一种抑制植物基因转录的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抑制植物基因转录的方法。

背景技术：

转录激活因子样效应物(transcription activator-like effectors,TALEs)最初被发现大量存在于黄单胞菌中，具有识别不同核苷酸的能力。这些效应物能够通过黄单胞菌的III型分泌系统进入植物体内，和宿主基因的某些特异序列结合，从而调节植物自身发病和抗病基因的表达。TALE由N末端的核定位信号、N端区域、中部的DNA结合域以及C端区域构成。TALE结合DNA的特异性依赖于一段可变的34-35个氨基酸串联的重复单元，该单元的第12和13位对识别不同碱基核苷酸起决定作用。HD(即单元的12和13位分别为组氨酸和天冬氨酸)重复单元识别C，NN和NK均识别G，NI和NG分别识别A和T。因此，效应物TALE的这种识别不同碱基核苷酸的能力为基因精细调控提供了新的技术手段。然而，关于TALE的功能及其用途仍有待挖掘。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种抑制植物中靶基因转录的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)选取靶基因中大于等于15bp的核苷酸序列作为靶序列；

2)根据所述靶序列中的每个核苷酸的排列顺序列出识别所述靶序列的串联模块DNA片段序列，制备所述串联模块DNA片段；

所述串联模块DNA片段由与靶序列中核苷酸数目一致的模块DNA依次连接得到；识别核苷酸A的模块DNA为NI模块DNA，识别核苷酸T的模块DNA为NG模块DNA、识别核苷酸G的模块DNA为HD模块DNA，识别核苷酸C的的模块DNA为NN模块DNA；

3)将所述串联模块DNA片段和位于其两端的TALE N末端片段及TALE C末端片段导入目的植物中，实现抑制植物中靶基因转录。

上述方法中，步骤3)中，所述串联模块DNA片段和位于其两端的TALE N末端片段及TALE C末端片段通过重组载体导入所述目的植物。

上述方法中，所述重组载体为将所述串联模块DNA片段插入含有TALE N末端片段及TALE C末端片段的表达载体中得到的载体，且使所述串联模块DNA片段位于所述TALE N末端片段和TALE C末端片段之间形成TALE片段。

上述方法中，所述表达载体为p1300M3载体。

上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

或所述双子叶植物具体为拟南芥。

本发明的另一个目的是提供一种抑制植物中靶基因转录的物质。

本发明提供的物质，为如下1)-3)中任一种：

1)串联模块DNA片段；

2)含有串联模块DNA片段的TALE片段；

3)表达所述1)或2)的重组载体、表达盒、宿主菌或转基因细胞系；

所述TALE片段由TALE N末端片段、串联模块DNA片段和TALE C末端片段组成；

所述串联模块DNA片段

所述串联模块DNA片段由与靶序列中核苷酸数目一致的模块DNA依次连接得到；识别核苷酸A的模块DNA为NI模块DNA，识别核苷酸T的模块DNA为NG模块DNA、识别核苷酸G的模块DNA为HD模块DNA，识别核苷酸C的的模块DNA为NN模块DNA；

所述靶序列为所述靶基因中大于等于15bp的核苷酸序列。

上述物质中，所述表达1)或2)的重组载体为将所述串联模块DNA片段插入含有TALE N末端片段及TALE C末端片段的表达载体中得到的载体，且使所述串联模块DNA片段位于所述TALE N末端片段和TALE C末端片段之间形成TALE片段。

上述物质中，所述表达载体为p1300M3载体。

上述的物质在抑制植物中靶基因转录中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的物质在制备抑制植物中靶基因转录产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

或所述双子叶植物具体为拟南芥。

所述靶序列大小为15-17bp；

所述靶基因为拟南芥DET2基因；

所述NI模块DNA的核苷酸序列为序列1；

所述NG模块DNA的核苷酸序列为序列2；

所述HD模块DNA的核苷酸序列为序列3；

所述NN模块DNA的核苷酸序列为序列4；

所述TALE N末端片段的核苷酸序列为序列5；

所述TALE C末端片段的核苷酸序列为序列6。

本发明的实验证明，本发明利用TALE特异性识别DNA碱基的能力，以Unit Assembly的方法为基础进行了TALE载体的构建，在植物中表达的TALE蛋白与靶定DNA特异性结合后，会干扰靶基因的正常转录，从而造成其转录水平降低。该方法操作简单，不需要与FOK1酶融合，也不需要成对作用，只用一个上游或下游的TALE即可；且由于没有FOK1酶抑制目的基因表达不改变基因组；且靶点选择范围广泛，可以在拟南芥和其它多种植物中应用。

