本发明涉及植物病害的生物防治技术领域，具体涉及一株对植物线虫具有寄生和毒杀作用的辐毛小鬼伞(Coprinelllus radians)HMQAU090439N的筛选、发酵、杀线虫活性测定及对小麦禾谷孢囊线虫病的防治应用，属于农业生物技术领域。
背景技术：
植物病原线虫是一种危害严重的植物病害，每年给全世界农业带来近1570亿美元的经济损失。已报道的植物病原线虫达200多属5000余种，其中禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是危害小麦等麦类作物的重要病原线虫，欧洲、亚洲、非洲、北美洲、南美洲和大洋洲的40多个国家均有分布，在国内造成的小麦产量损失为10％-30％，最高达70％以上。
目前，化学防治仍然是控制植物线虫的重要措施之一，化学杀线剂(如土壤熏蒸剂和非熏蒸剂)具有一定的防治效果，但长期使用剧毒化学杀线剂给环境和人类的健康带来的危害日渐显露。由于传统杀线剂(如甲基溴化物和有机磷酸盐)不断被淘汰，研究开发高效低毒的生物杀线剂已成为农业可持续发展的重要问题，因此寻找新的真菌资源是研发生物杀线制剂的关键因素。
技术实现要素：
本发明第一个目的在于提供一种从禾谷孢囊线虫的孢囊上分离并筛选出来的生防真菌——辐毛小鬼伞(Coprinelllus radians)菌株HMQAU090439N，丰富小麦禾谷孢囊线虫病生防真菌菌种资源，为研究开发生物杀线剂奠定基础。
本发明第二个目的在于提供一种利用上述菌株HMQAU090439N生产的微生物菌剂。
本发明第三个目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。
本发明第四个目的在于提供上述微生物菌剂对禾谷孢囊线虫的生测方法。
本发明第五个目的在于提供上述菌株HMQAU090439N防治禾谷孢囊线虫病的室内盆栽试验方法。
本发明第六个目的在于提供上述菌株HMQAU090439N防治禾谷孢囊线虫病的田间试验方法。
本发明第七个目的在于提供上述菌株HMQAU090439N在防治禾谷孢囊线虫病上的应用。
本发明第八个目的在于提供上述菌株HMQAU090439N的鉴定方法。
实现本发明的技术方案如下所述。
一株辐毛小鬼伞(Coprinelllus radians)HMQAU090439N于2016年1月8日保藏于中国科学院微生物所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.11814。
利用上述辐毛小鬼伞HMQAU090439N生产的微生物菌剂，活性成分为菌体或发酵滤液。
上述微生物菌剂的制备步骤如下。
带菌平板(菌体)的制备：将菌株HMQAU090439N转接至PDA平板上，25度培养，待菌落直径为4-6cm时备用。
发酵滤液：(1)菌种活化：将低温保藏的菌株HMQAU090439N于PDA平板上25℃培养48h，得到活化的菌种；(2)发酵培养：从活化的菌落边缘用直径为5mm的打孔器打出两个菌饼，接种到70mL PD液体培养基中，120r/min，25℃摇培7天后，8000rpm离心10min，取发酵上清，用细菌过滤器过滤，收集发酵滤液，4℃保存备用；PD液体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，加水定容至1L。150mL三角瓶每瓶分装70mL培养基。
带菌麦粒(菌体)的制备：先将小麦粒用清水清洗干净，再用清水浸泡至手指搓捻无实心感，用沸水煮25-30min，至麦粒无白心，滤水装瓶，250mL三角瓶每瓶装50g，高温灭菌后冷却至室温，在无菌条件下将HMQAU090439N带菌平板上加5ml无菌水，用手术刀将菌丝刮下来接种到上述麦粒培养基中，25℃恒温培养15d后备用。
本发明的有益效果是。
1.本发明的辐毛小鬼伞HMQAU090439N菌株对禾谷孢囊线虫有很好的生防效果，既能寄生小麦孢囊线虫孢囊，对孢囊孵化有较强的抑制效果，又对二龄幼虫(J2)有较高的毒杀作用，对盆栽小麦孢囊线虫病防治效果明显。
2.本发明所提供的辐毛小鬼伞HMQAU090439N菌株防治效果稳定，对环境友好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。
根据本发明提供的辐毛小鬼伞HMQAU090439N和发酵滤液菌剂可作为单剂或组合制剂利用或施用，这样的制剂可包括农业上合适的助剂、溶剂、载体、表面活性剂或填充剂。
