'，cevd-rev：5'-ccggggatccctgaaggactt-3'。

在上述技术方案中，所述的pcr反应体系总体积为25ul，由如下组分组成：2×one-stepbuffer12.5ul、25mm的mgcl23～5ul、10um的cevd-for0.4～0.6ul、10um的cevd-rev0.4～0.6ul、primescript1stepenzymemix0.2～1ul、总rna100～1000ng，余量为无rna酶的水。

在上述技术方案中，pcr反应条件为：50℃反转录30min；95℃酶灭活3min；然后95℃/30s，58℃/30s，68℃/1min，35个循环；最后68℃延伸10min。

在上述技术方案中，所述的柑橘类病毒为cbcvd，使用的类病毒全长扩增引物对为：cbcvd-for/cbcvd-rev，引物序列为cbcvd-for：5'-ggggaaatctcttcagac-3'，cbcvd-rev：5'-ggggatccctcttcaggt-3'。

所述的柑橘类病毒为cbcvd时，在利用总rna进行一步法rt-pcr扩增之前，先将总rna进行高温解链处理，其扩增效果会更好，得到的cdna二聚体更多，杂质更少。

所述的柑橘类病毒为cbcvd时，所述的pcr反应体系总体积为25ul，由如下组分组成：2×one-stepbuffer12.5ul、25mm的mgcl23～5ul、10um的cbcvd-for0.4～0.6ul、10um的cbcvd-rev0.4～0.6ul、primescript1stepenzymemix0.5ul、总rna100～1000ng，余量为无rna酶的水。8、如权利要求7所述的柑橘类病毒cdna二聚体的快速制备新方法，其特征在于，pcr反应条件为：55℃反转录30min；94℃酶灭活3min；然后94℃/30s，58℃/30s，68℃/45min，35个循环；最后68℃延伸7min。

一种柑橘类病毒侵染性克隆的快速制备新方法，先利用前述的方法制备得到柑橘类病毒cdna二聚体，然后将该二聚体克隆进t载体，获得包含该二聚体的连接产物，即得此柑橘类病毒的侵染性克隆。

所述的t载体为pgem-teasy载体。

本发明的有益效果是：

首次利用一步法rt-pcr直接扩增得到了类病毒的二聚体，并首次建立了本发明的快速有效的类病毒侵染性克隆构建新方法，通过对反应体系和扩增条件的创新性改进，一步法rt-pcr就可以直接扩增得到类病毒的二聚体，对二聚体纯化回收后连接进pgem-teasy载体里面，大肠杆菌转化，经测序分析筛选后提取质粒即可得到稳定有效的类病毒侵染性克隆载体，包含类病毒二聚体的质粒载体线性化后即可作为模板进行体外转录获得具有侵染活性的类病毒二聚体rna。

该方法快速、高效、稳定，方法独特，通过指示植物验证及分子生物学检测证明此种类病毒侵染性克隆构建新方法高效可行。操作者可以快速高效的完成类病毒侵染性克隆的构建工作，对在多种病原复合侵染情况下分离类病毒，并为接下来更深入的类病毒致病机理研究及类病毒与其他病原和寄主的互作关系研究提供基础和保证。

利用本发明方法建立的cevd和cbcvd的侵染性克隆，有效排除其它病原物的影响，为研究者探索二者之间在寄主上的拮抗机制提供基础和保障，同时本方法对于科研工作者研究cevd和cbcvd各自与寄主之间的互作及其致病机理都有重要的价值和意义。

附图说明

图1是cevd和cbcvd的总rna分别通过一步法rt-pcr获取的二聚体产物，其中，m：dl2000；1和3：健康对照；2：cevd阳性；4：cbcvd阳性。

图2是cevd或cbcvd全长二聚体cdna序列插入进t载体序列中的示意图。

图3是体外转录cevd/cbcvd二聚体rna接种指示植物香橼后的症状表现，其中，a为健康香橼,b为cevd接毒香橼,c为cbcvd接毒香橼。

图4是cevd/cbcvd二聚体rna接种植物的一步法rt-pcr验证，其中，m：dl2000，1、5：健康对照，2：cevd阳性，3：cevd接毒香橼，4：cevd接毒番茄，6：cbcvd阳性，7：cbcvd接毒香橼。

图5是利用地高辛标记探针法检测cevd接毒番茄的northernblot结果，其中，a为northernblot结果，b为rna质量检测结果，在a/b中，1：健康番茄，2：cevd接毒番茄。