附图说明

图1为p1300M3载体示意图。

图2为瞬时转化实验中靶基因DET2的转录抑制效果。

图3为稳定转化实验中靶基因DET2的转录抑制效果。

图4为拟南芥p1300M3-DET2转基因植株的表型。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

拟南芥Col-0种子可从http://abrc.osu.edu/resources购买。

pCAMBIA1300载体可通过http://www.addgene.org网站购买，也可使用其它适合的植物表达载体。

p1300M3按照如下方法制备：

1)将pCAMBIA1300载体中的NheI酶切识别位点GCTAGC定点突变为GCTCGC，且保持其他序列不变，得到中间载体；

2)将由TALE的NC端片段插入中间载体的XbaI和PstI酶切位点间，得到载体p1300M3；

TALE的NC端片段由序列5所示的TALE的N端和序列6所示的TALE的C端组成；且序列5的3’末端碱基和序列6的5’末端碱基相邻。

Unit Assembly方法所需载体由北京大学生命科学学院张博教授赠予。

下述实施例中以抑制AtDET2基因转录为例。

实施例1、抑制植物基因转录水平

一、拟南芥基因组中AtDET2基因靶序列选择

在TAIR网站下载AtDET2的基因信息，选择基因组序列中434-449位碱基作为靶序列，靶序列为CGCCTCTTCCGCAGCT，共17个核苷酸。

二、识别靶序列的串联模块DNA片段的制备

识别A、T、G、C四个碱基的模块序列依次为NI、NG、HD、NN(序列如表1所示)；

表1为4个模块DNA序列

根据靶序列中的17个核苷酸的排列顺序，确定识别靶序列的串联模块DNA片段为HD NN HD HD NG HD NG NG HD HD NN HD NI NN HD NI；

可以人工合成上述识别靶序列的串联模块DNA片段，也可以通过如下方法制备上述识别靶序列的串联模块DNA片段：

1)使用内切酶SpeI和HindIII将识别A，T，G，C四个碱基的模块序列NI，NG，HD，NN分别从四个质粒pMD18T-NI，pMD18T-NG，pMD-18T-HD，pMD18T-NN中进行双酶切，分别得到酶切产物NI，NG，HD，NN；同时用NheI和HindIII内切酶对pMD18T-NI，pMD18T-NG，pMD-18T-HD，pMD18T-NN四个质粒进行双酶切，得到线性载体pMD18T-NI，pMD18T-NG，pMD-18T-HD，pMD18T-NN。酶切反应温度为37℃，反应时间为3h。

2)将酶切产物NI，NG，HD，NN及线性载体pMD18T-NI，pMD18T-NG，pMD-18T-HD，pMD18T-NN按照如下方式进行连接反应：线性载体pMD18T-HD+酶切产物NN，线性载体pMD18T-HD+酶切产物HD,线性载体pMD18T-NG+酶切产物HD,线性载体pMD18T-NG+酶切产物NG,线性载体pMD18T-HD+酶切产物HD,线性载体pMD-18T-NN+酶切产物HD,线性载体pMD18T-NI+酶切产物NN,线性载体pMD18T-HD+酶切产物NG。反应体系如下表2：

表2

连接反应温度为16℃，反应时间为8h。

3)连接产物转化大肠杆菌DH5α，并筛选阳性克隆。

4)得到的阳性克隆挑至LB液体培养基中于37℃摇床震荡培养8h，然后提取质粒。将得到的质粒重复步骤2)-4)，使得模块序列按照HD NN HD HD NG HD NG NG HD HD NN HD NI NN HD NI的顺序连接于pMD18T载体中，得到表达1632bp的串联模块DNA片段的重组载体。