本发明的菌剂可用于防治各种线虫病害。
本发明的菌剂可用于防治的线虫实例包括，但不限于禾谷孢囊线虫，这里所使用的线虫是指植物线虫，所述植物线虫意指对植物造成伤害的植物寄生线虫和生活在土壤中的线虫。植物寄生线虫包括，但不仅限于，体外寄生虫，例如剑线虫属、长针线虫属、毛刺线虫属；半寄生物例如穿刺线虫属；迁移性内寄生虫，例如短体属、穿孔线虫属和Scutellonerna spp.；固着性寄生虫，例如异皮线虫属、Globoderal spp.和根结线虫属；茎和叶内寄生虫，例如茎线虫属、滑刃线虫属和Hirshmaniella spp.。尤其是有害的根寄生性土壤线虫，例如异皮线虫属或球异皮线虫属的孢囊线虫和根结线虫属的根结线虫。然而，这里描述的化合物的使用不局限于这些属或物种，且也以同样的方式扩展到其他线虫。
本发明中的菌剂可作用的植物并不是特别限制的：例如，谷物(例如水稻、大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、高粱等)、豆类(大豆、红豆、菜豆、蚕豆、豌豆、花生等)，果树或水果(苹果、柑橘、梨、葡萄、桃、杏、樱桃、核桃、扁桃、香蕉、草莓等)、蔬菜(甘蓝、西红柿、菠菜、椰菜、生菜、洋葱、葱、胡椒等)、块根作物(胡萝卜、土豆、甘薯、萝卜、莲藕等)、经济作物(棉、麻、油菜、甜菜、甘蔗、橄榄、橡胶、咖啡、烟草、茶叶等)、牧场用植物(果园草、高粱、三叶草、紫花苜蓿等)、草坪用草(高丽草、小糠草等)、调味作物(薰衣草、迷迭香、百里香、香菜、胡椒、姜等)和开花植物(菊花、玫瑰、兰花等)。
根据本发明的菌剂对植物和植物部位的处理，使用常用的处理方法，直接进行或作用于他们的周围、生长地进行，例如通过浸渍、喷涂、雾化、灌溉、挥发、撒粉、撒播、发泡、涂布、浇灌、滴水灌溉等，并且在繁殖材料的情况下，尤其是种子的情况下，还通过一层或多层涂覆等作为用于干燥种子的处理粉末、处理种子的溶液、用于浆液处理的水溶性粉末。也可通过超低容量的办法施用菌剂，或注射菌剂本身到土壤中。
具体实施方式：
下面实施例用于进一步解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，一般为常规方法。
小麦禾谷孢囊线虫土样的采集，孢囊的分离及无菌孢囊和二龄幼虫的获得方法。
小麦禾谷孢囊线虫土样的采集：从山东省青岛市莱西市夏格庄镇五四农场小麦禾谷孢囊线虫病田采集，去除植株周围地面表土，用灭菌铲取距地表10-20cm的小麦根围土壤放入塑封袋内，随机五点取样，每点取两株小麦，共10株，混合成一个样本。
孢囊的分离：将土样充分混匀，取500g放入直径27cm，深10cm盆中，注入水，充分搅匀。将上悬液过40目和60目套筛，用60目筛收集孢囊，反复5次。将60目筛上收集到的孢囊、根残片及其他碎片淋洗至烧杯中。将烧杯中的悬液经滤纸过滤，将滤纸移到培养皿内，置于显微镜下观察。用毛刷挑取孢囊至铺湿滤纸的表面皿上，放入5℃冰箱保存备用。
无菌孢囊的获得：从小麦禾谷孢囊线虫病土样中分离孢囊，挑出新鲜饱满成熟的孢囊。将孢囊用1％NaClO表面消毒3min，无菌水冲洗三次，转至PDA平板上，25℃培养10天，无病菌长出的为无菌孢囊。
二龄幼虫的获得：将小麦土样在5℃温度下预处理30天后，分离其内孢囊，将孢囊浸在清水中，置15℃下孵化。3d后开始收集线虫，每天及时收集新孵化出来的二龄幼虫(J2)，最后将获得到的J2置于5℃的冰箱中保存备用。
实施例1：菌株HMQAU090439N及其发酵滤液对禾谷孢囊线虫的拮抗作用。
(1)菌株HMQAU090439N对禾谷孢囊线虫孢囊的寄生性
将无菌孢囊转至菌株HMQAU090439N带菌平板的菌落边缘，每皿5个，三次重复，25度培养7d后，将孢囊轻轻挑出(注意不要弄破孢囊),1％NaClO表面消毒3min，无菌水冲洗三次后，置于PDA平板上，25℃培养5天。观察孢囊长菌情况，记载菌株对孢囊的寄生率。带菌平板接种孢囊试验结果表明，菌株HMQAU090439N对禾谷孢囊线虫的孢囊有很强寄生能力，寄生率达100％，从而再进一步研究其作为生防菌株的研究价值。
