一种采用线粒体移植促进损伤神经元存活的方法与流程

本发明涉及一种基于干细胞的生物技术，是一种应用间充质干细胞来源的线粒体移植来促进损伤神经元存活和恢复的方法。

背景技术：

脊髓损伤过程中经历了原发性和继发性损伤，导致神经细胞损伤和缺失，神经传导的破坏。近年来，随着干细胞生物学及其再生技术的发展，人们发现外源性干细胞移植可以显著提高受损伤神经元的存活，促进神经元功能的恢复。但是同种异体的外源性干细胞移植，会遇到免疫原性问题。干细胞在体内最终都将分化为成熟的细胞，而成熟细胞细胞均表达（MHC/HLA）分子，只要是异体来源的干细胞，都会面临免疫排斥问题。因此，如何能够解决干细胞的免疫原性问题，而又能获得干细胞的保护效果，是一项重要的挑战。

近年来，有重要的研究揭示干细胞可以通过隧道纳米管的结构，向其他受损伤细胞输送细胞器，包括线粒体。线粒体进入细胞后，改变接受线粒体的细胞的生物学特性，显著促进损伤细胞的存活等。本发明分离获得干细胞源性线粒体，不仅在体外显著促进损伤的运动神经元存活。而且，大鼠脊髓损伤(SCI)后接受线粒体移植6周后，其损伤的脊髓结构再生、运动功能得到显著提高，并且来源于线粒体移植能够达到骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植的促进运动功能恢复的相似效果。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种采用线粒体移植促进损伤神经元存活的方法，为运动神经元损伤疾病的治疗提供更为安全、有效的理论基础和依据。

实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种采用线粒体移植促进损伤神经元存活的方法，包括如下步骤：

1)P₁-P₃代骨髓间充质干细胞，0.25%胰酶消化离心，计数细胞数量；

2)运用线粒体分离试剂盒（ThermoFisherScientific），根据试剂盒的操作手册，分离获得线粒体，进行线粒体蛋白定量和ATP含量测定；

3)将步骤2）分离所得线粒体，制备混悬液，移植到神经元损伤区，使线粒体与神经元细胞充分接触。

在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：

所述线粒体来源于间充质干细胞，包括BMSCs，胚胎来源的间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、脐带血来源的间充质干细胞等其他各种来源的间充质干细胞。

进一步地，所述线粒体的来源为新鲜分离（未冻存）间充质干细胞。也可以根据需要，将间充质干细胞来源的线粒体-80度冻存，需要的时候（1周之内），取出线粒体进行复苏，同样进行使用，但是要适当增加线粒体的用量。

所述移植是指，将线粒体与神经元受损部位进行点接触、线接触和/或面接触。

所述移植的时间为神经元损伤后的一定时间内，最好是在神经元损伤后即刻进行移植。

所述移植的部位为神经元损伤的中心部位，也可以是周边部位或者能够与神经元细胞进行接触的其他部位（比如尾静脉或者股静脉注射），所述移植的部位为至少一处。

单部位移植的线粒体量为100~1000 μg。每个移植点移植线粒体悬液约10 μl，移植总量约40 μl，线粒体总量保持在100~1000 μg。

进一步地，本发明采用的是线粒体H-DMEM混悬液。移植时候，可以根据需要，制备线粒体磷酸缓冲液混悬液、线粒体生理盐水混悬液等进行移植。

本发明的有益效果是：

1)采用间充质干细胞来源的线粒体与直接的间充质干细胞移植比较，做到了无细胞移植方式, 避免了在体内的干细胞移植的同种异体之间的免疫原性问题。

2)采用间充质干细胞来源的线粒体与直接的间充质干细胞移植处理效果相比，可以获得间充质干细胞移植促进神经元细胞再生、运动功能恢复的相似效应。

3)采用间充质干细胞来源的线粒体与直接的间充质干细胞移植比较，避免了异体来源的干细胞核染色体的植入。

附图说明

图1是MitoTrackerRed标记的干细胞线粒体与损伤的运动神经元（VSC4.1 motor neuron）孵育24 h的显微镜观测图。图中，激光共聚焦荧光显微镜显示线粒体进入损伤神经元胞浆，即MitoTrackerRed红色荧光标记的区域（虚线内区域）。

图2是干细胞线粒体增加损伤运动神经元能量（ATP）的对比图表，其中，**P<0.01,与损伤神经元组相比。

图3是干细胞线粒体促进损伤运动神经元的存活（减少LDH释放）的对比图表，其中，**P<0.01,与损伤神经元组相比。

图4是由MitoTrackerRed标记移植（24小时）的干细胞线粒体在大鼠脊髓损伤神经元中心区域分布显微镜观测图（虚线内，40×）。

图5是干细胞线粒体移植促进大鼠脊髓损伤后后肢运动功能恢复的BBB评分对比图表，其中，*P0.05, **P<0.01,与脊髓损伤组相比。

具体实施方式

实施例1：骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的线粒体（BMSC-MitC）增加损伤运动神经元的ATP。

VSC4.1运动神经元5×10⁴个细胞每孔种于24孔板，氧糖剥夺（OGD 8h）诱导神经元损伤模型。共分三组：OGD模型组；OGD+BMSCs组（5×10⁴ BMSCs/孔，transwell共培养24 h）；OGD+BMSC-MitC组（培养基中加入线粒体，来自于1.7×10⁶BMSCs/孔，孵育4 h）。到时间点后，采用碧云天的ATP试剂盒，进行神经元细胞内ATP含量测定。经过8 h的OGD处理后，神经元的ATP含量降低为正常组的1/3水平，为1.75±0.08 nmol/mg 蛋白；线粒体共培养4h 后，使得ATP 含量显著上升为2.20±0.09 nmol/mg蛋白；BMSCs 共培养24h，使得ATP 含量显著上升为2.48±0.03 nmol/mg 蛋白。线粒体组和干细胞组之间，ATP含量没有显著差异。

