高产盐屋霉素及其类似物的产生菌、盐屋霉素及其类似物的制法及其用途的制作方法

本发明涉及药物领域和生物技术工程领域，具体地，高产盐屋霉素及其类似物的产生菌、盐屋霉素及其类似物的制法及其用途。
背景技术：
：硫肽类抗生素是一类富含硫元素、结构被高度修饰的大环聚肽类天然产物，迄今已有大约100个天然成员被发现[chem.rev.,2005,105,685；plosone2012,7,e45878]。这类抗生素选择性的作用于细菌的核糖体，从而抑制其蛋白质的合成[bioorg.med.chem.lett.,2004,14,5573；j.nat.prod.,2009,72,841；j.am.chem.soc.,2008,130,12102]；此外，其强烈的抗疟、抗肿瘤以及免疫抑制等活性也被陆续报到[angew.chem.int.ed.,2012,51,12414]。盐屋霉素(siomycin)是一种由革兰氏阳性菌盐屋链霉菌(streptomycessioyaensis)产生的一类硫肽类抗生素。盐屋霉素作为硫链丝菌素(thiostrepton)的天然类似物，其化学结构与硫链丝菌素相差不大，但是在生物活性方面，siomycin却表现出优于tsr的抗肿瘤效果。另外还有研究发现siomycin具有良好的免疫抑制活性、抑制反刍动物瘤胃中的寄生菌streptococcusbovis从而避免乳酸中毒的活性。目前盐屋霉素产生菌streptomycessioyaensis在发酵第10天的产素量只达到每升毫克级的水平且发酵条件苛刻。此外，为了提高盐屋霉素的抗菌活性以及其他特性，本领域一直在尝试开发盐屋霉素的各类衍生物或类似物，然而迄今为止尚未成功开发出具有活性更高等优点的盐屋霉素类似物。因此，本领域迫切需要开发各类新型的盐屋霉素类似物。因此，本领域迫切需要开发各类新型的盐屋霉素类似物以及高产且发酵条件温和的盐屋霉素产生菌。技术实现要素：本发明的目的在于提供各类新型的盐屋霉素类似物以及高产且发酵条件温和的盐屋霉素产生菌。本发明第一方面提供了一种盐屋霉素类似物或其药学上可接受的盐，所述盐屋霉素类似物具有式i所示的结构：式中，r1选自下组：h、-r3-o-r4、取代或未取代的c1-c6烷基、取代或未取代的c2-c6链烯基、取代或未取代的c2-c6链炔基、取代或未取代的c1-c6烷氧基、取代或未取代的c3-c6环烷基、或其组合；其中，所述取代是指被选自下组的一个或多个取代基取代：卤素、-nh2、-oh、-no2、或cf3；r3为取代或未取代的c1-c2亚烷基而r4为h、取代或未取代的c1-c3烷基；和r2选自下组：h、取代或未取代的c1-c6烷基、取代或未取代的c2-c6链烯基、取代或未取代的c2-c6链炔基、取代或未取代的c1-c6烷氧基、取代或未取代的c3-c6环烷基、或其组合；其中，所述取代是指被选自下组的一个或多个取代基取代：卤素、-nh2、-oh、-no2、或cf3。在另一优选例中，所述r1选自下组：h、-r3-o-r4、取代或未取代的c1-c4烷基、取代或未取代的c2-c4链烯基、取代或未取代的c2-c4链炔基、取代或未取代的c1-c4烷氧基、取代或未取代的c3-c4环烷基、或其组合，其中，所述取代是指被选自下组的一个或多个取代基取代：卤素、-nh2、-oh、-no2、或cf3；r3为c1-c2亚烷基而r4为h、c1-c3烷基。在另一优选例中，所述r2选自下组：h、取代或未取代的c1-c4烷基、取代或未取代的c2-c4链烯基、取代或未取代的c2-c4链炔基、取代或未取代的c1-c4烷氧基、取代或未取代的c3-c4环烷基、或其组合，其中，所述取代是指被选自下组的一个或多个取代基取代：卤素、-nh2、-oh、-no2、或cf3。在另一优选例中，所述r1为-ch2-oh。在另一优选例中，所述r2为c3烷基、c3链烯基、或c3链炔基。在另一优选例中，所述r2为异丙基。在另一优选例中，所述卤素包括f、cl、br或i。在另一优选例中，所述盐屋霉素类似物为光学异构体或外消旋体。在另一优选例中，所述盐屋霉素类似物具有式ia结构：在另一优选例中，所述盐屋霉素类似物为2-丝氨酸-盐屋霉素。本发明第二方面提供了一种药物组合物，包括：(a)本发明第一方面所述的盐屋霉素类似物或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述药物组合物还包括盐屋霉素。在另一优选例中，所述盐屋霉素的结构式如式ii所示：在另一优选例中，组分(a)在药物组合物中的含量为0.0001-99wt％，较佳地，0.01-95wt％，更佳地，0.1-90wt％。在另一优选例中，所述药物组合物还包括其他具有抗菌活性的化合物。在另一优选例中，所述其他具有抗菌活性的化合物选自下组：万古霉素、氯霉素、林可霉素、或其组合。本发明第三方面提供了一种盐屋霉素类似物或其药学上可接受的盐的用途，所述的盐屋霉素类似物或其药学上可接受的盐被(a)用于制备抗菌的组合物；(b)用于抑制微生物生长的组合物；(c)用于制备治疗微生物或细菌感染的组合物；和/或(d)用作饲料添加剂。在另一优选例中，所述组合物选自下组：药物组合物、饲料组合物、或其组合。在另一优选例中，所述的饲料添加剂是抗菌剂。在另一优选例中，所述的微生物或细菌包括革兰氏阳性菌。本发明第四方面提供了一种体外非治疗性地抑制微生物生长或者杀灭微生物的方法，包括步骤：在需要处理的场所使用本发明第一方面所述的盐屋霉素类似物或其药学上可接受的盐。本发明第五方面提供了一种制备药物组合物的方法，包括步骤：将本发明第一方面所述的盐屋霉素类似物或其药学上可接受的盐；和药学上可接受的载体进行混合，从而形成药物组合物。