技术领域本发明涉及一种生物技术领域的抗体制备方法，尤其是涉及一种多联高免卵黄抗体制剂的制备方法。
背景技术：
通过免疫注射产蛋鸡，即可由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗，这类制剂称为卵黄抗体。目前，卵黄抗体己被广泛应用于临床，已被证明，其对免疫抑制类疾病防治效果尤为显著。鸡传染性法氏囊病(IBD)是由IBDV引起的一种急性、高度传染性疾病，具有发病突然、病程短、死亡率高的特点，更为重要的是：该病由于不同血清型病毒的存在和超强毒株的出现，导致母源抗体滴度不均，常使疫苗免疫效果不佳或失败；IBDV破坏病鸡的免疫中枢器官法氏囊，因而在患该病的同时常伴随继发症，尤其是患鸡继发新城疫(ND)、禽流感(AI)、大肠杆菌病等，往往给养殖业造成毁灭性打击。采取高免卵黄抗体进行人工被动免疫，是一种防治IBD的有效措施，目前，已有大量研究成果证明其有效性和可行性，但在利用多联卵黄抗体治疗IBD及其继发症方面的研究成果较少，其中，刘兴民等报道的“抗鸡传染性法氏囊病-新城疫-传染性支气管炎-大肠杆菌病四联高免卵黄抗体的研制与应用”是其中的代表，但在该报道中为保证多联卵黄抗体的防治效果，作者对产蛋鸡采用了高剂量、高频率、短周期的免疫方式，这不但加大了多联卵黄抗体的生产成本，还给受免鸡造成应激及伤害，且作者最终没有报道出IB及大肠杆菌抗体效价，难以确切证明该四联卵黄抗体最终是否制备成功。为有效防治IBD及其主要继发症，本专利发明人在总结现有技术成果的基础上，通过反复试验，开发出一种IBD-ND-AI-大肠杆菌病四联高免卵黄抗体制备工艺，其能有效避免了在抗体制备过程中高剂量免疫给受免鸡造成的伤害，并通过效价测定、治疗试验和预防试验证明IBD-ND-AI-大肠杆菌病四联高免卵黄抗体制备成功。
技术实现要素：
本发明旨在针对现有技术的缺陷，提供一种抗体效价确切、治疗效果优良、预防效果显著的四联高免卵黄抗体的制备方法。为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：一种四联高免卵黄抗体制备方法，包括如下制备步骤：1)原材料准备：选取市售IBD、ND、H9、鸡大肠杆菌病疫苗，待免疫接种的即将开产的健康母鸡；2)基础免疫：IBD疫苗免疫母鸡后7-10天再用ND、H9及鸡大肠杆菌疫苗免疫母鸡；3)强化免疫：对应基础免疫7-14天后，进行两次强化免疫，两次强化免疫的时间间隔为10-20天；4)效价监测并集卵：当IBD抗体琼扩效价≥1:128，H9抗体HI效价≥1:2048，新城疫抗体HI效价≥1:1024，大肠杆菌ELISA效价≥1:1024时，开始收集高免蛋，用于后续卵黄抗体的提取；5)抗体提取及精制：首先将高免蛋浸入新洁尔灭溶液中浸泡消毒、晾干备用，其次是打蛋，分离并收集卵黄，去除系带等附着物，再次是打散卵黄制成卵黄液，加入醋酸盐缓冲液，搅拌后粗滤，然后是向粗滤液中加入辛酸，剧烈搅拌并过滤至澄清，最后是微孔过滤除菌即得精制卵黄抗体。6)维持免疫：上述步骤4)中其中一种抗体效价降低一个滴度时，进行一次维持免疫；优选的，步骤1)中的IBD、ND、H9、鸡大肠杆菌病疫苗为灭活苗，健康母鸡为SPF鸡，避免受免鸡体内存在抗IBD、ND、H9、鸡大肠杆菌病的抗体；优选的，步骤2)中IBD疫苗免疫母鸡后7天再用ND、H9及鸡大肠杆菌疫苗免疫母鸡，IBD疫苗用量为正常免疫剂量的1-3倍，ND、H9及鸡大肠杆菌疫苗用量为正常免疫剂量，过高的免疫剂量会因大量外源蛋白的引入，导致受免鸡产生强应激和接种部位溃烂甚至死亡，；优选的，步骤3)中首次强化免疫的