技术领域
本发明涉及一种微藻的培养方法，具体涉及一种利用鸡粪降解液异养培养微藻的方法。
背景技术：
世界原油产量持续减少，预计到2018年将下降至75亿桶/年，仅相当于1950年原油产量。生物柴油是指由植物油、动物脂肪以及微生物胞内油脂与短链醇，经酯交换反应得到的有机脂肪酸酯类物质，作为可再生替代能源，环境友好性和可再生性使其具有很强的竞争力。微藻具有生长周期短、速度快等特点，因而通过微藻培养合成生物油脂进而制备生物柴油是最有效途径之一。
微藻能够利用自然界中的光能和无机碳源进行光合培养，但是光合培养存在着生长速度慢、最终生物量低、生长周期长的缺点。另外，微藻在不需要光照的条件下能够利用有机物作为碳源和氮源进行异养培养，异养培养具有生长速度快、最终生物量高的优点，能够缩短周期。
微藻生物柴油生产的最终目的是用最低的成本获得最大的脂质生产。与光合培养相比，异养培养微藻主要考虑的是碳和氮来源的成本。
例如中国专利文献CN 102746992 A（申请号 201210244511.9）公开了一种利用污泥水解液异养培养小球藻的方法，先取生活污水处理厂的剩余污泥，浓缩后超声处理；将超声处理后的污泥在转速为180r/min，温度为35℃的条件下，进行厌氧水解2至3天；向得到的污泥水解液中加入微量元素和其他营养元素，高压蒸汽灭菌后得培养液；将培养液冷却至室温后，将小球藻接种至培养液中，置于振荡培养箱中培养150h～180h，完成小球藻的培养。但是污泥降解液的含氮量不高，而且降解液中含有大量重金属，抑制微藻生长。
家禽粪便(PM)富含营养盐，特别是氮，其容量可通过组合达到55.7g/L。此外，除了丰富的氮、钾、磷外，微量元素如镁、钙、铁、铜、锌等也存于PM降解液中。因此PM是一种有价值的主要营养素的来源，如果营养盐能被高效率的吸收，那么对于微藻培养，PM绝对是一个可开发的有效资源。
鸡粪(CM)作为一种典型的PM，富含有机氮、磷等元素。中国专利文献CN 103756908（申请号 201410014303.9）公开了一种微藻有机培养液的配制方法，将从养鸡场运输的鸡粪，放置在操场上，在温度为20℃～28℃的条件下曝晒8天，然后用筛子除去鸡粪中的石、沙、羽毛；将曝晒干燥后的鸡粪与100℃的废水按照1∶10的比例混合，并充分搅拌；将搅拌后得到的溶液浸泡3h，浸泡过程中对其进行充分搅拌；浸泡后得到的培养液通过24目的筛网过滤，滤网上方的溶质与其他进行浸泡的鸡粪混合使用，得到的溶液为小球藻培养液的原液；将过滤得到的培养液原液进行稀释，得到小球藻培养液；将10%～20%的小球藻藻种与80%～90%小球藻培养液混合，进行小球藻培养。鸡粪中的碳、氮等营养元素均以有机物的形式存在，上述对鸡粪的处理方法不能将有机氮分解为无机氮如氨态氮和硝态氮从而被微藻所吸收，因而鸡粪的营养物质利用率较低。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用鸡粪降解液异养培养微藻从而促进微藻合成生物油脂的方法。
实现本发明目的的技术方案是一种利用鸡粪降解液异养培养微藻的方法，包括以下步骤：
①鸡粪降解；
取养鸡场的新鲜鸡粪，用蒸馏水稀释、搅匀得到鸡粪稀释液。
取鸡粪稀释液转移入三角瓶中，在三角瓶的瓶口用纱布封住瓶口，然后将三角瓶分别转移至摇床中，在40rpm～60rpm的转速下降解4～6天后获得降解后的物料，过滤得到低氮降解液，低氮降解液杀菌后转移至冰箱保存待用。
另取鸡粪稀释液转移入三角瓶中，在三角瓶的瓶口用纱布封住瓶口，然后将三角瓶分别转移至摇床中，在240rpm～260rpm的转速下降解4～6天后获得降解后的物料，过滤得到高氮降解液，高氮降解液杀菌后转移至冰箱保存待用。
②微藻异养培养；
