属于天然产物分离技术领域，涉及一种从昆明山海棠中提取雷公藤甲素和雷公藤红素的方法。
背景技术：
昆明山海棠是卫矛科雷公藤属落叶披散或蔓状灌木植物，生长于向阳山坡、路边或灌木丛中，分布于长江以南部分省区及西南地区，通常以根和皮作为药用。是一种民间传统中药，用于杀虫、舒筋活络、清热解毒、祛风除湿等。临床上主要作为免疫抑制剂，用于治疗类风湿性关节炎、慢性肾炎、纤维组织炎、脉管炎、麻风反应、白血病和红斑狼疮等多种胶元性疾病及自身免疫性疾病，且效果良好。
萜类及生物碱类物质为昆明山海棠主要活性成分。雷公藤甲素又称雷公藤内酯、雷公藤内酯醇，属于二萜内酯，纯品为白色固状物，分子式c20h24o6，分子量360.4，熔点226-227℃，雷公藤甲素不仅有抗类风湿作用，还有抗癌作用。雷公藤红素是雷公藤的三萜类成分，根据文献报道，雷公藤红素的抑瘤率为65％～93％，已经超过了紫杉醇。雷公藤红素纯品为红色粉末，分子式c29h38o4，分子量450.61，熔点为185～200℃，具有很强的抗氧化作用，有抗癌，新生血管生成作用，有抗类风湿，杀精子作用等，是目前值得关注的天然活性产物，目前在抗癌、肿瘤、脑神经方面有突出的功效研究。
公开号为cn104398526a的中国专利公开了雷公藤甲素和雷公藤红素联合用药在制备抗肿瘤药物中的应用。表明雷公藤甲素和雷公藤红素联合用药，在本发明的用量比例范围内，两者具有明显的协同作用，有效提高疗效，相对于单一组分或两组分简单疗效叠加更显著，提高了对肿瘤细胞的杀伤性；有效降低彼此的用药量，从而减少毒副作用；两者联合使用也可节约成本，减轻病人的经济负担了，为肿瘤的防治提供了一条新途径，在医药学领域的应用前景广阔。
公开号为cn101434638的中国专利公开了一种从雷公藤中提取雷公藤甲素的方法，具体步骤如下：雷公藤干燥的根茎用含氯的烷烃进行加压提取。将雷公藤干燥的根茎与烷烃按一定料液比混合放入加压反应釜中提取，将提取所得的混合物固液分离，得提取液，将提取液合并后减压浓缩，得到雷公藤甲素粗产品。
公开号为cn1915280的中国专利介绍了一种超临界co2提取雷公藤有效成分萜类化合物的方法及组成的方法，它是将粉碎的雷公藤按质量比2∶1-1.5浸于乙醇夹带剂中，在萃取釜以超临界co2为溶剂进行萃取，其操作条件为：温度为30～50℃，压力为20-40mpa，co2流速为10-30kg/h，进行萃取60～150min，雷公藤甲素的纯度为0.05-0.15％。
公开号为cn101367862的中国专利介绍了一种从雷公藤中分离纯化雷公藤甲素单体的工艺方法，它按如下工艺步骤进行：a.加热提取：乙醇或甲醇温浸后除渣；b.溶剂萃取：采用有机溶剂萃取提取浓缩液以富集产品；c.色谱柱层析：用中性氧化铝或者硅胶作为填料，二氯甲烷－甲醇或者氯仿－甲醇梯度洗脱，分段收集馏分；d.高效制备液相分离；e.结晶：采用两相溶剂结晶法，将分段收集的馏分用石油醚－乙酸乙酯、二氯甲烷－甲醇或者二氯甲烷－乙酸乙酯结晶，得到纯度99.5％以上的雷公藤甲素无色针状结晶产品。
公开号为cn104710501a的中国专利介绍了一种从雷公藤提取物中快速制备雷公藤红素化学对照品的方法，过程如下：雷公藤药材经乙醇提取，乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、高效制备色谱分离和凝胶纯化，可获得纯度大于98％的雷公藤红素化学对照品。
公开号为cn103880912a的中国专利介绍了一种从植物中提取雷公藤红素的方法，步骤如下：首先以酶进行酶解后超声提取，提取液浓缩后得到浸膏状初提物，然后初提物用水悬浮后以乙酸乙酯萃取，萃取剂浓缩得到稠膏状提取物；所述纯化是粗提物用硅藻土或硅胶拌样后以硅胶柱色谱分离纯化，收集洗脱液，浓缩干燥后得到粉末状粗晶体，最后用甲醇-水或乙醇-水混合溶剂重结晶。本法分离、纯化工艺简单，得到纯度达98％的雷公藤红素，提取收率高于90％。
目前从雷公藤中提取雷公藤甲素或雷公藤红素的方法较多，昆明山海棠与雷公藤均属于卫矛科、雷公藤属植物，化学成分具有一定的相似性。雷公藤甲素含量较低，目前多采用传统柱层析方法分离出雷公藤甲素粗品，再采用高效制备液相色谱分离出纯品。高效制备液相色谱分离技术因仪器设备本身及使用、维护费用较高，效率低且费时等原因而不适于工业化生产。
目前公开的文献资料未对昆明山海棠的有效成分提取进行综合开发利用，而雷公藤甲素和雷公藤红素均具有抗肿瘤作用，是目前热点研究的天然活性产物，为肿瘤的防治提供了一条新途径，在医药学领域的应用前景广阔。因而，探索从昆明山海棠提取雷公藤甲素和雷公藤红素意义非凡。
