文冠果叶多糖提取物、提取方法及其应用与流程

本发明属于植物提取技术领域，涉及一种文冠果，尤其涉及一种文冠果叶多糖提取物、提取方法及其应用。

背景技术：
文冠果(学名：XanthocerassorbifoliumBunge)，无患子科、文冠果属落叶灌木或小乔木，高可达5米；小枝褐红色粗壮，叶连柄长可达30厘米；小叶对生，两侧稍不对称，顶端渐尖，基部楔形，边缘有锐利锯齿，两性花的花序顶生，雄花序腋生，直立，总花梗短，花瓣白色，基部紫红色或黄色，花盘的角状附属体橙黄色，花丝无毛；蒴果长达6厘米；种子黑色而有光泽。春季开花，秋初结果。文冠果原产中国西北地区，主要分布在陕西、山西、河北、内蒙等省，有较高的食用、药用、观赏等经济价值。有祛风湿、消肿止痛等功效，临床上主要用于治疗风湿性关节炎、风湿内热、皮肤风热、小儿遗尿等症，并作为药用部位列入了1977年版的中国药典。另外，文冠果适应性很强，耐干旱、瘠薄，根系发达，萌蘖力强，生长快、结实早、产量高、寿命长、经济价值大，是珍贵的观赏兼重要的木本油料树种。目前文冠果被国家列为木本燃料油能源主要树种，其选育推广受到国家高度重视，大力发展文冠果势在必行。全国现有文冠果栽培面积达5.35万hm2，目前对其开发利用以种仁榨油为主。文冠果叶子含有多种化学成分(马养民，王佩，文冠果叶化学成分的研究[J].中成药，2010，32(10)，1750-1753)且具有消炎止痛、止血消肿的作用。目前，对文冠果叶的开发利用以茶叶为主，如中国专利文献公开了一种文冠果叶茶及其应用[申请号：201310217440.8]，一种以文冠果叶为主要原料，采用红茶加工工艺制作的饮养茶[申请号：201110238087.2]，一种含有文冠果皂甙生物活性物质的茶叶[专利号:200710018943.7]。