串联模块DNA片段依次由HD NN HD HD NG HD NG NG HD HD NN HD NI NN HD NI组成。

5)将步骤4)中的重组载体用内切酶SpeI和NheI进行双酶切，得到1632bp的串联模块DNA片段；同时将载体p1300M3(其上带有TALE的N-末端及TALE的C-末端序列如图1所示)用NheI内切酶进行单酶切，得到线性载体p1300M3；酶切反应温度为37℃，反应时间为3h。

6)将步骤5)得到的1632bp的串联模块DNA片段与线性载体p1300M3连接，得到重组载体p1300M3-DET2。

经过测序，重组载体p1300M3-DET2为串联模块DNA序列插入线性载体p1300M3的NheI内切酶位点间，得到的重组载体，且串联模块DNA序列与位于其两端的存在于载体上的N-末端序列和C-末端序列组成TALE核苷酸序列，该重组载体表达TALE核苷酸。

TALE核苷酸序列从5’端依次由N-末端序列、串联模块DNA序列和C-末端序列组成；N-末端序列为序列5；C-末端序列为序列6；

串联模块DNA序列依次由HD模块DNA序列、NN模块DNA序列、HD模块DNA序列、HD模块DNA序列、NG模块DNA序列、HD模块DNA序列、NG模块DNA序列、NG模块DNA序列、HD模块DNA序列、HD模块DNA序列、NN模块DNA序列、HD模块DNA序列、NI模块DNA序列、NN模块DNA序列、HD模块DNA序列和NI模块DNA序列组成。

7)将上述6)制备的重组载体p1300M3-DET2转入农杆菌GV3101中，得到重组菌GV3101/p1300M3-DET2。

同时将空载体p1300M3转化GV3101，得到重组菌GV3101/p1300M3作为对照。

三、TALE核苷酸在抑制靶基因DET2转录中的应用

1、瞬时转化拟南芥叶片检测TALE对靶基因DET2的抑制效果

1)将上述二得到的重组菌GV3101/p1300M3-DET2和重组菌GV3101/p1300M3分别于添加50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中震荡培养，至农杆菌菌液浓度达到OD＝0.3时，收集菌液。

YEP液体培养基配方如下：酵母提取物10g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L，pH7.4。

溶剂为水。

2)取1)收集的农杆菌菌液25mL转移到50mL离心管中，以6000rpm的转速于4℃低温离心5min，收集菌体，弃上清。

3)将25mL瞬时转化液缓慢加入到有菌体沉淀的50mL离心管中，并用1mL微量移液器小心将收集的菌体重悬。瞬时转化液的配置方法如下：D-葡萄糖5g/L、2-吗啉乙磺酸50mM、Na3PO4·12H2O 2mM、乙酰丁香酮0.1mM，溶剂为水，pH为5.4。

4)将重悬的菌体以6000rpm的转速于4℃低温离心5min后，收集菌体，弃上清。并重复步骤3)。

5)选取生长3-4周的成熟野生型拟南芥(Col-0)叶片，用1mL注射器将步骤4)中的菌液从拟南芥下表皮注射至叶片中，其中左半部分叶片用于注射GV3101/p1300M3-DET2菌液作为处理组，右半部分叶片注射GV3101/p1300M3作为对照组。

6)将注射的叶片培养48h后，将注射的叶片从拟南芥植株上剪下，并将处理组和对照组分别提取总RNA。RNA提取采用TAKARA公司生产的Minibest Plant RNA Extraction Kit试剂盒。

7)将提取的RNA反转录为cDNA。反转录采用Transgene公司生产的First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒。

8)通过实时荧光定量PCR检测对照组和处理组中DET2基因的mRNA水平。所用引物如下：

i.DET2-RT-F:TTACCCTCTTCGCCTCTTCC

ii.DET2-RT-R:AGGAGATTAAAGGTGAAAGCCAA

实验重复三次。

结果如图2所示，注射GV3101/p1300M3-DET2菌液的处理组叶片中靶基因DET2的表达量比注射GV3101/p1300M3菌液的对照组叶片中DET2的表达量下降了54％。

因此，本发明的TALE核苷酸序列及方法能够有效抑制靶基因转录水平的表达。

2、稳定转化的拟南芥株系中TALE对靶基因DET2的抑制效果

1)转化

将上述二得到的重组菌GV3101/p1300M3-DET2和重组菌GV3101/p1300M3分别添加50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中震荡培养，至农杆菌菌液浓度达到OD＝0.6时，收集菌液用于浸花法转化野生型拟南芥(Col-0)，得到T0代转DET2拟南芥和T0代转空载体拟南芥；