先对微藻种子进行摇床培养，在三角瓶中装入微藻培养液，从保贮斜面上取微藻细胞接种到三角瓶中的对应微藻的培养液中，然后将三角瓶放在摇床上，设置转速140～160转/分钟，培养温度28℃～32℃，培养65～75 h。
然后将摇床上培养后得到的微藻液以8%～12%(v/v)接种量接种到培养罐中，培养罐中已加入对应微藻的培养液,微藻异养培养180～220h后完成微藻的异养培养；其中异养培养过程中，在异养培养开始至第100～120小时内，以14～16 mL/L/Day向培养体系添加步骤①准备的高氮降解液，然后从第100～120小时直至培养期结束，以14～16 mL/L/Day向培养体系添加步骤①准备的低氮降解液。
上述步骤①的低氮降解液的总氮、硝氮、氨氮含量分别为0.50～0.8g/L、130～260mg/L、300～360mg/L；高氮降解液的总氮、硝氮、氨氮含量分别为1.05～1.5g/L、780～910mg/L、70～120mg/L。
上述步骤②微藻异养培养时，培养体系的pH控制在5.0～7.0，温度28～32℃，通气速率0.8～1.2vvm，搅拌转速180～220rpm。
作为优选的，培养体系的pH调节剂为硫酸或NaOH水溶液。
作为优选的，步骤①得到的低氮降解液在115℃～121℃下杀菌15～25分钟，转移至冰箱 3℃～6℃下保存待用；步骤①得到的高氮降解液在115℃～121℃下杀菌15～25分钟，转移至冰箱 3℃～6℃下保存待用。
本发明具有积极的效果：（1）本发明在利用鸡粪降解液异养培养微藻时，首先在不同条件下对鸡粪进行降解，获得含氮量高的降解液和含氮量低的降解液；然后将微藻种子接种到其对应的培养液中后，在培养期前段即前100～120h向培养体系中添加高氮降解液，此阶段微藻细胞增长迅速；在培养期的后段向培养体系中添加低氮降解液，此时的培养体系利于微藻油脂合成；培养结束后微藻藻体量较高，并且培养得到的微藻的油脂含量高。
（2）由于本发明的鸡粪降解液中除了丰富的氮、钾、磷外，还含有微量元素如镁、钙、铁、铜、锌等，在整个微藻培养过程中，向培养液中直接加入鸡粪高、低氮降解液即可，无需另外加入氮源，因而整个过程效率高、节省能源和成本。
（3）本发明培养微藻的方法工艺简单、经济、环保，符合循环经济发展的需要，具有良好的工业应用前景。
具体实施方式
（实施例1）
本实施例异养培养的微藻是小球藻(Chlorella protothecoides)，购买自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库，保藏编号为FACHB-3。
本实施例的利用鸡粪降解液异养培养微藻的方法包括以下步骤：
①鸡粪降解。
首选对鸡粪降解的条件进行筛选。
取养鸡场的新鲜鸡粪300mL，该鸡粪的含水率为70%～75%，向其中加入同体积即300mL的蒸馏水稀释，搅匀后的鸡粪稀释液分别装入6个三角瓶中，每个三角瓶中所装的稀释后的鸡粪体积为30mL～50mL，本实施例中每瓶所装物料的体积为30mL。
在每个三角瓶的瓶口用纱布封住瓶口，然后将各个三角瓶分别转移至摇床中，分别在50rpm、100rpm、150rpm、200rpm、250rpm、及300rpm的转速下降解4～6天（本实施例中为5天）后获得6份降解后的物料，过滤得到6份降解液，每份降解液在121℃下杀菌20分钟，转移至冰箱 4℃下保存。
分别测定上述6份降解液中氨氮(NH4-N)、硝氮(NO3-N)和总氮(TN)含量，选择其中总氮含量最高的降解液和总氮含量最低的降解液作为本实施例微藻培养使用的降解液。
检测发现摇床转速为50rpm的条件下获得的降解液的总氮含量最低，其总氮、硝氮、氨氮含量分别为0.56～0.64g/L、140～180mg/L、330～360mg/L，将摇床转速50rpm作为低氮鸡粪降解液的降解条件。
