一种从毛叶香茶菜中制备冬凌草甲素的方法与流程

本发明涉及医药领域，特别是一种从毛叶香茶菜中制备冬凌草甲素的方法。

背景技术：
毛叶香荼菜为唇形科香茶菜属植物毛叶香茶菜的干燥全草，民间称为四棱杆、山苏子、延命草。具有清热解毒、活血消肿之功效。长期以来，我国民间用作抗菌消炎草药，全草入药，治肝炎、咽炎、乳腺炎、闭经、跌打损伤、关节疼痛及蛇虫咬伤。为冬凌草的同科同属植物，在我国江苏、河南、山西、陕西均有分布。化学成分提示该植物中冬凌草甲素的含量远高于冬凌草中冬凌草甲素的含量。但如何从毛叶香茶菜中快速、高效的将冬凌草甲素制备出来，至今未见有公开报道。冬凌草甲素为冬凌草的主要活性物质，2015版《中国药典》中冬凌草药材及以冬凌草为主要原料的中成药冬凌草片的质量指标成分均为冬凌草甲素。冬凌草甲素具有明显的抗癌、消炎、抗菌和中枢神经等多种药理作用，临床试验证明该化合物具有独特而明显的抗癌效果，尤其对食管癌和贲门癌有特效，且无毒或弱毒，对人体重要脏器如骨髓、肝、肾等无明显损伤，目前作为一类药正在进行临床研究。有文献报道，以冬凌草为原料采用大孔吸附树脂法制备冬凌草甲素的方法，大孔吸附树脂虽然价格相对较便宜，但其选择性及定向富集能力均较差，因此，大孔吸附树脂多用于有效组分的制备。用于单体化合物的制备必然辅助以柱层析法、有机溶剂萃取法等多种方法。所以，制备工艺繁琐、重现性差、成品纯度及得率均较低。因此，研制出制备冬凌草甲素的方法势在必行。

技术实现要素：
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从毛叶香茶菜中制备冬凌草甲素的方法，可有效解决高效、快速、重现度高的从毛叶香茶菜中提取冬凌草甲素的问题。本发明解决的技术方案是，该冬凌草甲素的分子结构式为：由以下步骤实现：1)上样溶液的制备：将毛叶香茶菜干燥药材，粉碎，过40-80目筛，每次加毛叶香茶菜重量的10-12倍质量浓度为50-95％的乙醇,加热回流提取3次，每次1-2h，合并3次提取液，减压回收至无醇味，加水分散，得水分散液，水分散液浓度相当于1-2g/mL生药，即得上样液(浓度相当于生药材1-2g/ml)；2)树脂预处理：方法是，将树脂用甲醇浸泡24h后，用体积浓度为15-20％的甲醇浸泡12h，每2h置换一次甲醇，湿法装柱，再用体积浓度为15-20％的甲醇洗脱2个柱体积，得预处理好的树脂；3)粗冬凌草甲素的制备：将步骤2)预处理好的树脂湿法装柱，使树脂床径高比达1︰10-15，再将步骤1)中的上样液通过树脂柱，以自然流速进行动态吸附，吸附完后，树脂柱先用1-2倍柱体积15-20％甲醇水洗脱，再用2-4倍柱体积的体积浓度为30％的乙醇洗脱，收集体积浓度为30％乙醇的洗脱液，减压回收乙醇，得相对密度1.2-1.4的稠浸膏；4)冬凌草甲素的纯化：将稠浸膏加溶剂15-25ml溶解，在-20℃-30℃下静置24-72h，析出白色粉末状结晶，过滤，得白色结晶状粉末，上清液继续在-20℃-30℃下静置24-72h，析出白色粉末状结晶，过滤，得白色结晶状粉末，合并两次白色结晶状粉末，制得冬凌草甲素；所述的溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙腈或丙酮的一种。本发明以价格低廉的毛叶香茶菜为原料，采用凝胶树脂柱层析法进行纯化，建立了一种工艺简单，重现性好的高纯度冬凌草甲素的制备方法，方法简单，易操作，生产效率高，重现性好，制得冬凌草甲素质量好，纯度高，是冬凌草甲素制备上的一大创新。附图说明图1为本发明的冬凌草甲素的分子结构图。图2为本发明冬凌草甲素的高效液相色谱图。具体实施方式以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。