用于悬浮培养的方法和系统与流程

本发明涉及诸如柔性细胞袋生物反应器之类的生物反应器中的细胞培养。更详尽地，本发明涉及用于确定生物反应器培养物中的细胞密度且用于控制生物反应器中的细胞的悬浮培养物的灌注速率的方法和系统，所述方法和系统包括测量非静止的生物反应器中的原代单核细胞的氧摄取量。发明背景柔性细胞培养袋当前用于培养且扩增原代外周血单核细胞（具体地，T细胞），以便移植至患者中。细胞在所包含的细胞袋内生长，并且，通过使用培养基灌注而实现高细胞密度，其中，将新鲜的培养基添加至培养物，并且，将用过的培养基去除。培养基灌注的速率取决于细胞袋内的细胞的浓度，随着细胞浓度增加，灌注速率提高。对所培养的细胞的生长速率和浓度的监测要求从细胞袋采样。在打开时，采样口使培养物暴露于外部环境，这带来培养物的污染风险。存在为了监测悬浮培养物中生长的细胞的细胞生长而开发的各种联机（原位）细胞计数器。这些细胞计数器包括光学探针（例如聚焦束反射率测量（FBRM）探针和颗粒视觉测量（PVM）系统）以及原位显微镜。然而，这些装置全都要求探针从外部源浸入培养物中，这损害无菌性。这些解决方案同样地大而昂贵，并且，将难以结合至细胞袋中。这些装置设计成与不锈钢的生物反应器一起使用，而不是柔性细胞袋。可获得测量生物反应器培养物中的溶解氧（DO）的pH和水平的光学探针。溶解氧读数能够用于确定生物反应器培养物的氧摄取速率（OUR）。理解到，诸如，在例如Eur.JApplMicrobiolBiotechnol（1981）12:193-197中所描述的，氧摄取速率与细胞浓度相关，这表明，培养物中的细胞数越大，OUR读数就越高。所述方法涉及用于蛋白质产生的无限增殖(immortalised)的细胞系的培养，其中，维持恒定的高水平的溶解氧是优先的。溶解氧读数用于确定是否应当提高生物反应器的搅拌速率或是否要求氧喷洒以将DO水平保持为高于标称临界水平。将期望不损害细胞或封闭的培养环境的监测细胞生长且调节敏感细胞的灌注速率的方法。发明概述本发明人已发现，在悬浮培养物中培养的原代细胞的溶解氧浓度与细胞密度之间存在相反线性关系。随着细胞数增加，溶解氧的浓度下降。该关系允许基于溶解氧读数而预测细胞浓度，从而否认使用采样口的需要。在本发明中，氧摄取量的读数用于设定培养基灌注速率。因而，在第一方面，本发明涉及用于调节非静止的生物反应器中的细胞的悬浮培养物中的灌注速率的方法，所述方法包括：记录生物反应器中的原代单核细胞的氧摄取量；通过所述记录的氧摄取量与细胞数的预先确定的相关性而预测所述原代单核细胞的细胞数；和响应于所述记录的氧摄取量而控制灌注速率。所述方法可应用于任何类型的摇摆、搅动或搅拌式生物反应器中的悬浮培养。优选地，至少在氧摄取量的记录期间，生物反应器优选地保持在恒定的摇摆速率。所记录的氧摄取量是测量随着时间的推移而出现的溶解氧的改变的溶解氧（DO）摄取量或氧摄取速率（OUR）。在所述方法的优选的实施方案中，测量DO摄取量。优选地，通过结合于生物反应器中的传感器测量氧摄取量。传感器优选地是诸如在细胞袋的底部中嵌入生物反应器中的光学传感器。可以从外部附接电缆，其通向控制的计算机。将连续地取得和记录测量值。不需要操作生物反应器/细胞袋。优选地，生物反应器的摇摆速率为1-25rpm，更优选地，10-15rpm。本发明的方法尤其适合于T细胞或其他敏感细胞的悬浮培养。在优选的实施方案中，所记录的氧摄取量是溶解氧（DO），摇摆速率是10-15rpm，并且，生物反应器是柔性细胞袋。在第二方面，本发明涉及生物反应器系统，所述系统包括计算机终端（1）、生物反应器控制单元（2）、气体输出线（3）、传感器电缆（4）、细胞扩增系统（5）、摇摆平台（6）、生物反应器（7）、进气口（8）、用于测量氧摄取量的诸如光学探针之类的传感器（9）、培养基废料线（10）、培养基进料线（11）以及泵单元（12）、培养基原料储器（13）和培养基废料储器（14），其中，泵单元、细胞扩增系统以及生物反应器控制单元与计算机终端（1）连接，计算机终端（1）响应于氧摄取量读数而对泵单元运行的速率进行控制，该速率对培养基交换的速率进行控制。传感器（9）可以是光学探针或电化学探针。在生物反应器系统的优选的实施方案中，传感器（9）测量溶解氧（DO）或氧摄取速率（OUR）。优选地，传感器是测量DO且嵌入柔性细胞袋的底部中的光学探针。本发明提出了使用溶解氧（DO）读数或氧摄取速率（OUR）来指导灌注方案的能力。在本发明的实施方案中，可以基于DO或OUR读数而（通过编写软件程序）使灌注自动化。使用溶解氧读数来设定灌注速率以代替细胞计数还使该过程能够自动化且否认手动改变灌注设定的需要，这降低损害培养物的人为错误的机会。