摇床转速为250rpm的条件下获得的降解液的总氮含量最高，其总氮、硝氮、氨氮含量分别为1.18～1.34g/L、830～860mg/L、 110～120mg/L，将摇床转速250rpm作为高氮鸡粪降解液的降解条件。
确定上述降解条件后，鸡粪降解时：
取养鸡场的新鲜鸡粪600mL，向其中加入同体积即600mL的蒸馏水稀释，搅匀后分别装入2个三角瓶中，每个三角瓶中所装的稀释后的鸡粪体积为100mL；在每个三角瓶的瓶口用纱布封住瓶口，然后将各个三角瓶分别转移至摇床中，分别在50rpm和250rpm的转速下降解5天后获得2份降解后的物料，过滤得到2份降解液，每份降解液在121℃下杀菌20分钟，转移至冰箱 4℃下保存待用。
在50rpm的转速下降解获得的降解液为低氮降解液，在250rpm的转速下降解获得的降解液为高氮降解液。
②微藻异养培养。
先对小球藻种子进行摇床培养：准备5至10个250mL的三角瓶，在每个250mL的三角瓶中装入50mL小球藻培养液，从保贮斜面上取一定量小球藻细胞接种到各个三角瓶中的培养液中，然后将各个三角瓶放在摇床上，设置转速140～160rpm，培养温度28℃～32℃，培养65h～75 h。
所述小球藻培养液中除Bold’s basal media （BBM）培养基外，还包括下列物质 (g/L):葡萄糖 10.0，酵母粉2.0，甘氨酸 1.0。
BBM培养基中的主要物质为 (g/L)： NaNO3 0.25， MgSO4.7H2O 0.075， NaCl 0.025， K2HPO4.3H2O 0.075， KH2PO4 0.175， CaCl2.2H2O 0.025， 微量物质为 (10-3g/L): ZnSO4.7H2O 8.82， MnCl2.4H2O 1.44，MoO3 0.71，CuSO4.5H2O1.57， Co(NO3)2.6H2O 0.49，H3BO3 11.42，EDTA 50.0，KOH 31.0 ， FeSO4.7H2O 4.98。
然后将摇床上培养后得到的小球藻液以8%～12%(v/v)接种量接种到5L的培养罐中，培养罐中小球藻培养液体积为2.5～3.5L,微藻异养培养过程中培养体系的pH控制在5.0～7.0，温度28～32℃，通气速率0.8～1.2vvm，搅拌转速180～220rpm，培养时间180～220h（本实施例为200h）。
异养培养过程中，在异养培养开始至第100～120小时内，以14～16 mL/L/Day向培养体系添加高氮降解液，即每天按照培养罐中每1L液体体积添加14～16 mL降解液的量添加；然后从第100～120小时直至培养期结束，以14～16 mL/L/Day向培养体系添加低氮降解液。
培养体系的pH调节剂为4M～6M（本实施例中为5M）的 硫酸或NaOH水溶液。
培养结束检测小球藻的藻体量为7.47～7.68g/L, 油脂浓度为4.56～4.73 g/L。
若不向培养体系加入鸡粪降解液，仅使用小球藻培养液进行异养培养，按照本实施例步骤②的培养条件，培养结束获得的小球藻的藻体量为5.73～6.12g/L, 油脂浓度为2.83～3.09 g/L。
可见本实施例通过向培养体系添加鸡粪降解液，并且在不同的培养阶段添加不同含氮量的降解液，使得培养结束后微藻藻体量较高，并且培养得到的微藻的油脂含量高。
（实施例2）
本实施例的利用鸡粪降解液异养培养微藻的方法其余与实施例1相同，不同之处在于：
步骤②中所培养的微藻为角刺藻（Chaetoceros gracilis）。培养时所用的培养液为角刺藻培养液。异养培养时间220h。