(2)菌株HMQAU090439N发酵滤液对禾谷孢囊线虫二龄幼虫的毒性取2mL发酵滤液于24孔细胞培养板中，加入50条新孵化的J2幼虫，于15℃培养箱中，分别于0h，6h，12h，24h，48h观察记录J2死亡率。以无菌PD液体培养基为对照，每处理3次重复，计算出平均死亡率和校正死亡率。鉴定J2死亡的方法：采用“体态法”和“生理盐水刺激法”(方中达，《植病研究方法》，第三版，1996,319)，在体视显微镜下观察经过处理的J2活动状态和体态。存活的J2虫体一般是弯曲的，且可以不断地移动；死亡的J2虫体一般是僵直的，然后将虫体僵直的J2再次分离后置于盛有2％生理盐水的培养皿中，在体视显微镜下用轻轻拨动J2，静止不动的即为死亡个体。
校正死亡率＝((试验组死亡率-对照组死亡率)/对照组死亡率)×100％试验结果表明，菌株HMQAU090439N发酵滤液对禾谷孢囊线虫的J2有较强的毒杀作用，6h和12h的致死率分别为21.3％和66.0％，24h致死率达92.67％，48h能杀死全部J2。
(3)菌株HMQAU090439N发酵滤液对禾谷孢囊线虫孢囊孵化的影响取2mL发酵滤液于24孔细胞培养板中，每孔加入10个无菌孢囊，于15℃培养箱中，每天观察记录J2孵化条数。以无菌PD液体培养基做对照，每处理3次重复。孵化动态试验结果显示，菌株发酵滤液处理1至10天的平均孵化量分别为4.3，6.0，7.3，10.0，13.0，17.0，20.0，21.3，23.7，25.7；对照的1至10天的平均孵化量分别为，105.3，151.7，178，191.7，206.7，222.7，228.3，236.7，240.0，242.3条。表明发酵滤液对禾谷孢囊线虫的孢囊孵化有明显抑制作用，第10天平均抑制率89.4％。
实施例2：菌株HMQAU090439N对禾谷孢囊线虫的盆栽防效
每个纸杯中加入混匀的5g带菌麦粒和200g禾谷孢囊线虫病土，每杯播种一粒小麦种子，20℃恒温培养，以加入未混带菌麦粒的病土纸杯为对照，每处理5次重复，第60d调查小麦根部侵染情况。将杯中小麦根及土壤全部取出，用清水清洗，检查记录根部及60目筛子上白色雌虫的数量。计算孢囊减退率。用次氯酸钠- 酸性品红染色法，观察小麦根组织，统计J2侵染量，并测定小麦地上部鲜重。
孢囊减退率＝((对照孢囊数-处理孢囊数)/对照孢囊数)×100％
J2侵染抑制率＝((对照J2侵染量-处理J2侵染量)/对照J2侵染量)×100％
盆栽试验结果显示，第60d时，带菌麦粒处理组和对照组的单株小麦根部平均孢囊数分别为42.2个和110.8个，孢囊减退率为61.9％；带菌麦粒处理组和对照组的单株小麦地上鲜重分别为1.4克和0.7克，处理组的鲜重增加了100％；带菌麦粒处理和对照的单株小麦J2侵染量分别为42.4条和53条，J2侵染抑制率为20％。表明接种带菌麦粒的处理组中禾谷孢囊线虫的孢囊减少明显，小麦长势良好，J2侵染量降低。菌株HMQAU090439N对禾谷孢囊线虫病有较好的防治效果。
实施例3：菌株HMQAU090439N对禾谷孢囊线虫的田间防效
于秋季小麦播种时，将长20cm，直径4cm的塑料管底端用纱布封住，每管加入混匀5g带菌麦粒与200g未感染CCN的健康土后，每管播种三粒小麦种子，埋入田间，以只加入未感染CCN的健康土为对照，每处理5次重复，待小麦出苗后，每塑料管中接种20个禾谷孢囊线虫的孢囊。四月中旬调查小麦根部侵染情况。将管中小麦根及土壤全部取出，用清水清洗，检查记录根部及60目筛子上白色雌虫的数量。计算孢囊减退率。用次氯酸钠-酸性品红染色法，观察小麦根组织，统计J2侵染量。
田间试验结果显示，4月15号时，带菌麦粒处理组和对照组的单株小麦根部平均孢囊数分别为4.8个和7.8个，孢囊减退率为38.4％；带菌麦粒处理和对照的单株小麦J2侵染量分别为3.4条和8.2条，J2侵染抑制率为58.54％。表明接种带菌麦粒的处理组中禾谷孢囊线虫孢囊减少明显，小麦长势良好，J2侵染量降低。菌株HMQAU090439N对禾谷孢囊线虫病有较好的防治效果。
实施例1，2，3结果表明，菌株HMQAU090439N及其发酵滤液对禾谷孢囊线虫有很好的生防效果，既能寄生禾谷孢囊线虫孢囊，对孢囊孵化有较强的抑制效果，又对J2有较高的毒杀作用。
实施例4：菌株HMQAU090439N的鉴定。
(1)形态鉴定
在PDA平板上25℃培养7天，菌落直径7.0cm，菌落黄色，絮状。菌丝无色或淡黄色，孢子量大，单胞无色，长3-10μm，宽2-4μm，棍棒型或长卵形。产孢结构密集，孢子着生在产孢梗末端疣状凸起上。