附图简述图1示出在设定在生物反应器平台的6o角度和15rpm的摇摆速率的XuriTM生物反应器上，1L培养物中的溶解氧（DO）浓度与原代人类T细胞的浓度之间的反线性关系的数据；图2示出当XuriTM生物反应器设定在10rpm的摇摆速率且设定在6o角度时，DO与细胞浓度之间的关系；图3是根据本发明的生物反应器系统的示意图，并且，示出本发明的主要特征；图4是在图3的生物反应器系统中使用的细胞袋的示意图。发明详述现在，将与附图和一些非限制的实施例相关联而更详尽地描述本发明。本发明是预测在原位的生物反应器中生长的原代淋巴细胞的密度的方法。本发明使用溶解氧浓度与细胞浓度之间的线性关系来预测生物反应器培养物中的细胞密度。本发明允许基于溶解氧浓度而设定灌注速率。将允许基于溶解氧读数而调节灌注速率的程序能够编写成使任何所选择的生物反应器运行的软件。以前从未针对原代单核细胞而示出DO/OUR与细胞浓度之间的线性关系。该关系意料不到地紧密，并且，由于该紧密性而可以将该关系结合至诸如WAVE或XuriTM生物反应器之类的生物反应器的软件控制中。这意味着，能够对细胞数进行预测，并且，能够改变灌注速率，而不必从细胞袋取样。在图3中示出本发明的生物反应器系统的优选的实施例，其中，（1）是计算机终端，（2）是细胞袋生物反应器控制单元，（3）是气体输出线，（4）是DO光缆，（5）是XuriTM细胞扩增系统，（6）是摇摆平台，（7）是细胞袋生物反应器，（8）是进气口，（9）是用于测量DO的光学探针，（10）是培养基废料线，（11）是培养基进料线，并且，（12）是泵单元，（13）是培养基原料储器，并且，（14）是培养基废料储器。泵单元、XuriTM细胞扩增系统以及细胞袋生物反应器控制单元与计算机终端连接。计算机终端中的软件对泵单元运行的速率进行控制，该速率对培养基交换的速率进行控制。图4示出在图3的生物反应器系统中使用的细胞袋，所述细胞袋由以下部件组成：（15）用于附接至摇摆平台的紧固杆；（16）进料线；（17）废料线；（18）排气管；（19）进气管；（20）灌注过滤器；（21）测量溶解氧的光学探针；（22）采收口；以及（23）采样口。灌注过滤器位于细胞袋的内部。DO探针嵌入细胞袋的底部中，并且，与培养环境直接接触。实施例1：限定溶解氧水平与细胞浓度之间的关系方法：在静态培养物中，用抗CD3/28活化珠和20ng/ml的IL-2培养外周血单核细胞长达5天。在静态培养物期间，通过添加培养基而将细胞浓度维持在5x10E05/ml。在培养的第5天，将细胞转移至2L的细胞袋，以便在XuriW25生物反应器上再培养5-9天。通过添加培养基而将细胞维持在5x10E05/ml，直到达到1L的最终体积，此后，允许随着细胞继续增殖而使细胞浓度增加。摇摆平台设定在6o角度和15rpm的摇摆速率，并且，在整个培养过程中，保持恒定。一旦细胞浓度达到了2x10E06/ml，就能够培养基灌注。细胞袋包含用于溶解氧（DO）的光学传感器，且在进行细胞计数的同时，每隔24小时记录DO水平测量值。从7个独立实验编制这些数据，各个实验使用不同的供体。绘制DO相对于细胞浓度的图，并且，确定线性趋势线（图1）。在该实施例中，趋势线的式为：DO=-1.58E-06*细胞密度+90.01使用该式，给定的培养物的细胞密度能够由在培养周期期间的任何点处的DO读数而预测，前提是摇摆速率维持在15rpm且摇摆角度维持在6o。针对摇摆平台设定在10rpm和6o的培养物（图2）而生成相同的数据。使用2个供体由两个单独实验编制数据。绘制DO相对于细胞浓度的图，并且，用式来生成趋势线。在该实施例中，趋势线的式为：DO=-2.88E-06*细胞密度+89.81这些数据表明，线的斜率取决于生物反应器的摇摆速率。因此，为了使用这些式来预测细胞密度，在整个培养周期中，摇摆条件必须保持恒定。实施例2：基于溶解氧读数而预测灌注速率能够进一步开发使用DO来预测细胞密度的能力以包括设定T细胞培养物中的灌注速率的自动化方法。由细胞密度指示灌注速率，因为，细胞数越高，代谢负荷就越高，并且，所要求的培养基交换的速率就越大。在上文的实验中使用的标准灌注速率如下。细胞浓度灌注速率2x106/ml500ml/天10x106/ml750ml/天15x106/ml1000ml/天基于DO相对于细胞浓度的趋势线，代替细胞浓度而使用DO读数能够设定灌注速率。在15rpm下的DO读数在10rpm下的Do读数灌注速率>88>84无75-8861-84500ml/天67-7547-61750ml/天<67<471000ml/天能够构造自动化装置（图3），由此，经由嵌入细胞袋生物反应器（图4）中的DO光学传感器而在整个培养过程中连续地收集的DO读数由软件记录，并且，然后，软件调节泵速率，泵速率对将灌注于细胞袋生物反应器中的培养基的量进行控制。这将消除在培养周期期间由操作人员手动改变灌注速率的需要。在开始生物反应器培养时，将要求操作人员基于如上表中所举例说明的DO读数而指导软件使用哪个灌注速率，但此后将不要求来自操作人员的进一步输入。当前第1页1 2 3