培养结束后检测角刺藻(Chaetoceros gracilis)的藻体量为3.34～3.67g/L, 油脂浓度为1.13～1.25 g/L。
若不向培养体系加入鸡粪降解液，按照本实施例步骤②的培养条件，培养结束获得的角刺藻的藻体量为2.34～2.56g/L, 油脂浓度为0.61～0.72 g/L。
（实施例3）
本实施例的利用鸡粪降解液异养培养微藻的方法其余与实施例1相同，不同之处在于：
步骤②中所培养的微藻为微藻琴式菱形藻（Psammodictyon panduriforme）。培养时所用的培养液为微藻琴式菱形藻培养液。异养培养时间190h。
培养结束后检测微藻琴式菱形藻的藻体量为0.82 g/L～0.96g/L, 油脂浓度为0.46～0.52 g/L。
若不向培养体系加入鸡粪降解液，按照本实施例步骤②的培养条件，培养结束获得的微藻琴式菱形藻的藻体量为0.55～0.62g/L, 油脂浓度为0.23～0.28g/L。
（实施例4）
本实施例的利用鸡粪降解液异养培养微藻的方法其余与实施例1相同，不同之处在于：
步骤①中将6个三角瓶分别在40rpm、90rpm、140rpm、190rpm、240rpm、及290rpm的转速下降解4～6天（本实施例中为5天）后获得6份降解后的物料，过滤得到6份降解液。分别测定上述6份降解液中氨氮(NH4-N)、硝氮(NO3-N)和总氮(TN)含量，40rpm的条件下获得的降解液的总氮含量最低，将摇床转速40rpm作为低氮鸡粪降解液的降解条件；240rpm的条件下获得的降解液的总氮含量最高，将摇床转速240rpm作为高氮鸡粪降解液的降解条件。
然后分别在40rpm和240rpm的转速下降解6天后获得2份降解液，在40rpm的转速下降解获得的降解液为低氮降解液，其总氮、硝氮、氨氮含量分别为0.51～0.57g/L、132～148mg/L、305～313mg/L。
在240rpm的转速下降解获得的降解液为高氮降解液，其总氮、硝氮、氨氮含量分别为1.09～1.21g/L、780～820mg/L、90～100mg/L。
步骤②培养结束后检测小球藻的藻体量为7.32～7.53g/L, 油脂浓度为4.28～4.49 g/L。
若不向培养体系加入鸡粪降解液，按照本实施例步骤②的培养条件，培养结束获得的小球藻的藻体量为5.73～6.12g/L, 油脂浓度为2.83～3.09 g/L。
（实施例5）
本实施例的利用鸡粪降解液异养培养微藻的方法其余与实施例1相同，不同之处在于：
步骤①中将6个三角瓶分别在60rpm、110rpm、160rpm、210rpm、260rpm、及310rpm的转速下降解4～6天（本实施例中为5天）后获得6份降解后的物料，过滤得到6份降解液。分别测定上述6份降解液中氨氮(NH4-N)、硝氮(NO3-N)和总氮(TN)含量，60rpm的条件下获得的降解液的总氮含量最低，将摇床转速60rpm作为低氮鸡粪降解液的降解条件；260rpm的条件下获得的降解液的总氮含量最高，将摇床转速260rpm作为高氮鸡粪降解液的降解条件。
然后分别在60rpm和260rpm的转速下降解6天后获得2份降解液，在60rpm的转速下降解获得的降解液为低氮降解液，其总氮、硝氮、氨氮含量分别为0.65～0.76g/L、240～260mg/L、320～350mg/L。
在260rpm的转速下降解获得的降解液为高氮降解液，其总氮、硝氮、氨氮含量分别为1.21～1.49g/L、870～910mg/L、70～90mg/L。
步骤②培养结束后检测小球藻的藻体量为7.51～7.72g/L, 油脂浓度为4.49～4.68 g/L。
若不向培养体系加入鸡粪降解液，按照本实施例步骤②的培养条件，培养结束获得的小球藻的藻体量为5.73～6.12g/L, 油脂浓度为2.83～3.09 g/L。