本发明第六方面提供了一种治疗动物细菌感染的方法，包括步骤：给需要治疗的动物使用本发明第一方面所述的盐屋霉素类似物或其药学上可接受的盐或本发明第二方面所述的药物组合物。在另一优选例中，所述的动物包括：哺乳动物、家畜(如牛、猪、羊等)、家禽(如鸡、鸭、鹅等)、水产养殖的动物。本发明第七方面提供了一种制备饲料组合物的方法，包括步骤：将本发明第一方面所述的盐屋霉素类似物或其药学上可接受的盐作为饲料添加剂和饲料原料进行混合，从而形成含有盐屋霉素类似物或其药学上可接受的盐的饲料组合物。在另一优选例中，所述饲料组合物用于家畜(如牛、猪、羊等)养殖、家禽(如鸡、鸭、鹅等)养殖或水产养殖中。本发明第八方面提供了一种产生盐屋霉素及其类似物的工程菌株，所述菌株为劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)，其中，所述菌株中的tsrh基因(硫链丝菌素前体肽基因)被失活或敲除，并且携带产生盐屋霉素及其类似物的表达载体。在另一优选例中，所述劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)为突变的劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)，较佳地为劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)sl-11v-a2s。在另一优选例中，所述劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)sl-11v-a2s的保藏号为cgmcc12736。在另一优选例中，所述盐屋霉素的结构式如式ii所示：在另一优选例中，所述盐屋霉素类似物的结构式如式i所示：本发明第九方面提供了一种如本发明第八方面所述的工程菌株的制备方法，包括步骤：(i)提供一表达载体，所述表达载体携带产生盐屋霉素及其类似物的表达盒；(ii)将所述表达载体转入劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)，所述劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)中的tsrh基因被敲除或失活，从而获得本发明第八方面所述的产生盐屋霉素及其类似物的工程菌株。在另一优选例中，所述劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)为劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)sl2051。在另一优选例中，所述表达载体为通过定点突变，从而获得的用于表达突变tsrh基因的载体。在另一优选例中，所述步骤(i)还包括验证tsrh基因是否发生点突变的步骤。在另一优选例中，所述定点突变是用pcr扩增的方法获得的。在另一优选例中，所述表达载体为穿梭质粒，较佳地为大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒。在另一优选例中，所述表达载体还含有抗生素抗性基因，较佳地为阿伯拉霉素抗性基因。在另一优选例中，步骤(ii)所述的转入方法包括链霉菌dna导入法，较佳的为接合转移导入法。在另一优选例中，步骤(ii)所述的工程菌株为链霉菌属(streptomyces)，较佳地为劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)sl-11v-a2s。本发明第十方面提供了一种如本发明第八方面所述的工程菌株的用途，用于产生盐屋霉素及其类似物。本发明第十一方面提供了一种盐屋霉素及其类似物的制备方法，包括步骤：(a)在适合培养的条件下，培养本发明第八方面所述的工程菌株，从而产生所述盐屋霉素及其类似物；和(b)从发酵产物中分离出所述的盐屋霉素及其类似物。在另一优选例中，所述方法包括步骤：用本发明第八方面所述的工程菌株转化含tsb的发酵原料，得到所述盐屋霉素及其类似物。在另一优选例中，所述方法包括：用本发明第八方面所述的工程菌株的发酵液转化含tsb的发酵原料，得到所述盐屋霉素及其类似物。在另一优选例中，所述方法包括：在含tsb的发酵原料存在下，培养如本发明第八方面所述的工程菌株。在另一优选例中，所述发酵原料中，tsb的浓度为0.4-10％，较佳地，0.6-8％，更佳地，0.8-5％。在另一优选例中，所述盐屋霉素及其类似物的产量为0.5-10g/l，较佳地，0.8-8g/l，更佳地，0.9-5g/l。在另一优选例中，所述的发酵液是含菌体的发酵液。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了盐屋霉素及2-丝氨酸-盐屋霉素的化学结构。图2显示了不同菌株发酵产物hplc分析结果；i为出发菌株发酵产物hplc分析结果；ii为tsrh失活的突变株sl2051发酵产物hplc分析结果，不再产生硫链丝菌素组分；iii显示，在sl2051中异源回补突变tsrh得到的突变株sl-i1v-a2s发酵产物hplc分析结果，产生盐屋霉素组分及2-丝氨酸-盐屋霉素组分。图3为盐屋霉素的1hnmr(500mhz,cdcl3:cd3od＝4:1)。图4为盐屋霉素的13cnmr(125mhz,cdcl3:cd3od＝4:1)。图5为盐屋霉素的ghmbc(500mhz,cdcl3：cd3od＝4:1)。图6为盐屋霉素的gcosy(500mhz,cdcl3：cd3od＝4:1)。