具体实施方式

实施例1类病毒资源和一步法rt-pcr

cevd毒源取自脐橙‘眉山9号’，cbcvd毒源取自杂柑‘朱见’。利用植物rna快速提取试剂盒(或trizol法)提取植物叶片总rna。设计特异性引物，利用primescript^tm一步法rt-pcr试剂盒(货号：rr055a,takara公司,中国大连)直接扩增所需类病毒二聚体全长序列。本发明中所用cevd特异性引物对为cevd-for(5'-ggaaacctggaggaagtcgag-3')和cevd-rev(5'-ccggggatccctgaaggactt-3')，cbcvd特异性引物对为cbcvd-for:(5'-ggggaaatctcttcagac-3')和cbcvd-rev(5'-ggggatccctcttcaggt-3')。

利用获得的总rna直接进行一步法rt-pcr扩增cevd，具体反应体系及扩增条件如下：

1、cevd反应体系：

cevd扩增条件：50℃反转录30min；95℃酶灭活3min；然后95℃/30s，58℃/30s，68℃/1min，35个循环；最后68℃延伸10min。取5ulpcr产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，经eb染色后，使用凝胶成像系统观察结果，结果见图1所示。

2、对于cbcvd，一步法rt-pcr扩增cbcvd前还需进行高温解链处理，解链具体反应体系及解链条件如下：

cbcvd解链反应体系：

cbcvd解链反应条件：94℃解链5min,冰上冷却2min。

接下来进行一步法rt-pcr扩增cbcvd，具体反应体系及扩增条件如下：

cbcvd反应体系：

cbcvd扩增条件：55℃反转录30min；94℃酶灭活3min；然后94℃/30s，58℃/30s，68℃/45min，35个循环；最后68℃延伸7min。取5ulpcr产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，经eb染色后，使用凝胶成像系统观察结果(结果见图1)。

实施例2cevd/cbcvd二聚体克隆载体的构建及体外转录

将实施例1中经一步法rt-pcr获得的cevd/cbcvd二聚体纯化后克隆进pgem-teasy载体获得包含cevd/cbcvd二聚体的连接产物，其原理如图2所示，t7启动子位点和spei位点被用来合成cevd或cbcvd二聚体rna。转化进感受态细胞大肠杆菌dh5α中进行扩增，菌液测序判定所需的cevd/cbcvd二聚体的优势序列及插入方向。提取质粒，限制性内切酶spei线性化质粒后用乙醇进行纯化处理。二聚体纯化、克隆、转化感受态、质粒线性化等步骤按照相关试剂的操作说明操作即可。

spei线性化质粒后用乙醇进行纯化处理方法：

首先将得到的混合液用灭菌双蒸水补足100ul,后进行如下处理：

混匀后-20℃冷却20min,高速(推荐13000r)离心15min,倒掉上清液，高速(推荐13000r)2min,除去残留液体，加适量双蒸灭菌水(推荐15ul)。

这些纯化后的包含cevd/cbcvd二聚体优势序列的线性化质粒将用来作为模板进行体外转录，使用t7rna聚合酶(megascriptt7transcriptionkit,invitrogen^tm)获得具有侵染活性的cevd/cbcvd二聚体rna。

实施例3体外转录产物活性验证

将经体外转录获得的cevd/cbcvd二聚体rna用稀释液(100mmtris-hcl,10mmedta,ph7.5)稀释到500ng/ul,将cevd和cbcvd体外转录产物刀割接种木本指示植物香橼和将cevd体外转录产物摩擦接种草本寄主番茄，四个月后观察被侵染香橼症状(结果见图3)和rt-pcr检测(结果见图4)，并提取草本寄主番茄的叶片总rna运用地高辛标记探针法进行northernblot实验进一步验证cevd表达活性(结果见图5)。

结果表明，cevd接毒香橼表现出典型的cevd侵染症状，cevd接毒番茄northern杂交信号明显，rt-pcr检测结果呈阳性，说明构建的cevd侵染性克隆体外转录产物能够完成系统侵染木本寄主香橼和草本寄主番茄；同时，cbcvd接毒香橼表现出典型的cbcvd侵染症状，rt-pcr检测结果呈阳性，说明构建的cbcvd侵染性克隆体外转录产物也能够完成系统侵染木本寄主香橼。综上指示植物验证及分子生物学检测结果足以证明此种类病毒侵染性克隆构建新方法切实可行。

序列表

<110>西南大学

<120>柑橘类病毒cdna二聚体及其侵染性克隆的快速制备新方法

<160>4

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>cevd-for

<400>1

ggaaacctggaggaagtcgag21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>cevd-rev

<400>2

ccggggatccctgaaggactt21

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<223>cbcvd-for

<400>3

ggggaaatctcttcagac18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<223>cbcvd-rev

<400>4

ggggatccctcttcaggt18