技术实现要素：
本发明采用的技术方案包括：干燥粉碎过筛后的昆明山海棠经酶解后，过滤，滤渣用醇液超声提取，提取液浓缩，浓缩物加水溶解，用混合溶剂萃取，萃取液浓缩成浸膏，浸膏醇溶过滤、浓缩后，采用硅胶柱分离，洗脱液浓缩、结晶分别制得雷公藤甲素和雷公藤红素纯品。
因此，本发明提供一种从昆明山海棠中提取雷公藤甲素和雷公藤红素的方法，其具体步骤包括如下：
(1)粉碎干燥昆明山海棠，过60目筛，按料液比1kg︰10～15l加入去离子水，加浓盐酸调整ph在3.0-6.0范围内，加入果胶酶酶解，酶量为原料质量的1～5％，酶解温度45～50℃，酶解时间1～2h。
(2)过滤，收集滤渣，按料液比1kg︰5～15l加入95％乙醇，在20～45℃内超声波提取30min，过滤，重复提取2～3次，合并提取液，减压浓缩至无馏分蒸出；
(3)将浓缩的提取物以3～5倍体积水悬浮后，加入等体积乙酸乙酯石油醚溶液萃取3～6次，萃取液浓缩得浸膏a，回收萃取剂可反复使用，其中乙酸乙酯石油醚溶液的配制比例为1:1～9；
(4)将步骤3所得浸膏a溶于5～10倍质量的95％乙醇中，过滤除去不溶物，滤液浓缩得到浸膏b；
(5)将步骤4所得浸膏b以300-400目硅胶拌样并干燥，置于300-400目硅胶柱分离。拌样硅胶用量为浸膏b重量的1-2倍，先用3-4倍柱体积的乙酸乙酯石油醚溶液洗脱，收集洗脱液红色部分，得洗脱液ⅰ，其中乙酸乙酯石油醚溶液的配制比例为1:8～12；
(6)将再用3-4倍柱体积的乙酸乙酯石油醚溶液洗脱，得洗脱液ⅱ，其中乙酸乙酯石油醚溶液的配制比例为1:1～4；
(7)将洗脱液ⅰ进行浓缩至膏状物，再加膏状物重量的100-150倍的乙酸乙酯石油醚溶液，进行结晶，静置8-12小时，然后0.22μm陶瓷膜过滤一次，重结晶，将结晶物真空干燥得雷公藤红素，其中乙酸乙酯石油醚溶液的配制比例为5∶95；
(8)将洗脱液ⅱ减压浓缩并干燥，用95％乙醇溶解成饱和溶液，缓慢加入水进行结晶，静置8-12小时，然后0.22μm陶瓷膜过滤一次，重结晶直至结晶颜色洁白为止，将结晶物真空干燥得雷公藤甲素。
技术效果
1、采用酶解破壁法，有效提高了提取率。雷公藤甲素为二萜内酯，在ph3-6条件下较稳定，且热温度性良好。而果胶酶最适ph为3-6，最适温度为45-50℃。所以选择果胶酶进行破壁处理。
2、本发明在提取分离雷公藤甲素的同时，能获得大量的雷公藤红素，大大地降低了雷公藤甲素的生产成本，提高了昆明山海棠的附加值，有效地保护了自然资源。
具休实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1
粉碎干燥昆明山海棠，并过60目筛，称取25kg，加入300l的去离子水，加浓盐酸调整ph为5.5，加入0.5kg果胶酶，在温度50℃下酶解1.5h，过滤，收集滤渣；加95％乙醇200l在40℃内超声提取30min，过滤，重复提取3次，合并提取液，减压浓缩至无馏分蒸出；浓缩液加水25l悬浮后，加入乙酸乙酯︰石油醚(1:8)混合溶剂25l萃取3次，萃取液浓缩得16g浸膏a；将浸膏a溶于150ml95％乙醇中，过滤除去不溶物，滤液浓缩得到9g浸膏b；浸膏b以10g硅胶(300-400目)拌样并干燥，硅胶(300-400目)在105℃下活化40分钟后干法装柱，将拌好样的硅胶干法上样，先用乙酸乙酯︰石油醚(1:10)溶液1000ml洗脱，收集洗脱液红色部分，得洗脱液ⅰ；再用乙酸乙酯︰石油醚(1:3)溶液1000ml洗脱，得洗脱液ⅱ；将洗脱液ⅰ进行浓缩至2.1g膏状物，再加250ml
乙酸乙酯︰石油醚(5∶95)溶液，进行结晶，静置12小时，然后0.22μm陶瓷膜过滤一次，重结晶，将结晶物真空干燥得0.8g雷公藤红素；将洗脱液ⅱ减压浓缩并干燥，用95％乙醇溶解成饱和溶液，缓慢加入水进行结晶，静置12小时，然后0.22μm陶瓷膜过滤一次，重结晶直至结晶颜色洁白为止，将结晶物真空干燥得0.7g雷公藤甲素。雷公藤甲素hplc检测条件：色谱柱为phenomenexc18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-水(52:48)，流速为lml/min，进样量为20μl，柱温为30℃，检测波长为218nm。检测结果为雷公藤甲素的含量为98.32％。雷公藤红素hplc检测条件：色谱柱为phenomenexc18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-0.005mol/lh3po4溶液(86:14)，流速为lml/min，进样量为20μl，柱温为30℃，检测波长为425nm。检测结果为雷公藤红素的含量为97.87％。
