肿瘤抗原NY‑ESO‑1的CTL识别表位肽及其应用的制作方法

本发明涉及表位肽技术领域，尤其涉及一种特异性肿瘤抗原NY-ESO-1的CTL识别表位肽及其应用，还涉及一种肿瘤抗原NY-ESO-1特异性DC细胞的制备方法及其应用，以及一种肿瘤抗原NY-ESO-1特异性DC-CIK细胞的制备方法及其应用。

背景技术：

肿瘤-睾丸抗原(Cancer-testis Antigen，CTA)，主要在正常睾丸和多种肿瘤组织中表达，在其他正常组织中几乎不表达。NY-ESO-1是肿瘤-睾丸抗原家族中的一种，定位于X染色体，编码一种膜相关蛋白,是所知的免疫原性最强的肿瘤抗原之一，能同时引起细胞免疫和体液免疫。NY-ESO-1在如食管癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌等多种类型的肿瘤中广泛表达，在NY-ESO-1阳性的肿瘤患者体内常可以检测到NY-ESO-1抗体的存在，提示其可以作为肿瘤治疗潜在靶点。

随着生物技术的快速发展以及对肿瘤发生发展机制研究的深入，肿瘤免疫治疗领域不断取得新的成果，其中，过继性细胞免疫治疗是该领域的热点。过继性细胞免疫治疗是指从自体或异体提取免疫细胞并在体外扩增培养达一定数量后再回输病人体内，实现抗瘤作用的治疗方法。过继性细胞免疫治疗能够避开体内肿瘤免疫障碍的多种机制，调动机体自身的免疫功能来发挥抗瘤作用。

目前用于过继性细胞免疫治疗的细胞主要有NK、DC-CIK等，其中DC-CIK细胞免疫疗法就是将DC细胞和CIK细胞共培养获得的一种新的具有特异性抗瘤活性的细胞群。DC-CIK细胞可以显著抵制肿瘤细胞的生长、增殖，帮助机体恢复同肿瘤细胞作斗争的能力，最大限度地调动人体免疫功能，全方位防止复发和转移，明显改善患者的生活质量，有效延长患者的寿命。

目前，用于有效诱导DC-CIK细胞的抗原十分有限，发现以及制备能够高效刺激肿瘤特异性DC-CIK的CTL表位多肽抗原将会提高这一技术的实用性。

技术实现要素：

基于背景技术存在的技术问题，本发明目的在于提供一种特异性肿瘤抗原NY-ESO-1的CTL识别表位肽。

本发明目的还在于提供上述特异性肿瘤抗原NY-ESO-1的CTL识别表位肽的应用。

本发明目的还在于提供一种肿瘤抗原NY-ESO-1特异性DC细胞的制备方法。

本发明目的还在于提供一种肿瘤抗原NY-ESO-1特异性DC-CIK细胞的制备方法。

本发明目的还在于提供上述肿瘤抗原NY-ESO-1特异性DC细胞和DC-CIK细胞的应用。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

本发明提出的一种特异性肿瘤抗原NY-ESO-1的CTL识别表位肽，所述CTL识别表位肽为十五肽，其氨基酸序列如下：Gly-Ala-Ala-Arg-Ala-Ser-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly-Ala-Pro-Arg-Gly，分子量为1238.34。

上述特异性肿瘤抗原NY-ESO-1的CTL识别表位肽采用固相合成法进行合成。基本流程如下：首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上；其次将第二个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸的羧基缩合剂活化，活化后的第二个氨基酸羧基再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的肽，再经HPLC纯化，其纯度大于90％。

本发明还提出的上述特异性肿瘤抗原NY-ESO-1的CTL识别表位肽在制备具有NY-ESO-1表达的肿瘤治疗性多肽疫苗的应用。

优选地，上述特异性肿瘤抗原NY-ESO-1的CTL识别表位肽在制备黑色素瘤治疗性多肽疫苗中的应用，尤其对黑色素瘤细胞A375具有杀伤力。

本发明还提出的一种肿瘤抗原NY-ESO-1特异性DC细胞的制备方法，采用上述特异性肿瘤抗原NY-ESO-1的CTL识别表位肽加入DC细胞进行培养得到。

本发明还提出的上述肿瘤抗原NY-ESO-1特异性DC细胞的制备方法得到的特异性DC细胞在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。

本发明还提出的一种肿瘤抗原NY-ESO-1特异性DC-CIK细胞的制备方法，采用上述特异性肿瘤抗原NY-ESO-1的CTL识别表位肽进行诱导得到。

本发明还提出的上述肿瘤抗原NY-ESO-1特异性DC-CIK细胞的制备方法得到的特异性DC-CIK细胞在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。

本发明巧妙利用NY-ESO-1在多种常见肿瘤如神经母细胞瘤、滑膜肉瘤、恶性黑色素瘤、卵巢上皮癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌等均存在生存素(NY-ESO-1)异常表达，但在正常成人组织除睾丸外不表达或呈低表达。理论和实验相结合的方法筛选得到肿瘤相关抗原的表位肽，所得表位肽未见文献报道，为研制基于抗原NY-ESO-1的肿瘤疫苗或肿瘤特异性CTL细胞的制备提供理论基础，并为后续多价的抗原肽疫苗构建奠定基础。

附图说明

图1为本发明提出的一种特异性肿瘤抗原NY-ESO-1的CTL识别表位肽的质谱分析图。

图2为本发明实施例1所得P1、P2、P3……P20各自诱导得到的特异性CTL细胞分泌INF-γ的能力对比图。

图3为本发明实施例1所得P3、P5、P7各自诱导得到的特异性CTL细胞对黑色素瘤细胞A375杀伤能力对比图。

图4由本发明提出的一种特异性肿瘤抗原NY-ESO-1的CTL识别表位肽所制备得到的特异性CTL细胞免疫细胞群的流式细胞仪检测数据的统计分析图。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1：合成表位肽

