一种北极生活污水低温高效降解菌及其筛选方法和应用与流程

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种北极生活污水低温高效降解菌，本发明还涉及一种北极生活污水低温高效降解菌的筛选方法，本发明还涉及一种北极生活污水低温高效降解菌的应用。

背景技术：

随着我国城镇化率的不断提高，中小型点源污染的控制是提高水环境质量和解决水资源短缺问题的关键。我国寒冷地区的冬季漫长，生活污水的生物处理一直存在着微生物活性低、生化处理效果差和出水达标困难等难题，这主要是由于温度的降低对活性污泥的吸附性能、沉降性能、微生物生长发育、种群组成及曝气池中氧转移效率等均有着显著影响。因此，分离低温高效降解菌并用于低温生活污水的处理，是解决我国北方地区冬季污水厂出水水质难以达标的根本方法。

独特的地理、环境与气候特征，造就了特殊的极地微生物生态系统，是微生物新种质、基因和产物的资源宝库。极地低温微生物种质资源非常丰富，从中获取各种污染物的低温降解菌已成为国内外的研究热点。已经从冰川融化形成的小溪及高纬度湖泊的沿岸分离得到N、P降解蓝藻细菌，从南极土壤、湖泊和海洋等中分离获得石油降解菌，目前国内外都鲜有将极地微生物应用于生活污水低温处理的成功报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种北极生活污水低温高效降解菌，该菌为革兰氏阴性菌，菌落在2216E固体培养基上为淡黄色，可利用葡萄糖为唯一碳源生长。

本发明的另一目的是提供一种北极生活污水低温高效降解菌的筛选方法。

本发明的另一目的是提供一种上述低温降解菌在生活污水处理中的应用。

本发明所采用的第一技术方案是，一种北极生活污水低温高效降解菌，该菌株于2015年2月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.10509。

本发明所采用的第二技术方案是，一种北极生活污水低温高效降解菌的筛选方法，包括以下步骤：

(1)、取约1g北极海洋沉积物样品接种于灭菌的筛选培养基中，然后放入10℃低温摇床以150r/min转速富集培养7d后，按2％接种量移取富集培养液，转接到新的灭菌的液体筛选培养基中，相同条件下培养7d，重复两次，制备得到富集培养液；

(2)取富集培养液经适当系列稀释后涂布于筛选培养基平板进行分离纯化，在10℃培养箱中培养7d后，挑取单菌落至筛选培养基平板，划线纯化并编号保藏，经初筛得到北极生活污水低温高效降解菌Arc5-9-2菌株。

进一步地，筛选培养基的配方为：葡萄糖0.5g/L，氯化铵0.0955g/L，磷酸二氢钾0.022g/L，氯化钙0.326g/L，七水合硫酸亚铁0.013g/L，EDTA0.013g/L，七水合硫酸镁0.484g/L。

进一步地，筛选培养基平板的配方为：琼脂粉15g/L，葡萄糖0.5g/L，氯化铵0.0955g/L，磷酸二氢钾0.022g/L，氯化钙0.326g/L，七水合硫酸亚铁0.013g/L，EDTA 0.013g/L，七水合硫酸镁0.484g/L。

本发明所采用的第三技术方案是，上述水低温高效降解菌在生活污水处理中的应用。

本发明的有益效果是：本发明的北极好氧细菌生活污水低温处理结果表明，COD去除率良好，在生活污水的低温处理中具有很大的应用潜力。

附图说明

图1是不同温度下菌株Arc5-9-2在模拟生活污水的生长效果曲线；

图2是不同温度下菌株Arc5-9-2在模拟生活污水的COD降解情况；

图3是菌株Arc5-9-2在不同盐度模拟生活污水的生长曲线；

图4是基于16S rRNA基因序列构建的菌株Arc-5-9-2的系统发育树。

具体实施方式

本发明通过液体筛选培养基富集培养与固体筛选培养基平板，从北极海洋沉积物中筛选到一株北极好氧细菌，命名为Arc5-9-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年2月2日，保藏号为CGMCC No.10509，保藏地址：中国科学院微生物研究所(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，该菌株的分类学地位为节杆菌属(Arthrobacter sp.)菌株。