实施例11)上样液的制备：毛叶香茶菜干燥药材1kg粉碎，过40目药典筛，每次加质量浓度为95％的乙醇10L，提取3次，每次1.5h，合并3次提取液，减压回收溶剂至无醇味，加水分散，减压回收溶剂至无醇味，加水分散，在3600r/min下离心30min，倾取上清液，不溶物加100ml体积浓度为15％的乙醇溶解，在3600r/min下离心30min，合并两次上清液制得上样液(浓度相当于生药材1g/ml)；2)树脂预处理：方法是，SephadexLH-20树脂用甲醇浸泡24h后，倾去甲醇液，用体积浓度为15％的甲醇浸泡12h，每2h置换一次溶剂，湿法装柱，用体积浓度为15％的甲醇洗脱2个柱体积，得预处理好的SephadexLH-20树脂；3)装柱与上样：将步骤2)预处理好的树脂湿法装柱，于内径为5cm的层析柱，使树脂床径高比达1︰15，再将步骤1)中的上样液1000ml自然流速通过树脂柱吸附完全；4)分离纯化：树脂柱先用体积浓度为15％的甲醇洗脱1500ml，再用30％的甲醇洗脱4000ml，收集体积浓度为30％甲醇的洗脱液，减压回收溶剂，得相对密度为1.243的稠浸膏；5)重结晶：将上述稠浸膏用20ml甲醇溶解，在-20℃-35℃下静置24-72h，去除上清液，析出白色粉末状结晶，过滤，得白色结晶状粉末，上清液继续放置24-72h，析出白色粉末状结晶，过滤，得白色结晶状粉末，合并两次白色结晶状粉末，即得冬凌草甲素0.523g，采用HPLC法面积归一化法计算其纯度大于96.81％(纯度大于95％的冬凌草甲素又称冬凌草甲素单体化合物)。实施例21)上样液的制备：毛叶香茶菜干燥药材1kg，粉碎，过60目药典筛，每次加质量浓度为95％的乙醇12L，提取3次，每次2h，合并3次提取液，减压回收溶剂至无醇味，加水分散，减压回收溶剂至无醇味，加水分散，在3600r/min下离心30min，倾取上清液，不溶物加200ml体积浓度为20％的乙醇溶解，在3600r/min下离心30min，合并两次上清液制得上样液(浓度相当于生药材2g/ml)；2)树脂预处理：方法是，SephadexG树脂用甲醇浸泡24h，倾去甲醇液，用20％的甲醇浸泡12h，每2h置换一次溶剂，湿法装柱，用体积浓度为20％的甲醇洗脱2个柱体积，得预处理好的SephadexG树脂；3)装柱与上样：将步骤2)预处理好的树脂湿法装柱，于内径为5cm的层析柱，使树脂床径高比达1︰15，再将步骤1)中的上样液500mL自然流速通过树脂柱，吸附完全；4)分离纯化：树脂柱先用体积浓度为20％的甲醇洗脱1000ml，再用30％的甲醇洗脱3000ml，收集体积浓度为30％甲醇的洗脱液，减压回收溶剂，得相对密度为1.321的稠浸膏；5)重结晶：将上述稠浸膏用乙醇溶解20ml，在-20℃-35℃下静置24-72h，去除上清液，析出白色粉末状结晶，过滤，得白色结晶状粉末，上清液继续放置24-72h，析出白色粉末状结晶，过滤，得到白色结晶状粉末，合并上述白色结晶状粉末，制得冬凌草甲素0.5021g，采用HPLC法面积归一化法计算其纯度大于95.12％。实施例31)上样液的制备：毛叶香茶菜干燥药材1kg，粉碎，过80目药典筛，每次加质量浓度为75％的乙醇12L，提取3次，每次2h，合并3次提取液，减压回收溶剂至无醇味，加水分散，减压回收溶剂至无醇味，加水分散，在3600r/min下离心30min，倾取上清液，不溶物加800ml体积浓度为20％的乙醇溶解，在3600r/min下离心30min，合并两次上清液制得上样液(浓度相当于生药材1.25g/ml)；2)树脂预处理：方法是，MCI树脂用甲醇浸泡24h后，倾去甲醇液，用20％的甲醇浸泡12h，每2h置换一次溶剂，湿法装柱，用体积浓度为20％的甲醇洗脱2个柱体积，得预处理好的MCI树脂；3)装柱与上样：将步骤2)预处理好的树脂湿法装柱，于内径为5cm的层析柱，使树脂床径高比达1︰15，再将步骤1)中的上样液800ml自然流速通过树脂柱，吸附完全；4)分离纯化：树脂柱先用体积浓度为20％的甲醇洗脱2000ml，再用30％的甲醇洗脱3000ml，收集体积浓度为30％甲醇的洗脱液，减压回收溶剂，得相对密度1.246稠浸膏；5)重结晶：将上述稠浸膏用20ml丙醇溶解，在-20℃-35℃下静置24-72h，去除上清液，析出白色粉末状结晶，过滤，得白色结晶状粉末，上清液继续放置24-72h，析出白色粉末状结晶，过滤，得白色结晶状粉末，合并两次白色结晶状粉末，即制得冬凌草甲素0.489g，采用HPLC法面积归一化法计算其纯度大于96.87％(纯度大于95％的冬凌草甲素又称冬凌草甲素单体化合物)。