图7为盐屋霉素的ghsqc(500mhz,cdcl3：cd3od＝4:1)。图8为2-丝氨酸-盐屋霉素的1hnmr(500mhz,cdcl3:cd3od＝4:1)。图9为2-丝氨酸-盐屋霉素的13cnmr(125mhz,cdcl3:cd3od＝4:1)。图10为2-丝氨酸-盐屋霉素的ghmbc(500mhz,cdcl3：cd3od＝4:1)。图11为2-丝氨酸-盐屋霉素的gcosy(500mhz,cdcl3：cd3od＝4:1)。图12为2-丝氨酸-盐屋霉素的ghsqc(500mhz,cdcl3：cd3od＝4:1)。图13为感染了m.marinum的巨噬细胞raw264.7的实验结果。a显示了给药后m.marinum的存活率。b显示了给药后用westernblot检测raw264.7全细胞破碎液中lc3-i向lc3-ii的转化。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，意外的发现，对野生型的硫链丝菌素产生菌中的tsrh基因进行失活或敲除，结果发现发酵液不再产生硫链丝菌素，在此基础上回补突变tsrh基因，从突变菌株发酵3天的发酵产物中分离出盐屋霉素以及新型的盐屋霉素类似物(如2-丝氨酸-盐屋霉素)，其中，盐屋霉素的产量高达1.3g/l。在此基础上完成了本发明。基团定义如本文所用，术语“c1-c6烷基”指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、或类似基团。如本文所用，术语“c2-c6链烯基”指具有2-6个碳原子的直链或支链的烯基，例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、或类似基团。如本文所用，术语“c2-c6链炔基”指具有2-6个碳原子的直链或支链的炔基，例如乙炔基、丙炔基、或类似基团。如本文所用，术语“c1-c6烷氧基”指具有(c1-c6烷基)-o-结构的基团，例如，ch3-o-、c2h5-o-、c3h8-o-、或类似基团。如本文所用，术语“c3-c6环烷基”指具有3-6个碳原子的环状烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、或类似基团。如本文所用，术语“c1-c4烷基”指具有1-4个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、或类似基团。如本文所用，术语“c1-c3烷基”指具有1-3个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、或类似基团。如本文所用，术语“c2-c4链烯基”指具有2-4个碳原子的直链或支链的烯基，例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、或类似基团。如本文所用，术语“c2-c4链炔基”指具有2-4个碳原子的直链或支链的炔基，例如乙炔基、丙炔基、或类似基团。如本文所用，术语“c1-c4烷氧基”指具有(c1-c4烷基)-o-结构的基团，例如，ch3-o-、c2h5-o-、c3h8-o-、或类似基团。如本文所用，术语“c3-c4环烷基”指具有3-4个碳原子的环状烷基，例如环丙基、环丁基、或类似基团。如本文所用，术语“c1-c2亚烷基”指具有1-2个碳原子的二价烃基，例如，亚甲基、亚乙基、或类似基团。术语如本文所用，术语“tsb”是指trypticsoybroth(胰蛋白酶大豆肉汤)。活性成分如本文所用，术语“本发明的活性成分”、“本发明化合物”和“本发明的盐屋霉素类似物”可以互换使用，都指如式i所示的盐屋霉素类似物；式中，r1、r2的定义如本发明第一方面所述。应理解，所述术语还包括及本发明化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。一类优选的盐屋霉素类似物具有下式ia所示的结构式：在一优选实施方式中，所述“活性成分”还包括如式ii所示的盐屋霉素；如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。可以由阳离子与本发明化合物上的带电荷基团(例如氨基)形成盐。合适的阳离子包括氢离子、钠离子、钾离子、镁离子、钙离子和铵离子。适合形成盐的碱包括但并不限于：碱金属和碱土金属的氢氧化物(如naoh、koh)、碱金属和碱土金属的氧化物、碱金属和碱土金属的碳酸盐(如na2co3)、氨水等。本发明人不仅通过对盐屋霉素以及新型的盐屋霉素类似物的大量发酵以及分离纯化，确证了化合物的结构。此外，通过抗菌活性实验证实了，本发明的盐屋霉素及其类似物的抗菌活性有显著提高；通过水溶性实验证实了，本发明的盐屋霉素及其类似物的水溶性有显著提高。本发明化合物除了抗菌的活性成分用于制备药物以及作为饲料添加剂用于制备饲料组合物之外，本发明化合物还可用作制备其他盐屋霉素类似物的中间体，可用于进一步化学衍生产生其他盐屋霉素的类似物。出发菌株如本文所用，术语“本发明出发菌株”或“本发明出发微生物”指编号为atcc31255的劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)。本发明的出发菌株来自于美国模式培养物集存库(americantypeculturecollection，atcc)，编号为atcc31255。用于本发明的出发菌株不仅包括劳伦链霉菌streptomyceslaurentiiatcc31255，还包括其衍生菌株及其他生产硫链丝菌素的菌株。