实施例2：骨髓间充质干细胞来源的线粒体（BMSC-MitC）促进损伤运动神经元的存活。

VSC4.1运动神经元 5×10⁴个细胞每孔种于24孔板，氧糖剥夺（OGD 8h）诱导神经元损伤模型。共分三组：OGD模型组；OGD+BMSCs组（5×10⁴ BMSCs/孔，transwell共培养24 h）；OGD+BMSC-MitC组（培养基中加入线粒体，来自于1.7×10⁶BMSCs/孔，孵育4 h）。到时间点后，采用LDH检测试剂盒，进行细胞上清液中LDH含量测定。经过8h的OGD处理后，运动神经元上清液中LDH含量显著上升；线粒体共培养4h 后，使得LDH含量显著降低为OGD组的63.40±5.61%；BMSCs 共培养24h，使得LDH 含量显著降低为OGD组的75.52±1.83%。线粒体组和干细胞组之间，LDH释放量没有显著差异。

实施例3：BMSC-MitC移植促进大鼠脊髓损伤后结构再生和功能修复。

大鼠脊髓撞击损伤模型的建立：8周龄雌性SD大鼠，实验前禁食7-12h后，10%的水合氯醛按4 ml/kg行腹腔注射麻醉。1-2 min后，大鼠肌肉放松，疼痛反射消失，麻醉成功。大鼠以俯卧位置于电热毯上，剃除背部的毛，用碘酒由内而外消毒、铺巾。分离暴露T10段脊髓。采用脊髓损伤打击仪（NYU ImpactorII）5cm 高度撞击脊髓。打击后大鼠脊髓硬脊膜下充血，双后肢抽动、甩尾，随后完全松弛。分三组：SCI+溶剂组（H-DMEM）；SCI+线粒体组(来自于3×10⁶BMSCs)；SCI+BMSCs组（1×10⁶）。采用50 μl微量注射器，在脊髓损伤中心点位置，单针注射10 μl，在微量推注泵推送，注射5分钟，留针5分钟。部分SCI大鼠注射MitoTrackerRed染色的线粒体，用以追踪移植的线粒体。注射完毕后，分层缝合，关闭皮肤。将大鼠置于电热毯（37℃）上保暖直至其醒来。苏醒后的大鼠喂饲葡萄糖水，以补充能量。术后大鼠肌肉注射2.5 ml含青霉素10万单位的生理盐水，一日一次，连打3-5天。大鼠正常饮食，分笼饲养。每天两次人工按摩排尿，直至其恢复排尿反射。

线粒体移植后分布情况检测：MitoTrackerRed染色的线粒体移植24 h，10%水合氯醛过量麻醉 SD大鼠，深麻醉后，大鼠仰卧位固定于实验台上；经心脏快速灌注生理盐水 300ml，灌注约 10 分钟，冲洗干净体循环内的血液，右心耳处流出清凉无色的液体。然后采用300ml 4%多聚甲醛的 PBS 灌注固定20 分钟，分离剥出脊髓，小心剪除脊髓两端发出的神经根。而后将脊髓置于 4%多聚甲醛 4℃后固定 6-8h。依次通过 20%、30%蔗糖缓冲液脱水，损伤中心的脊髓行冠状冰冻切片（20 μm厚），滴加DAPI染色细胞核，在荧光显微镜下观察线粒体分布位置并拍照。

术后由两名熟悉BBB评分标准的非实验人员独立观察大鼠，进行BBB评分（Basso, Beattie&Bresnahanlocomotor rating scale，BBB）来评价其后肢的运动恢复情况。即在大鼠脊髓损伤的6周之内，观察其右后肢的运动恢复情况。脊髓损伤造模型前所有动物的后肢运动功能正常，即BBB评分为21±0。脊髓损伤后，所有大鼠的后肢体高位截瘫，BBB评分为0±0。在整个动物实验观察期6周内，所有大鼠的右后肢体运动功能逐步改善，后期可以观察到右后肢3个关节运动。与SCI组相比较，术后第1周至第6周，线粒体移植组的BBB评分有显著的改善(P<0.01)；干细胞移植组的评分也有显著的改善(P<0.01)；线粒体组和干细胞组之间，BBB评分没有显著差异(P>0.05)。

在BBB评分完毕后，每组5只大鼠脊髓分离，4%甲醛固定，进行H&E染色，评价脊髓组织的结构再生情况。H&E染色显示，线粒体移植组的脊髓损伤中心空洞SCI组相比有显著的减小(P<0.01)；干细胞移植组的脊髓损伤中心空洞也比较小，与SCI组相比有显著的减小(P<0.01)，与线粒体组相比没有显著差异 (P>0.05)。

本发明的实施例证实了BMSCs来源的线粒体对于运动神经元损伤有保护作用。本发明制备的间充质干细胞来源的线粒体可以被损伤的运动神经元摄取，提高了细胞内的ATP含量，从而促进了损伤神经元的存活。H&E染色证实了线粒体移植可以显著减小脊髓空洞，显著提高BBB评分，促进了脊髓运动功能的恢复。