实施例41)上样液的制备：毛叶香茶菜干燥药材1kg，粉碎，过80目药典筛，每次加质量浓度为50％的乙醇12L，提取3次，每次1.5h，合并3次提取液，减压回收溶剂至无醇味，加水分散，减压回收溶剂至无醇味，加水分散，在3600r/min下离心30min，倾取上清液，不溶物加500ml体积浓度为20％的乙醇溶解，在3600r/min下离心30min，合并两次上清液制得上样液(浓度相当于生药材1g/ml)；2)树脂预处理：方法是，SephadexLH-20树脂用甲醇浸泡24h后，倾去甲醇液，用20％的甲醇浸泡12h，每2h置换一次溶剂，湿法装柱，用体积浓度为20％的甲醇洗脱2个柱体积，得预处理好的SephadexLH-20树脂；3)装柱与上样：将步骤2)预处理好的树脂湿法装柱，于内径为5cm的层析柱，使树脂床径高比达1︰10，再将步骤1)中的上样液1L自然流速通过树脂柱，吸附完全；4)分离纯化：树脂柱先用体积浓度为20％的甲醇洗脱1.9L，再用30％的甲醇洗脱4000ml，收集体积浓度为30％甲醇的洗脱液，减压回收溶剂，得相对密度为1.321的稠浸膏；5)重结晶：将上述稠浸膏用异丙醇溶解20ml，在-20℃-35℃下静置24-72h，析出白色粉末状结晶，过滤，得到白色结晶状粉末，上清液继续静置24-72h，析出白色粉末状结晶，过滤，得到白色结晶状粉末，合并上述白色结晶状粉末，即得冬凌草甲素0.549g，采用HPLC法面积归一化法计算其纯度大于95.02％。上述制备的提取物经色谱分析测定(见图2)，其结构式为图1所示，确定为冬凌草甲素，白色结晶(甲醇)，mp：248-250℃，能溶于氯仿等有机溶剂，不溶于水，茴香醛-浓硫酸喷雾，110℃加热，显蓝色，于紫外254nm下观察有暗斑。13C-NMR(125MHz,CDCl3)共给出20个碳信号，其中6个连氧的碳信号(包括1个酮羰基)；根据NMR谱δH6.17(1H,s)和5.55(lH,s)为C-17位末端烯键上的两个质子信号；δC207.3、151.3和120.9分别是C-15位、C-16位和C-17位的信号；δH1.12(3H,s)和1.12(3H,s)为的两个偕碳角甲基信号，提示化合物基本骨架为ent-kaur-16-en-15-one。根据对映-贝壳杉烷型二萜的化学位移、裂分情况和偶合常数规律，3.75(1H,dd,7.9,11.7)是C-1上β位的质子信号；δH3.45(1H,d,7.8)是C-6上α位的质子信号；δH4.89(1H,s)是C-14处α位的质子信号；δH4.29(1H,d,9.1)和4.07(1H,d,10.2)为C-20位的一对AB耦合的质子信号；13C-NMR谱中δC74.7、δC73.8、δC97.2、δC72.4分別为C-1、C-6、C-7和C-14位连有羟基的碳信号；将化合物15的核磁数同冬凌草甲素的文献值对比，数据一致，确定为化合物为冬凌草甲素(Oridonin)，分子式为C20H28O6，详细信息见表1。Table1.NMRdataforcompound15inCDCl3(JinHz)由于冬凌草甲素在不同的药用植物中分布的质和量是有差异的，本发明的关键是结合冬凌草甲素在毛叶香茶菜中分布特点，避开操作繁琐、毒性大、效率低、可重复性差的纯化方法。大量、快速制备高纯度冬凌草甲素，具有较高的技术创新性。为制药工业提供一种经济的医药原材料，为药品监管部门提供高纯度的对照品。以毛叶香茶菜为原料，提供了一种廉价的制备冬凌草甲素的新材料。本发明制备的冬凌草甲素采用常规方法(即现有球松素活性试验方法)实验证明，本发明制备的冬凌草甲素具有：1.冬凌草甲素对小鼠移植肉瘤S180实体型性肿瘤具体明显的抑制作用，对脑瘤(B-22)有一定的抑制作用；能显著延长荷瘤小鼠存活期，并且无毒副作用；2.冬凌草甲素对荷瘤肝癌腹水型小鼠有明显抑制活性,能够明显延长荷瘤小鼠存活期。3.细胞毒实验结果表明，冬凌草甲素对HCT-116、HepG2、BGC-823、A2780细胞均有显著的细胞毒作用。与现有技术相比，具有以下突出的有益技术效果：1、本发明的创新性之一是，寻找了一种代替冬凌草制备冬凌草甲素的新原料。2、能结合冬凌草甲素在毛叶香茶菜中质和量的分布特点及冬凌草甲素的理化性质而研制的一种仅用1次柱层析法就可制备高纯度冬凌草甲素单体化合物的方法，工艺简单，重现性好，易操作，易于工业化生产；3、为冬凌草药材及以冬凌草为原料的中成药的质量控制提供了一种简单、可定向、重现性好制备对照品的技术保证和条件；4、为以冬凌草甲素为原料的创新新药的研制开拓了一种简单、可重复的制备中间体的工艺。