(2)分子鉴定
用SDS法提取菌株HMQAU090439N基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用引物对ITS1/ITS4扩增rDNA-IITS片段。所述引物序列为ITS 1：TCC GTA GGT GAA CCT GCG C；ITS 4：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC。扩增反应体系：10×Buffer 2.5μL，5mM dNTP 2μL，10μM引物各1μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA 1μL，补水至25μL。ITS-PCR程序：94℃预变性3min，94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸1min，共计34个循环，最后72℃延伸7min，循环结束后4℃保存。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，由生工生物工程(上海)有限公司进行纯化和双向测序，测序结果经Seqman5.0软件自动装配后导出重叠群(Contig)并在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)数据库中进行序列对比，并用MEGA 5.05软件采用邻接法(neighbor–joining analysis，NJ)构建系统发育树，其中Bootstrap检验的重复次数为1,000次。结果表明，菌株HMQAU090439N为Coprinelllus radians。
综合以上形态特征和rDNA-ITS序列系统发育分析，结果可知菌株HMQAU090439N属于辐毛小鬼伞(Coprinelllus radians)。
上述辐毛小鬼伞菌株HMQAU090439N的鉴定方法，包括以待测菌株的基因组DNA为模板，以ITS1和ITS4为引物的扩增，如果所得PCR产物为SEQIDNo:1所示的核苷酸序列，即为HMQAU090439N菌株。
<110> 青岛农业大学
<120> 一株防治及其应用
<160> 1
<210> 1
<211> 685
<212> DNA
<213> 辐毛鬼伞(Coprinelllus radians)HMQAU090439N
<400> 1
TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA ACGAATAACT ATGGCGTTGG TTGTAGCTGG 60
CTCCTCGGAG CAATGTGCAC GCCCGCCATT TTTATCTTTC CACCTGTGCA CCGACTGTAG 120
GTCTGGATAC CTCTCGCCTC CGGGCGGATG CGAGGGTTGC TCGTAAGGGC TTCCCTTGAA 180
CTTCCAGGCT CTACGTCTTT TTACACACCC CAATAGTATG ATGCAGAATG TAGTCAATGG 240
GCTTCTCAGC CTATAAAACA CTATACAACT TTCAGCAACG GATCTCTTGG CTCTCGCATC 300
GATGAAGAAC GCAGCGAAAT GCGATAAGTA ATGTGAATTG CAGAATTCAG TGAATCATCG 360
AATCTTTGAA CGCACCTTGC GCTCCTTGGT ATTCCGAGGA GCATGCCTGT TTGAGTGTCA 420
TTAAATTCTC AACCTCACCA GTTTTCTGAA CTGACTGAGG CTTGGATGTG GGGGTTTGTG 480
CAGGCTGCCT CACCGGCGGT CTGCTCCCCT GAAATGCATT AGCGAGGTTC ATGCTGGACC 540
TCCGTCTATT GGTGTGATAA TTATCTACGC CGTGGACGAG GATACAGACT CGCTTCTAAC 600
CGTCCGCGAG GACAATACCT TGACAATTTG ACCTCAAATC AGGTAGGACT ACCCGCTGAA 660
CTTAAGCATA TCAATAAGCG GAGGA 685