该菌株为革兰氏阴性菌，在筛选培养基上为淡黄色菌落，能以葡萄糖为唯一碳源生长。

本发明获得的菌株Arc5-9-2的16S rNA基因的有效序列为1346bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该序列在GenBank的登录号为KT239524。经BLAST序列同源性比对及系统发育树的构建，鉴定该菌株的分类学地位 为节杆菌属(Arthrobacter sp.)菌株。

对模拟生活污水的低温处理测定结果表明，该菌株在10℃和有氧条件下具有很高的化学耗氧量(COD)去除率。

通过以下具体实施例对本发明的技术方案进一步描述，目的是为了更好地理解本发明而不是对本发明的限制。

实施例1 北极生活污水低温处理菌株的筛选

取约1g北极海洋沉积物样品接种于灭菌的筛选培养基中，筛选培养基的配方为：葡萄糖0.5g/L，氯化铵0.0955g/L，磷酸二氢钾0.022g/L，氯化钙0.326g/L，七水合硫酸亚铁0.013g/L，EDTA 0.013g/L，七水合硫酸镁0.484g/L，然后放入10℃低温摇床以150r/min转速富集培养7d后，按2％接种量移取富集培养液，转接到新的灭菌的筛选培养基中，相同条件下培养7d，重复两次后，取富集培养液经适当系列稀释后涂布于筛选培养基平板(琼脂粉15g/L，其余成分同筛选培养基)进行分离纯化，在10℃培养箱中培养7d后，挑取单菌落至筛选培养基平板，划线纯化并编号保藏，经初筛共获得37株菌株，其中菌株Arc5-9-2在筛选培养中的生长情况和COD降解率均较好。

实施例2 菌株Arc5-9-2不同温度下对模拟生活污水的处理效果

挑取1环Arc5-9-2菌落至筛选培养基中，10℃摇床150r/min培养3d后，按2％接种量接种至灭菌的液体模拟生活污水，模拟生活污水的配方为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖3g/L，磷酸氢二钾3g/L，稀释80倍用于实验，COD约为1300，然后于不同温度梯度(0℃、10℃、20℃和30℃)下振荡培养，于不同时间取样测定其生长(OD₆₀₀)和COD降解率。由图1和图2可以看出，菌株Arc5-9-2菌株9-2在0-30℃的温度范围内均能较好地生长繁殖，对模拟生活污水COD具有较好的去除效果，可达80％ 以上。

实施例3 菌株Arc5-9-2不同盐度下对模拟生活污水的处理效果

通过添加不同含量的NaCl，配制不同盐度的(0、15、30、45、60和75)的模拟生活污水。从平板取1环菌落至筛选培养基中，10℃摇床150r/min培养3d后，按2％接种量分别接种至灭菌的不同盐度的液体模拟生活污水，于10℃，150r/min震荡培养，于不同时间取样测定其生长(OD₆₀₀)和COD降解率。不同盐度(0、15、30、45、60和75)条件下，菌株9-2在模拟生活污水中的生长情况如图3所示。可以看出，菌株Ar9-2在0-45的盐度下都能很好的生长，说明菌株具有良好的耐盐性，可以经受适度盐度污水的冲击。

实施例4 菌株Arc-5-9-2的系统发育分析

采用采用天根生化技术(北京)有限公司基因组DNA抽提试剂盒提取菌株基因组DNA，16S rRNA基因的PCR扩增的引物为27F：5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，PCR条件为：预变性94℃5min，变性1min，退火55℃30s，72℃90s，循环34次，72℃延伸10min，PCR产权经琼脂糖凝胶电泳检测后送南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。

将16S rRNA基因序列(1346bp)导入Eztaxon-e(http://eztaxon-e.ezbio cloud.net)进行分析，选取最相似菌株的16S rRNA基因序列，通过软件Bio Edit进行比对，应用MEGA5软件，采用邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树。

16S rRNA基因序列比对结果表明，菌株Arc-5-9-2与Arthrobacter alpi nes S6-3T具有最高的相似性，为98.96％。从图4的系统发育树可以看出， 以上两株菌株形成独立的分支，位于Arthrobacter属内，可以确定菌株Arc-5-9-2为Arthrobacter属一个新菌株。