采用理论与实践相结合的方法，根据抗原的一级结构，综合运用免疫信息学手段，运用SYFPEITHI、BIMAS、NetCTL、WAPP和EpiJen综合对NY-ESO-1的抗原CTL表位进行预测分析，选取评分前20的多肽序列进行试验筛选，依次命名为P1、P2、P3……P20。

基本流程如下：首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上；其次将第二个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸的羧基缩合剂活化，活化后的第二个氨基酸羧基再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的表位肽粗品。将目的表位肽粗品经HPLC纯化得到目的表位肽精肽，其纯度大于90％，质谱分析证实其分子量符合理论值。

本发明提出的一种特异性肿瘤抗原NY-ESO-1的CTL识别表位肽采用Fmoc固相合成法进行合成，所述CTL识别表位肽为十五肽，编号为P7，其氨基酸序列如下：Gly-Ala-Ala-Arg-Ala-Ser-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly-Ala-Pro-Arg-Gly。对P7进行质谱分析，其质谱分析结果如图1所示，可以证实其分子量为1238.34g/mol，符合理论值。

实施例2：多肽功能检测

上述所得P7和其余19个表位肽可用于制备具有NY-ESO-1表达的肿瘤治疗性多肽疫苗，其应用实验如下：

1、上述CTL识别表位肽诱导特异性CTL细胞、IFN-γ分泌及对肿瘤靶细胞的杀伤实验检测：抽取患者的外周血经密度梯度离心分离，获得PBMCs，添加细胞因子培养DC细胞和CTL细胞，进一步采用DC细胞负载本发明的NY-ESO-1表位肽，与CTL共培养刺激特异的CTL扩增，进一步在体外采用ELISAPOT和LDH实验检测特异的CTL在特异抗原刺激下INF-γ的分泌及对黑色素瘤细胞A375的杀伤作用。

具体方法如下：

(I)、PBMC的分离与诱导：

1)将50mL抗凝处理的外周血，2000rpm离心10min；

2)收集上层血浆冻存，用PBS(pH＝7.4)稀释剩下的血细胞；

3)将稀释的血细胞加入到等体积的淋巴分离液液面上；

4)20℃离心20min，关闭离心机刹车；

5)离心后，分为四层，用吸嘴玻璃滴管吸取白膜层(即第二层)；

6)取出的白膜层用PBS洗涤两遍；

7)将细胞以2～5×10⁶/mL接种到6孔板内，2h后，回收未贴壁的细胞，用预包被anti-CD3IgG和anti-CD28IgG的培养板进行激活培养；

8)贴壁的细胞加入GM-CSF和IL-4刺激培养5天诱导成DC细胞，第三天半换液；

9)第5天，收集DC细胞，将10μg实施例1所得目的表位肽精肽加入DC细胞中，1h后，将DC细胞与激活的T细胞共培养，同时加入IL2及IL-15；

10)继续培养5天后，得到抗原特异的CTL细胞进行细胞因子分泌及对肿瘤细胞的杀伤实验。

(II)、IFN-γ细胞因子分泌检测：Human IFN-gamma Platinum ELISA(IFN-γELISA检测试剂盒，eBioscience公司)检测CTL细胞分泌的IFN-γ，步骤如下：

1)将CTL细胞去除细胞因子培养24h后，接种到96孔板内；

2)细胞中加入刺激对应的多肽再次刺激24h后，离心去除细胞，收集细胞上清；

3)采用ELISA检测上清中IFN-γ的表达，选择IFN-γ分泌较多的CTL表位肽进行杀伤实验。

结果如图2所示，P7和P3、P5负载的DC细胞均能够较好诱导出特异性CTL细胞，分泌较高量的IFN-γ。

(III)、肿瘤细胞杀伤实验：采用乳酸脱氢酶(LDH)释放检测法，使用CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(细胞毒性检测试剂盒，Promega公司)进行LDH试验检测细胞杀伤能力。步骤如下：

1)设立检测培养板(100μL/孔)

a.设立实验组：以NY-ESO-1阳性表达的黑色素瘤细胞A375为靶细胞，按效应细胞和靶细胞比为5:1、10:1、20:1加入上述特性CTL细胞

b.设立效应细胞自发释放组

c.设立靶细胞自发释放组

d.设立靶细胞最大释放组

e.设立背景对照组

2)细胞裂解及收获上清

a.37℃5％CO₂共培养5h

b.靶细胞最大释放组中加入裂解液，45min后，所有的孔，250g/min离心收集上清

3)LDH检测

a.转移50μL上清至另一个96孔板

b.每孔加入50μL稀释的底物混合物，室温避光孵育30min

c.每孔添加50μL终止液

d.在490nm下检测吸光值OD

细胞杀伤率计算公式如下：

杀伤率(％)＝[(OD_实验组-OD_{效应细胞自发释放组}-OD_{靶细胞自发释放组})/(OD_{靶细胞最大释放组}-OD_{靶细胞自发释放组})]×100％

结果如图3所示，图3为本发明实施例1所得P3、P5、P7各自诱导得到的特异性CTL细胞对黑色素瘤细胞A375杀伤能力对比图；由图3可知，P3和P7诱导的CTL细胞对黑色素瘤细胞A375均具有较好的杀伤效果。

2、采用流式分析获得的特异CTL中各种免疫细胞所占的百分比，结果如图4所示。由图4可知，本发明由P7制备获得的免疫细胞群中含有大量的CTL细胞，同时也含有一定比例的NKT细胞，即该免疫细胞群具有较好的免疫活性，具有强大的杀伤特定肿瘤细胞的能力。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。