工程菌株及其制备本发明还提供了可用于生产本发明盐屋霉素及其类似物的工程菌株。如本文所用，术语“工程菌株”指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。特别地，在本发明中，“本发明的工程菌株”指本发明提供的产生盐屋霉素及其类似物的工程菌株。本发明提供了一种产生盐屋霉素及其类似物的工程菌株，所述菌株为劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)，其中，所述菌株中的tsrh基因(硫链丝菌素前体肽基因)被失活或敲除，并且携带产生盐屋霉素及其类似物的表达载体。在本发明的一个优选例中，所述工程菌株是保藏号为cgmcc12736的劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)sl-11v-a2s。本发明的工程菌株的制法没有特别限制，可用常规方法制备，例如，可参照文章[chem.sci.,2014,5,240]中的制法进行制备。在一优选实施方式中，所述的工程菌株可以通过包括以下步骤的方法进行制备：(i)提供一表达载体，所述表达载体携带盐屋霉素及其类似物的表达盒；(ii)将所述表达载体转入劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)，所述劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)中的tsrh基因被敲除或失活，从而获得所述的产生盐屋霉素及其类似物的工程菌株。在本发明的一个优选例中，所述劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)是劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)sl2051。在一优选实施方式中，所述的步骤(i)中所述的表达载体可以用常规方法制备，例如，所述表达载体的制备方法可参见文章[chem.sci.,2014,5,240]中的制备方法。在一优选实施方式中，所述步骤(ii)中的tsrh基因被敲除或失活的劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)可用常规方法构建，例如，所述tsrh基因被敲除或失活的劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)的构建方法可参见文章(insightintobicyclicthiopeptidebiosynthesisbenefitedfromdevelopmentofauniformapproachformolecularengineeringandproductionimprovement)中的构建方法。本发明的所述工程菌株可获得盐屋霉素和新型的盐屋霉素类似物(如2-丝氨酸-盐屋霉素)，其中盐屋霉素的产量高达1.3g/l。工程载体本发明还提供了可用于制备本发明菌株的工程载体。在本发明的一个优选例中，提供了一种生产本发明菌株的载体psl2050，其中，所述的载体依次含有tsrh基因上游530bp片段、完整的tsrh基因片段和tsrh基因下游288bp片段。该工程载体的制备方法可用常规方法进行制备，比如，可以参见文章[chem.sci.,2014,5,240]中的制法进行制备。构建重组质粒根据本文所述的基因簇及其外部两端的核苷酸序列，本领域技术人员可方便地用各种已知方法制得本发明的同源重组序列。这些方法例如但不限于：pcr，dna人工合成等，具体的方法可参见j.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性dna序列的某些部分能够调节或控制同一线性dna序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。本发明还提供了一种穿梭质粒载体。在本发明的一个优选例中，穿梭质粒载体可以为用作表达的pset152质粒。根据已知载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的序列插入合适的限制性位点，制得本发明的重组载体。转化将含有所述编码序列的载体导入宿主细胞，可采用本领域的多种已知技术，包括但不限于：磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，复制本发明的基因序列。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。本发明还提供了一种宿主细胞，其中含有本发明的编码序列。所述的宿主细胞优选的是原核细胞，一个适用于本发明的宿主细胞为宿主甲基化修饰缺失的大肠杆菌e.coliet12567。同源重组同源重组(homologusrecombination)是指发生在姐妹染色单体(non-sisterchromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的dna分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的reca、recbcd、recf、reco、recr等；以及真核生物细胞内的rad51、mre11-rad50等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday结构(holidayjuncturestructure)。同源重组反应严格依赖dna分子之间的同源性。