具体步骤如下：

a、挑取农杆菌单菌落接种到5-10mL含抗生素(50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)的YEP液体培养基中，在28℃、250rpm条件下，振荡培养至对数生长晚期。

b、以1:50比例转接至新鲜的抗生素(50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)YEP液体培养基中，同样条件下培养至OD为0.6。6000rpm离心收集菌体，用浸花液洗涤两遍，然后用适量浸花液(5％蔗糖，0.02％silwet L-77)重悬到OD值为0.6。其中，浸花液的pH值为6.0，具体成分为：1/2MS溶液，5％蔗糖，和0.02％silwet L-77，溶剂为水。

c、选取四周左右刚开花的拟南芥植株，剪去果荚，然后将整个花序浸泡在浸花液中15s，并轻轻搅动。

d、农杆菌浸染后的拟南芥置于黑暗条件下保湿培养24h，然后将拟南芥移到光照培养室中进行16h光照，8h黑暗的正常培养，7d后按照上述步骤重复一次浸花转化过程。

e、待种子成熟后将种子收集并进行干燥处理，得到T0代拟南芥种子。

2)将T0代转DET2拟南芥和T0代转空载体拟南芥种子加入1mL 70％乙醇(体积百分比)消毒1min，弃去乙醇，再加入1mL 2.5％NaClO(有效氯)，消毒10min，然后用无菌水洗5次。

3)将消毒后的拟南芥种子均匀平铺于含有50mg/L潮霉素的1/2MS固体培养基上，在4℃低温中春化48h。

4)将培养皿移至22℃光照培养相中光照培养8h后，用锡纸包裹进行暗培养。5天后将锡纸打开，观察培养皿中拟南芥幼苗的生长情况，将下胚轴较长的拟南芥幼苗移至土中培养，得到T0代拟南芥。

5)生长两周后，取少量T0代转DET2拟南芥叶片，采用CTAB法提取基因组DNA用于进一步鉴定阳性植株。所用引物如下：

AS-F:ATGGCTCCAAAGAAGAAG

AS-R:TTAAAAGTTTATCTCGCC

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小为1353bp的DNA片段，为阳性T0代转DET2拟南芥，此拟南芥植株基因组中已插入TALE序列。

6)繁殖得到T3代转DET2拟南芥纯合植株作为处理组、取其生长一周的幼苗与同样生长条件下野生型拟南芥(clo-0)幼苗作为对照组，分别提取RNA，RNA提取采用TAKARA公司生产的Minibest Plant RNA Extraction Kit试剂盒。

7)将提取的RNA反转录为cDNA。反转录采用Transgene公司生产的First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒。

8)通过实时荧光定量PCR检测对照组和处理组中DET2基因的mRNA水平。所用引物如下：

DET2-RT-F:TTACCCTCTTCGCCTCTTCC

DET2-RT-R:AGGAGATTAAAGGTGAAAGCCAA

内参基因为β-Tublin，内参基因的引物如下：

Tub-F:CTTGACTGCTTCTCTGAGGTTTG

Tub-R:TCTTCATCGTCACCACCTTCAG

实验重复三次。

结果如图3所示，在稳定转化的T3代转DET2拟南芥纯合植株中，DET2的mRNA转录水平比野生型拟南芥下降了74％。这些结果表明该方法可用于稳定转化植株中靶基因的转录抑制，且抑制效果显著。

T3代转空载体纯合植株和野生型拟南芥无显著差异。

由于DET2基因是油菜素内酯(brassino steroids)合成途径中的关键基因，其突变或表达量下降会导致BR合成受阻，从而引起植株矮化，生长缓慢，晚花等诸多表型。

观察T3代转DET2拟南芥纯合植株、野生型拟南芥和T3代转空载体纯合植株，结果如图4所示，可以看出，与野生型拟南芥相比，T3代转DET2拟南芥纯合植株呈现出BR合成受阻的表型。T3代转空载体纯合植株和野生型拟南芥无显著差异。

表明，TALE核苷酸序列可用于稳定转化植株中靶基因的转录抑制，且抑制效果显著。