时间是对应的基础免疫后10天，两次强化免疫之间的时间间隔是14天，免疫间隔时间过短或过长，均会导致免疫应答时间延长或降低抗体效价；优选的，步骤5)中新洁尔灭的工作浓度为1％，侵泡消毒时间为10-15min；优选的，步骤5)中是用胶体磨打散卵黄；优选的，步骤5)中醋酸盐缓冲液的pH值为5.0-5.4，卵黄液与加入的醋酸盐缓冲液的体积比为1:2-1:6；优选的，步骤5)中辛酸的工作浓度的质量比为1％-5％，搅拌时间为40-100min；优选的，步骤5)中的粗滤装置为板框过滤器；优选的，步骤5)中的微孔过滤的过滤膜孔径为0.22μm。优选的，步骤6)中维持免疫的各种疫苗用量为正常免疫剂量；本发明的技术优势主要体现在以下方面：1)IBD疫苗免疫与ND、H9及鸡大肠杆菌疫苗免疫分开，且先于后者7-10天接种，有助于保证四联卵黄抗体中IBD的抗体浓度相对较高，且经IBD疫苗的刺激，能保证受免鸡免疫中枢的活性，更快的对后续接种的ND、H9及鸡大肠杆菌疫苗产生免疫应答；2)四联卵黄抗体中，IBD抗体效价最高，在产品用于生产防治时，能最大程度的保证养殖鸡群不受IBDV感染，同时能保护并激活养殖鸡的免疫中枢，即使在相对较低的ND、H9及鸡大肠杆菌病抗体存在的情况下，也能使鸡群获得充分的保护；3)用正常免疫剂量接种受免鸡，能最大程度的降低受免的应激发应，不会因大量外源蛋白的刺激导致接种部位溃烂甚至受免鸡死亡；4)实时监测受免鸡血清中的抗体效价，并在抗体效价水平达标的情况下收集高免鸡蛋用于制备卵黄抗体，能保证四联卵黄抗体的稳定性和有效性，并能准确确定维持免疫的时间点；5)用胶体磨打散卵黄，有利于保证四联卵黄抗体的得率和精制卵黄抗体的品质。具体实施方式以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1IBD-ND-AI-大肠杆菌病四联高免卵黄抗体的制备及检测：1)高免鸡蛋的获得：选用市售IBD、ND、H9、鸡大肠杆菌病灭活疫苗或即将开产的SPF母鸡；检测确定母鸡血清中无抗IBD、ND、H9、鸡大肠杆菌病的抗体存在；首先用3倍正常免疫剂量的IBD疫苗接种母鸡，7天后再用ND、H9及鸡大肠杆菌灭活疫苗接种母鸡，完成基础免疫；接种IBD疫苗后10天，用正常免疫剂量的IBD疫苗进行首次强化免疫，接种ND、H9及鸡大肠杆菌疫苗后10天，用正常免疫剂量的ND、H9及鸡大肠杆菌疫苗强化免疫1次，完成首次强化免疫；首次强化免疫后14天，参照首次强化免疫的剂量及时间间隔，完成第二次强化免疫；第二次强化免疫后10天，开始检测受免鸡产蛋中的抗体效价，当IBD抗体琼扩效价≥1:128，H9抗体HI效价≥1:2048，新城疫抗体HI效价≥1:1024，大肠杆菌ELISA效价≥1:1024时，开始收集高免蛋，用于后续卵黄抗体的提取。2)四联高免卵黄抗体的提取及精制：将高免蛋浸入1％的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min，晾干备用；采取机械打蛋，分离并收集卵黄，去除系带等附着物；用胶体磨打散卵黄制成卵黄液，并1:4加入醋酸盐缓冲液(pH5.2)，搅拌60min，用板框过滤器粗滤；过滤清液加入3％的辛酸，剧烈搅拌60min，板框过滤至澄清；用0.22μm微孔过滤除菌即得精制卵黄抗体。3)四联高免卵黄抗体的效价测定：随机抽取5批按照上述方法精制的四联高免卵黄抗体，分别用琼脂糖扩散实验测IBD抗体效价，用血凝抑制实验测H9和ND抗体效价，用ELISA测大肠杆菌病效价，结果表明，5批精制的四联高免卵黄抗体中，IBD抗体琼扩效价均大于1:128，H9抗体HI效价均大于1:2048，新城疫抗体HI效价大于1:1024，大肠杆菌ELISA效价均大于1:1024。