同源重组可以用于基因敲除。基因敲除的技术路线如下：(1)构建重组基因载体；(2)将重组dna转入受体细胞核内；(3)用选择培养基筛选已发生重组的细胞。在哺乳动物中，还包括步骤(4)：将已发生重组的细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，还可以对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。发酵生产盐屋霉素及其类似物本发明的菌株可用于通过生物法制备盐屋霉素及其类似物(或其盐)。其中，所述的盐包括(但并不限于)：盐酸盐，硫酸盐，磷酸盐、醋酸盐，柠檬酸盐、其他有机羧酸盐等。本发明的发酵生产盐屋霉素及其类似物的生产方法，除了生产菌不同之外，其他条件与现有技术中发酵生产硫链丝菌素的方法基本相同，例如对盐屋霉素及其类似物(如2-丝氨酸-盐屋霉素)的纯化工艺。本发明菌株的发酵条件与一般的链霉菌相近，即在含碳源、氮源和微量元素的培养基中，在ph5.0-9.0(较佳地ph7.0-7.5)和20-45℃(较佳地25-40℃)发酵。在本发明中，“菌丝体”、“发酵液”或“培养液”可通过在适合生长的条件下培养本发明菌株，使其生长至一定的菌丝体浓度来获得。用于培养本发明菌株的培养基中的营养源没有特别的限制。本领域技术人员可以根据公知的技术来选择合适的碳源、氮源和其他营养源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、肌醇、甘露醇等。氮源可以是胨、大豆粉、黄豆饼粉、肉膏、蛋白粉、麦皮、米糖、酵母粉、玉米浆、铵盐以及其他有机物或无机含氮化合物。另外，培养基中还可适当加入一些无机盐类，如硫酸钙、磷酸盐(如磷酸二氢钾和磷酸氢二钾等)、硫酸锰、硫酸铵、硫酸镁、碳酸钙等金属盐。通常可采用各种已知的常规培养基，如lb琼脂培养基、营养琼脂培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基和牛肉浸汁琼脂培养基等对本菌株进行斜面固体培养并4℃环境下进行初步保藏。在一个具体实施方案中，用于培养本发明菌株的培养基具有以下组成(％表示质量/体积)：酵母提取物0.4％，麦芽提取物1.0％，葡萄糖0.4％，琼脂2.0％。然而，本领域技术人员应当理解，本发明并不局限于本文中列举的这些具体培养基配方。培养本发明中的菌株的温度、ph、气液比、罐压、转速等条件没有特别严格的限制，只要该条件适合该菌的生长即可。在一些较佳的实施方案中，ph宜控制在6.5～8.0之间，培养温度宜在25～40℃之间。应理解，本发明的发酵可以是连续发酵，也可以是间歇式发酵。在本发明的一个较佳的实施方案中，通过以下方法培养得到发酵液和菌丝体：isp-2固体培养基(酵母提取物0.4％，麦芽提取物1.0％，葡萄糖0.4％，琼脂2.0％)上30℃培养5天。切下约1cm2的含孢子和菌丝的琼脂块接入一级发酵培养基(tsb1.5％，可溶性淀粉1.5％，蔗糖5％)，28℃、200rpm培养48小时。按10％体积的接种量将种子培养液接入发酵培养基(tsb1.5％，酵母提取物1.1％，葡萄糖5％，caso41.5％)，28℃、200rpm，培养3天。药物组合物和施用方法本发明化合物中的具有优良的抑菌(抗菌)活性，因此可用作抗菌素(或抗生素)。例如，本发明的盐屋霉素具优异的抑菌(抗菌)活性，盐屋霉素类似物具有优异的体内抗感染活性，以及良好的水溶性，并且给药盐屋霉素类似物后，m.marinum的存活率达到约90％，且其性质有助于制成注射剂。本发明化合物可施用于哺乳动物(如人)，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部等方式给药。所述化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。需要指出，本发明的化合物可以混合给药。用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂和香料。除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。本发明化合物可以单独给药，或者与其他活性成分(如抗生素)联合给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的个体而言，日给药剂量通常为1～1000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、个体健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。饲料添加剂和饲料组合物本发明还提供了本发明化合物在饲料领域中的应用。本发明化合物因为具有优良的抗菌和抑菌性，非常适合作为饲料添加剂。本发明还提供了一种制备饲料组合物的方法，包括步骤：将本发明化合物或其药学上可接受的盐作为饲料添加剂和饲料原料进行混合，从而形成含有盐屋霉素及其类似物(或其盐)的饲料组合物。本发明的主要优点包括：(1)用本发明方法进行遗传改造的菌株的性能重现性好，经改造的盐屋霉素及其类似物(如2-丝氨酸-盐屋霉素)产生菌遗传稳定，不易突变，从发酵产物中除了分离出盐屋霉素，还分离出水溶性显著提高的盐屋霉素类似物(如2-丝氨酸-盐屋霉素)。(2)本发明相比于产盐屋霉素的野生菌株，发酵时间缩短，发酵产量提高，培养基成分简单。极大地简化了盐屋霉素的生产工艺，提高了生产效率，显著降低了生产成本。(3)以本发明的盐屋霉素及其类似物(如2-丝氨酸-盐屋霉素)为基础，有助于制备其他类型的盐屋霉素衍生物。