技术实现要素：
本发明的目的是针对上述问题，提供一种提取率高的文冠果叶的多糖提取方法。本发明的另一目的是提供一种文冠果叶的多糖提取物。本发明的再一目的是提供一种文冠果叶多糖提取物在抑制癌细胞中的应用。本发明的还有一目的是提供一种文冠果叶多糖提取物在自由基清除中的应用。为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：一种文冠果叶的多糖提取方法，包括以下步骤：A、脱脂，取干燥文冠果叶，加入石油醚搅拌均匀，静置分层，滤除石油醚后得到脱脂文冠果叶；B、脱色，在脱脂文冠果叶中加入乙醇，搅拌均匀，滤除乙醇后得到脱色文冠果叶；C、超声提取，在脱色文冠果叶中加入纯净水，超声提取，抽滤去除文冠果叶得到超声提取液；D、浓缩干燥，将超声提取液浓缩后干燥，得到文冠果叶多糖提取物。在上述的文冠果叶的多糖提取方法中，在步骤D中，超声提取液液浓缩后加入适量无水乙醇清洗，充分搅拌后抽滤得到滤渣，将滤渣冷冻干燥后得到文冠果叶多糖提取物。在上述的文冠果叶的多糖提取方法中，在步骤D中，超声提取液浓缩至原液的五分之一得到浓缩液，再加入浓缩液4倍体积的无水乙醇，充分搅拌后抽滤得到滤渣，滤渣冷冻干燥得到文冠果叶多糖提取物。在上述的文冠果叶的多糖提取方法中，在步骤A中，所述的干燥文冠果叶用新鲜文冠果叶在室内阴干后粉碎制得，在步骤B中，所述的乙醇为95％乙醇或无水乙醇，在步骤C中，料液比为干燥文冠果叶：纯净水＝1:10-1:30，超声提取时间为10-60min，超声功率为20-100W，超声提取温度为25-90℃。在上述的文冠果叶的多糖提取方法中，在步骤A中，所述的干燥文冠果叶粉碎至40-60目，干燥文冠果叶：石油醚＝1:1-1:30，在步骤B中，料液比为干燥文冠果叶：95％乙醇＝1:1-1:30，在步骤C中，料液比为干燥文冠果叶：纯净水＝1:15，超声提取时间为40min，超声功率为80W，超声提取温度为80℃。根据上述的提取方法制得的文冠果叶多糖提取物。文冠果叶多糖提取物在抑制癌细胞中的应用。在上述的应用中，所述的癌细胞为肝癌细胞。在上述的应用中，所述的肝癌细胞为人肝癌细胞HepG2。文冠果叶多糖提取物在自由基清除中的应用。与现有的技术相比，本发明的优点在于：超声辅助能大大提高文冠果叶多糖的提取效率，是文冠果叶多糖提取的一条高效途径。体外活性研究结果表明，文冠果叶多糖具有一定的抗癌活性及良好的清除自由基能力，具有开发为药品及化妆品等相关产品的潜力，这为文冠果资源的综合开发与利用提供了新的思路。附图说明图1是实施例3提供的多糖提取物对HepG2细胞的抑制图；图2是实施例3提供的多糖提取物与VC对照品的DPPH·清除率的曲线图。具体实施方式实施例1取新鲜的文冠果叶1000g，室内常温下阴干、粉碎至60目后备用，取100g干燥、粉碎后的干燥文冠果叶于烧瓶中，加入100g石油醚，充分搅拌均匀，静置分层后抽滤，滤除石油醚，得到脱脂文冠果叶，在脱脂文冠果叶中加入100g95％乙醇，充分搅拌，静置后抽滤，滤除乙醇，得到脱色文冠果叶，在脱色文冠果叶中加入1000g纯净水，置于超声波水槽中超声提取，超声功率为20W，提取时间为10min，超声温度为25℃，提取完成后，抽滤，去除文冠果叶，得到超声提取液，将超声提取液冷冻干燥，得到文冠果叶多糖提取物。本领域技术人员应当理解，提取用的纯净水等同于去离子水，工艺用水等。实施例2取新鲜的文冠果叶1000g，室内常温下阴干、粉碎至40目后备用，取100g干燥、粉碎后的干燥文冠果叶于烧瓶中，加入3000g石油醚，充分搅拌均匀，静置分层后抽滤，滤除石油醚，得到脱脂文冠果叶，在脱脂文冠果叶中加入3000g95％乙醇，充分搅拌，静置后抽滤，滤除乙醇，得到脱色文冠果叶，在脱色文冠果叶中加入3000g纯净水，置于超声波水槽中超声提取，超声功率为100W，提取时间为60min，超声温度为90℃，提取完成后，抽滤，去除文冠果叶，得到超声提取液，将超声提取液浓缩至原体积的五分之一，加入浓缩后的超声提取液四倍体积的无水乙醇，充分搅拌后形成悬浊液，将悬浊液抽滤后去除乙醇水溶液，得到滤渣，滤渣冷冻干燥，得到文冠果叶多糖提取物，称重后显示提取率为12.42％。实施例3取新鲜的文冠果叶1000g，室内常温下阴干、粉碎至50目后备用，取100g干燥、粉碎后的干燥文冠果叶于烧瓶中，加入2000g石油醚，充分搅拌均匀，静置分层后抽滤，滤除石油醚，得到脱脂文冠果叶，在脱脂文冠果叶中加入2000g无水乙醇，充分搅拌，静置后抽滤，滤除乙醇，得到脱色文冠果叶，在脱色文冠果叶中加入1500g纯净水，置于超声波水槽中超声提取，超声功率为80W，提取时间为40min，超声温度为80℃，提取完成后，抽滤，去除文冠果叶，得到超声提取液，将超声提取液浓缩至原体积的四分之一，加入浓缩后的超声提取液三倍体积的无水乙醇，充分搅拌后形成悬浊液，将悬浊液抽滤后去除乙醇水溶液，得到滤渣，滤渣冷冻干燥，得到文冠果叶多糖提取物，称重后显示提取率为17.90％。实施例4-9本实施例与实施例3基本相同，不同之处如下表所示，由上表可知，文冠果叶多糖提取物的得率随提取时间变化比较大，提取时间大于40min后，得率基本不再增加，因此选择40min为最佳提取时间。实施例10-14本实施例与实施例3基本相同，不同之处如下表所示，由上表可知，当提取的料液比大于1∶15时，得率依然随着料液比增加而增加，但是增加趋势变缓，且料液比越大，后续浓缩困难，因此选择1∶15为提取的最佳料液比。实施例15-21本实施例与实施例3基本相同，不同之处如下表所示，由上表可知，随超声温度上升，得率上升，尤其在70-80℃之间得率上升较大，当温度高于80℃后得率基本不再增加，趋于稳定，故而选择80℃为最佳提取温度。实施例22-27本实施例与实施例3基本相同，不同之处如下表所示，由上表可知，随着超声功率的增加，提取率增加，当超声功率大于80W后得增加趋于稳定状态，因此确定80W为最佳提取频率。对比例1本对比例与实施例3基本相同，不同之处在，超声功率为0W，也即未采用超声提取，提取率为13.30％。可知，超声提取的得率较高。应用例11)HepG2细胞的培养将HepG2细胞置于25mL塑料培养瓶中，加入完全高糖DMEM培养基(含10％胎牛血清，100U/L青霉素和100mg/L链霉素)，置于37℃含5％CO2的恒温培养箱内。待细胞生长至90％汇合时，用0.25％的胰酶消化传代，3d传代1次。2)MTT法检测细胞相对存活率HepG2细胞以1×104个/每孔的密度接种于96孔板中，培养12h使细胞充分贴壁。弃去培养基，分别加入不同浓度的文冠果叶水提部位、30％乙醇水提取部位、50％乙醇水提取部位、70％乙醇水提取部位及95％乙醇水提取部位。在细胞培养结束前4h，每孔加入15μL的MTT。培养结束后，吸去培养基，每孔加入150μL的DMSO，37℃震荡10min，用多功能酶标仪检测450nm处的吸光度值。如图1所示，文冠果叶多糖具有抑制人肝癌细胞HepG2增殖的活性，与浓度之间呈良好的量效关系，当样品浓度为2.5mg/mL时，细胞增殖抑制率为74.27％。应用例21)DPPH·标准溶液的配制精密称取DPPH·标准品12mg，用甲醇溶解并定容至250ml，低温避光保存，备用。临用前将用甲醇稀释2倍测量其吸光度。2)Vc及样品的溶液的制备分别量取抗坏血酸和样品25mg，用甲醇溶解并定容至25ml容量瓶。分别精密量取上述溶液适量，依次用甲醇稀释至质量浓度为0.01mg/ml，0.04mg/ml,0.08mg/ml,0.12mg/ml,0.16mg/ml,0.20mg/ml六个梯度的样品溶液。3)试验方法：取2ml的DPPH·标准液2ml甲醇溶液测量混匀，常温避光反应15min,于517nm处测量吸光度(A空白)，用各浓度样品溶液代替甲醇测量其吸光度(A样)，阳性对照参照样品方法。DPPH·清除率＝(A空白－A样)/A空白×100％如图所示，文冠果叶多糖对DPPH·自由基有较强的清除活性，且具有量效关系，在浓度为0.2mg/ml时对DPPH·自由基清除率就可达90.78％。本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。