实施例2
粉碎干燥昆明山海棠，并过60目筛，称取50kg，加入800l的去离子水，加浓盐酸调整ph为4.5，加入1kg果胶酶，在温度45℃下酶解1.5h，过滤，收集滤渣；加95％乙醇300l在40℃内超声提取30min，过滤，重复提取3次，合并提取液，减压浓缩至无馏分蒸出；浓缩液加水50l悬浮后，加入乙酸乙酯︰石油醚(1:6)混合溶剂50l萃取3次，萃取液浓缩得30g浸膏a；将浸膏a溶于200ml95％乙醇中，过滤除去不溶物，滤液浓缩得到20g浸膏b；浸膏b以30g硅胶(300-400目)拌样并干燥，硅胶(300-400目)在105℃下活化40分钟后干法装柱，将拌好样的硅胶干法上样，先用乙酸乙酯︰石油醚(1:10)溶液2500ml洗脱，收集洗脱液红色部分，得洗脱液ⅰ；再用乙酸乙酯︰石油醚(1:3)溶液2500ml洗脱，得洗脱液ⅱ；将洗脱液ⅰ进行浓缩至4g膏状物，再加500ml
乙酸乙酯︰石油醚(5∶95)溶液，进行结晶，静置12小时，然后0.22μm陶瓷膜过滤一次，重结晶，将结晶物真空干燥得1.2g雷公藤红素；将洗脱液ⅱ减压浓缩并干燥，用95％乙醇溶解成饱和溶液，缓慢加入水进行结晶，静置12小时，然后0.22μm陶瓷膜过滤一次，重结晶直至结晶颜色洁白为止，将结晶物真空干燥得1.3g雷公藤甲素。雷公藤甲素hplc检测条件：色谱柱为phenomenexc18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-水(52:48)，流速为lml/min，进样量为20μl，柱温为30℃，检测波长为218nm。检测结果为雷公藤甲素的含量为98.16％。雷公藤红素hplc检测条件：色谱柱为phenomenexc18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-0.005mol/lh3po4溶液(86:14)，流速为lml/min，进样量为20μl，柱温为30℃，检测波长为425nm。检测结果为雷公藤红素的含量为98.47％。
实施例3
粉碎干燥昆明山海棠，并过60目筛，称取100kg，加入1000l的去离子水，加浓盐酸调整ph为3.5，加入2kg果胶酶，在温度45℃下酶解1.5h，过滤，收集滤渣；加95％乙醇500l，在30℃内超声提取30min，过滤，重复提取2次，合并提取液，减压浓缩至无馏分蒸出；浓缩液加水100l悬浮后，加入乙酸乙酯︰石油醚(1:4)混合溶剂100l萃取3次，萃取液浓缩得50g浸膏a；将浸膏a溶于500ml95％乙醇中，过滤除去不溶物，滤液浓缩得到30g浸膏b；浸膏b以50g硅胶(300-400目)拌样并干燥，硅胶(300-400目)在105℃下活化40分钟后干法装柱，将拌好样的硅胶干法上样，先用乙酸乙酯︰石油醚(1:9)溶液5000ml洗脱，收集洗脱液红色部分，得洗脱液ⅰ；再用乙酸乙酯︰石油醚(1:2)溶液5000ml洗脱，得洗脱液ⅱ；将洗脱液ⅰ进行浓缩至6g膏状物，再加700ml乙酸乙酯︰石油醚(5∶95)溶液，进行结晶，静置12小时，然后0.22μm陶瓷膜过滤一次，重结晶，将结晶物真空干燥得3.0g雷公藤红素；将洗脱液ⅱ减压浓缩并干燥，用95％乙醇溶解成饱和溶液，缓慢加入水进行结晶，静置12小时，然后0.22μm陶瓷膜过滤一次，重结晶直至结晶颜色洁白为止，将结晶物真空干燥得2.8g雷公藤甲素。雷公藤甲素hplc检测条件：色谱柱为phenomenexc18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-水(52:48)，流速为lml/min，进样量为20μl，柱温为30℃，检测波长为218nm。检测结果为雷公藤甲素的含量为97.24％。雷公藤红素hplc检测条件：色谱柱为phenomenexc18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-0.005mol/lh3po4溶液(86:14)，流速为lml/min，进样量为20μl，柱温为30℃，检测波长为425nm。检测结果为雷公藤红素的含量为98.13％。