(4)本发明通过基因工程构建，可获得能够产生很高产量(高达1.3g/l)的盐屋霉素及其类似物的劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)sl-11v-a2s。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。如无特别说明，实施例中所用到的材料均为市售产品。载体psl2050的制备方法可用常规方法进行制备，比如，可以参见文章[chem.sci.,2014,5,240]中的制法进行制备。实施例中的工程菌株sl2051的构建方法可参见文章(insightintobicyclicthiopeptidebiosynthesisbenefitedfromdevelopmentofauniformapproachformolecularengineeringandproductionimprovement)中的构建方法。野生型tsrh的蛋白序列如seqidno.:1所示：metserasnalaalaleugluileglyvalgluglyleuthrglyleuaspvalaspthrleugluileserasptyrmetaspgluthrleuleuaspglygluaspleuthrvalthrmetilealaseralasercysthrthrcysilecysthrcyssercysserser(seqidno.:1)。野生型tsrh的基因序列(seqidno.:5)。atgagcaatgccgccctggagatcggtgtcgagggactcacgggtctggacgtcgacaccctggagatcagcgactacatggacgagacgctgctcgacggtgaggacctgaccgtcacgatgatcgcgtccgcctcctgcaccacctgcatctgcacctgcagctgcagctcc实施例1突变tsrh异源回补菌株的构建1.构建突变tsrh异源回补的质粒pcr克隆工程质粒psl2050的引物序列如下：引物1：5’-ctgaccgtcacgatggtctcgtccgcctcctgcaccac-3’(下划线为突变位点)(seqidno：3)引物2：5’-gtggtgcaggaggcggacgagaccatcgtgacggtcag-3’(下划线为突变位点)(seqidno：4)以工程质粒psl2050为模板，用上述一对特异性引物进行pcr扩增。将pcr体系进行dpnⅰ酶切后，将酶切体系转化常规的大肠杆菌e.colidh5α，挑取单克隆菌落于lb培养液(含有阿伯拉霉素抗生素100μg/ml)中培养过夜，至菌液较浓。提取重组质粒，测序结果证明，重组穿梭质粒构建正确。2.突变tsrh异源回补菌株sl2051的构建和筛选将验证正确的质粒psl-i1v-a2s转化入常规的甲基化修饰缺失的大肠杆菌e.coliet12567(参见us7,326,782和us7,105,491)，通过接合转移的方法，将质粒psl-i1v-a2s导入工程菌株sl2051中，选出具有阿伯拉霉素抗性的接合子，将接合子置于30℃生长，即获得突变tsrh异源回补的基因工程菌株，命名为劳伦链霉菌突变菌株(streptomyceslaurentii)sl-i1v-a2s。突变tsrh的蛋白序列如seqidno.:2所示：metserasnalaalaleugluileglyvalgluglyleuthrglyleuaspvalaspthrleugluileserasptyrmetaspgluthrleuleuaspglygluaspleuthrvalthrmetseralasercysthrthrcysilecysthrcyssercysserser(seqidno.2)。(加粗的位置为突变处)突变tsrh的基因序列(seqidno.:6):atgagcaatgccgccctggagatcggtgtcgagggactcacgggtctggacgtcgacaccctggagatcagcgactacatggacgagacgctgctcgacggtgaggacctgaccgtcacgatgtccgcctcctgcaccacctgcatctgcacctgcagctgcagctcc(加粗的位置为突变处)实施例2重组菌株sl-i1v-a2s的发酵、检测、分离纯化和结构鉴定1.种子活化及培养将-80℃保存的重组菌株sl-i1v-a2s的孢子涂布在isp-2固体培养基(酵母提取物0.4％，麦芽提取物1.0％，葡萄糖0.4％，琼脂2.0％)上，30℃培养5天。切下约1cm2的含孢子和菌丝的琼脂块接入一级发酵培养基(tsb1.5％，可溶性淀粉1.5％，蔗糖5％)，28℃、200rpm培养48小时，获得用于下一步实验的种子培养液。2.扩大培养按10％体积的接种量将种子培养液接入发酵培养基(tsb1.5％，酵母提取物1.1％，葡萄糖5％，caso41.5％)，28℃、200rpm，培养3天。收获发酵液，得到含有盐屋霉素和2-丝氨酸-盐屋霉素的粗产物。低温保存，用于产量检测。3.发酵产物检测及制备检测产物准备：发酵液离心。上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次。菌体用丙酮浸泡，过滤除去不溶物。和并有机相经减压浓缩抽干，获得的膏状物先用100-200目硅胶预装的正相柱进行粗分，梯度洗脱条件见表1。