4)四联高免卵黄抗体的安全检验：随机抽取5批按照上述方法精制的四联高免卵黄抗体，每批分别肌注5只5周龄肉用仔鸡，每只受试仔鸡胸肌射5ml高免卵黄液，观察一周，无异常反应，健康存活。5)四联高免卵黄抗体的无菌检测：按《中国生物制品规程》通则《生物制品无菌试验规程》A项进行，随机抽取的5批按照上述方法精制的四联高免卵黄抗体，无菌实验均合格。6)四联高免卵黄抗体的治疗实验：2000只25日龄肉鸡发生IBD疫情(有ND、AI混合感染情况)，使用按上述方法制备的抗IBD-ND-AI-大肠杆菌病四联卵黄抗体，胸肌注射，2ml/只。疫情得到有效控制，治愈率达到93％，直到出栏并未发生大肠杆菌病等继发症。7)四联高免卵黄抗体的预防实验：在IBD发生的鸡场选取2群暂未发病的鸡群(共4000只，40日龄)进行紧急预防，胸肌注射，2ml/只。鸡场疫情得到控制后，此4000只肉鸡并未发生IBD、ND、AI、大肠杆菌病的单独感染或是混合感染，预防保护率达到了100％。实施例2一种四联高免卵黄抗体制备方法，包括如下制备步骤：1)原材料准备：选取市售IBD、ND、H9、鸡大肠杆菌病基因工程疫苗，待免疫接种的即将开产的健康母鸡，经检测健康母鸡体内不存在抗IBD、ND、H9、鸡大肠杆菌病的抗体；2)基础免疫：用2倍正常免疫剂量的IBD基因工程疫苗免疫母鸡后10天再用ND、H9及鸡大肠杆菌基因工程疫苗免疫母鸡；3)强化免疫：对应基础免疫14天后，进行两次强化免疫，两次强化免疫的时间间隔为20天；4)效价监测并集卵：当IBD抗体琼扩效价≥1:128，H9抗体HI效价≥1:2048，新城疫抗体HI效价≥1:1024，大肠杆菌ELISA效价≥1:1024时，开始收集高免蛋，用于后续卵黄抗体的提取；5)抗体提取及精制：首先将高免蛋浸入浓度为1％新洁尔灭溶液中浸泡消毒12min、晾干备用，其次是打蛋，分离并收集卵黄，去除系带等附着物，再次是用胶体磨打散卵黄制成卵黄液，加入pH值为5.0醋酸盐缓冲液，搅拌后用板框过滤器粗滤，然后是向粗滤液中加入浓度为1％的辛酸，初滤液与辛酸的体积比为1:2，剧烈搅拌80min并用板框过滤器过滤至澄清，最后是用0.22μm的微孔过滤除菌即得精制卵黄抗体。实施例3一种四联高免卵黄抗体制备方法，包括如下制备步骤：1)原材料准备：选取市售IBD、ND、H9、鸡大肠杆菌病灭活疫苗，待免疫接种的即将开产SPF鸡，经检测健康母鸡体内不存在抗IBD、ND、H9、鸡大肠杆菌病的抗体；2)基础免疫：用正常免疫剂量的IBD灭活疫苗免疫母鸡后8天再用ND、H9及鸡大肠杆菌基因工程疫苗免疫母鸡；3)强化免疫：对应基础免疫10天后，进行两次强化免疫，两次强化免疫的时间间隔为16天；4)效价监测并集卵：当IBD抗体琼扩效价≥1:128，H9抗体HI效价≥1:2048，新城疫抗体HI效价≥1:1024，大肠杆菌ELISA效价≥1:1024时，开始收集高免蛋，用于后续卵黄抗体的提取；5)抗体提取及精制：首先将高免蛋浸入浓度为1％新洁尔灭溶液中浸泡消毒10min、晾干备用，其次是打蛋，分离并收集卵黄，去除系带等附着物，再次是用胶体磨打散卵黄制成卵黄液，加入pH值为5.4醋酸盐缓冲液，搅拌后用板框过滤器粗滤，然后是向粗滤液中加入浓度为1％的辛酸，初滤液与辛酸的体积比为1:6，剧烈搅拌100min并用板框过滤器过滤至澄清，最后是用0.22μm的微孔过滤除菌即得精制卵黄抗体。以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。