表1hplc和lc-ms分析检测条件：仪器：agilent1100hplc系统；柱子：agilentzorbaxsb-c18柱(4.6x250mm)；检测波长：uv＝254nm；流速：1ml/min；流动相：a＝h2o(1‰hcooh)；b＝ch3cn(1‰hcooh)；洗脱条件见表2表2时间(min)0203037404750b％515405585855盐屋霉素出现在ch3oh：ch2cl2＝3/50的洗脱部分中，将洗脱液减压抽干，溶于10ml甲醇，然后进行hplc制备。盐屋霉素类似物(如2-丝氨酸-盐屋霉素)出现在ch3oh：ch2cl2＝9/100的洗脱部分中，将洗脱液减压抽干，溶于10ml甲醇，然后进行hplc制备。hplc的制备条件为：仪器：agilent1100hplc系统柱子：agilentzorbaxsb-c18column(9.4x250mm,pn880975-202)检测波长：uv＝254nm流动相：a＝h2o；b＝ch3cn流速：3ml/min。流动相梯度配比为见表3。表3时间(min)a％b％04060204060按上述的hplc的洗脱条件，分别收集盐屋霉素和2-丝氨酸-盐屋霉素的流出液，最终得到目标产物。对目标产物进行鉴定，结果如下：盐屋霉素：1hnmr(500mhz,cdcl3:cd3od＝4:1):δ9.84(bs,1h),8.85(d,j＝8.80,1h),8.68(bs,1h),8.37(bs,1h),8.31(s,1h),8.30(s,1h),8.20(s,1h),7.63(d,j＝9.70,1h),7.60(s,1h),7.32(s,1h),7.16(d,j＝7.65,1h),7.12(d,1h),6.90(d,j＝10.00,1h),6.72(s,1h),6.54(bs,1h),6.40(m,1h),6.40(dd,j＝5.30,9.65,1h),6.35(m,1h),6.25(q,j＝6.85,1h),5.79(s,1h),5.79(m,1h),5.78(s,1h),5.70(bs,1h),5.63(s,1h),5.40(s,1h),5.35(s,1h),5.33(m,1h),5.16(m,1h),5.01(dd,j＝8.75,13.25,1h),4.76(m,1h),4.47(s,1h),4.44(m,1h),4.11(m,1h),3.83(m,1h),3.68(m,1h),3.62(d,j＝4.70,1h),3.50(m,1h),3.20(m,1h),2.98(d,j＝5.00,1h),2.97(m,1h),2.38(m,1h),2.32(m,1h),1.76(d,j＝6.50,3h),1.64(d,j＝7.05,3h),1.60(m,1h),1.44(d,3h),1.39(d,j＝6.55,3h),1.32(d,j＝6.30,3h),1.19(s,3h),1.08(d,j＝6.80,3h),0.86(d,j＝6.05,3h),0.76(d,j＝6.85,3h)；(图3)盐屋霉素：13cnmr(125mhz,cdcl3:cd3od＝4:1):δ173.83,173.11,171.87,170.22,170.17,169.7,168.36,166.4,166.0,165.3,162.87,162.0,162.02,161.81,161.59,161.27,160.60,159.60,157.24,154.4,153.4,150.1,149.8,146.08,143.63,135.03,134.3,133.3,132.9,132.1,130.2,128.2,127.6,127.0,125.5,125.1,123.2,122.3,118.5,104.4,103.3,102.7,100.8,78.9,77.1,72.0,67.9,67.4,67.4,66.2,64.5,64.2,59.3,57.7,55.8,55.5,52.8,51.8,35.0,31.5,29.2,24.1,22.7,19.6,18.8,18.6,18.5,18.2,16.8,15.8,15.2；(图4)hrms(m/z)[m+h]+测量值为1648.4626(c71h82n19o18s5计算值为1648.4683)。2-丝氨酸-盐屋霉素：1hnmr(500mhz,cdcl3:cd3od＝4:1):δ10.01(bs,1h),9.84(bs,1h),9.13(bs,1h),8.85(d,j＝8.80,1h),8.68(bs,1h),8.37(bs,1h),8.31(s,1h),8.30(s,1h),8.20(s,1h),7.63(d,j＝9.70,1h),7.60(s,1h),7.32(s,1h),7.16(d,j＝7.65,1h),7.12(d,j＝,1h),6.90(d,j＝10.00,1h),6.72(s,1h),6.54(bs,1h),6.40(dd,j＝5.30,9.65,1h),6.35(m,1h),6.25(q,j＝6.85,1h),5.86(s,1h),5.79(m,1h),5.78(s,1h),5.70(bs,1h),5.63(s,1h),5.35(s,1h),5.34(s,1h),5.33(m,1h),5.01(dd,j＝8.75,13.25,1h),4.76(m,1h),4.47(s,1h),4.44(m,1h),4.11(m,1h),3.83(m,1h),3.80(m,1h),3.77(m,1h),3.68(m,1h),3.62(d,j＝4.70,1h),3.50(m,1h),3.25(m,1h),3.20(m,1h),2.97(m,1h),2.91(d,j＝5.00,1h),2.32(m,1h),2.08(m,1h),1.76(d,j＝6.50,3h),1.64(d,j＝7.05,3h),1.60(m,1h),1.44(d,3h),1.39(d,j＝6.55,3h),1.32(d,j＝6.30,3h),1.19(s,3h),1.03(d,j＝6.80,3h),0.88(d,j＝6.85,3h),0.86(d,j＝6.05,3h)(图8)2-丝氨酸-盐屋霉素：13cnmr(125mhz,cdcl3:cd3od＝4:1):δ174.9,173.1,171.9,170.2,170.2,169.9,168.4,166.5,166.4,166.1,165.3,162.9,162.1,162.0,161.8,161.6,160.7,159.6,157.2,154.4,153.5,150.1,149.9,146.1,143.6,134.3,133.0,132.9,132.1,129.9,128.2,127.8,127.1,125.5,125.1,123.2,122.3,118.5,104.4,103.3,102.6,78.9,77.1,72.0,67.9,67.4,67.4,66.2,64.5,64.2,61.3,59.3,57.7,55.8,55.5,55.4,52.8,51.8,35.0,31.3,29.2,24.1,22.8,18.8,18.6,18.6,18.5,18.2,17.2,15.8,15.2(图9)hrms(m/z)[m+h]+测量值为1666.4771(c71h84n19o19s5计算值为1666.4789)。图5、图6、图7分别为盐屋霉素的ghmbc、gcosy和ghsqc图谱，图10、图11、图12分别为2-丝氨酸-盐屋霉素的ghmbc、gcosy和ghsqc图谱。上述结果表明，发明人成功利用劳伦链霉菌(streptomyceslaurentii)制备了盐屋霉素和2-丝氨酸-盐屋霉素。实施例3盐屋霉素及其类似物(如2-丝氨酸-盐屋霉素)的抗胞外菌活性对盐屋霉素、2-丝氨酸-盐屋霉素和硫链丝菌素进行抗外菌活性的测定，方法如下：在96孔板中，将溶于二甲亚砜的盐屋霉素、2-丝氨酸-盐屋霉素和硫链丝菌素分别加入培养基至1μg/ml并逐级稀释至0.0005μg/ml。将测试菌加入培养基至107-108cfu/ml(根据0.5mcfarland标准)并培养过夜。测试菌不能生长所对应的最小浓度为mic。最小抑制浓度(mic)测试结果显示，盐屋霉素和2-丝氨酸-盐屋霉素(oh-sio)均具有抗菌活性，其中，盐屋霉素和硫链丝菌素的抗菌活性相当或更优(表4)。表4单位:μg/ml；a胞外菌，b胞内菌从表4中可以看出，本发明的盐屋霉素，在抑制某些枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和临床分离得到的多重耐药菌(prsp、mrsa、vre等)方面，显著优于硫链丝菌素。实施例4盐屋霉素及其类似物(如2-丝氨酸-盐屋霉素)的抗胞内菌活性对盐屋霉素、2-丝氨酸-盐屋霉素和硫链丝菌素进行抗内菌活性的测定，方法如下：在96孔板中，将溶于二甲亚砜的盐屋霉素、2-丝氨酸-盐屋霉素和硫链丝菌素分别加入培养基至8μg/ml并逐级稀释至0.004μg/ml。将测试菌加入培养基至107-108cfu/ml(根据0.5mcfarland标准)并培养过夜。测试菌不能生长所对应的最小浓度为mic。最小抑制浓度(mic)测试结果如表5所示。结果表明，盐屋霉素和硫链丝菌素的抗菌活性相当。表5单位:μg/ml；b胞内菌对盐屋霉素、2-丝氨酸-盐屋霉素和硫链丝菌素进行细胞水平(感染了m.marinum的巨噬细胞raw264.7)的抗感染活性测试。测试结果(图13a)表明：sio(m.marinum的存活率为50％)的体内抗感染能力与tsr(m.marinum的存活率为55％)相当，而给药2-丝氨酸-盐屋霉素(oh-sio)后m.marinum的存活率达到约90％。对感染了m.marinum的巨噬细胞raw264.7进行自噬相关研究(图13b)。oh-sio诱发raw264.7自噬的能力与tsr和sio相当。对比oh-sio的体外抗菌活性和细胞水平的体内抗菌活性可以看出，oh-sio的体外抗菌能力较低，而在体内却具有杀死高于10％m.marinum的活性。因此，我们认为oh-sio体内的抗菌活性主要依赖于诱发宿主细胞的自噬，而不依赖于其对m.marinum的直接抗菌活性。通过体外抗菌测试结果和体内抗感染结果，发明人发现oh-sio体内的抗菌活性主要依赖于诱发宿主细胞的自噬。实施例5盐屋霉素及其类似物(如2-丝氨酸-盐屋霉素)的水溶性测试结果盐屋霉素及2-丝氨酸-盐屋霉素水溶性测试结果见表6。表6单位:μg/ml。从表6中数据可以看出，2-丝氨酸-盐屋霉素(oh-sio)的水溶性比硫链丝菌素提高了1倍以上。水溶性的提高能够提高化合物的生物利用度，便于给药。实施例6药物组合物在本实施例中，将上述实施例中制备的盐屋霉素类似物(如2-丝氨酸-盐屋霉素)作为活性化合物，按下表配方配制成药物组合物。成分重量活性化合物(盐屋霉素类似物)20g淀粉140g微晶纤维素60g按常规方法，将上述物质混合均匀后，装入普通明胶胶囊，得到1000颗胶囊。菌种保藏劳伦链霉菌突变菌株(streptomyceslaurentii)sl-i1v-a2s，于2016年7月5日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc，中国，北京)，保藏号为cgmcc12736。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页12