黄色蠕形霉Y28及其在防治果树腐烂病中的应用的制作方法

本发明涉及微生物学及生物防治技术领域，具体地说，涉及黄色蠕形霉Y28及其在防治果树腐烂病中的应用。

背景技术：

梨树为我国的第三大果树品种，梨产业的健康发展，不仅对我国农业生产和农民增收发挥着重要作用，而且对世界梨果生产也具有举足轻重的影响。

梨树腐烂病的病原菌为梨树腐烂病菌，属于子囊菌亚门真菌，苹果黑腐皮壳梨变种(Valsapyri)，病原的形态与苹果树腐烂病菌相似。梨树腐烂病在我国梨各主产区均有发生，以新疆、西北、华北等地发生较重。据调查，新疆库尔勒香梨病株率达50％-80％，西北地区酥梨病株率达30％-50％；华北地区鸭梨、雪花梨发病株率均达30％以上。腐烂病具有发生区域广、发病率高、难以控制等特点，发病严重的梨园，树体病疤累累、枝干残缺不全，甚至造成大量死树或毁园，严重威胁到我国梨产业的健康发展。

以往梨树腐烂病的防治主要依赖于福美胂等药剂，而福美胂现已明令禁止在果树上使用。同时，化学杀菌剂由于易使病菌产生抗药性以及消费者对于人类健康、环境污染和农产品化学药剂残留等问题的日益关注而受到限制，因此急需寻找一种新型、安全、无毒的方法或手段替代化学杀菌剂来防治梨树腐烂病。生物防治作为一种安全无毒的防腐手段引起科学家的广泛关注，在过去近三十年里，国内外研究者已经筛选出许多对病菌具有明显抑菌效果的细菌、酵母菌和小型丝状真菌，部分已获批作为生物杀菌剂应用于生产，如苏云金芽孢杆菌(Bt)、“Nexy”(C.olephila strain O)等。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有生防效果的内生真菌--黄色蠕形霉Y28。

本发明的另一目的是提供菌株Y28在防治果树腐烂病中的应用。

根据ZL201410079119.2公开的梨树品种资源抗腐烂病快速鉴定方法，利用该方法可快速、简便、高效的鉴定梨树不同品种资源对腐烂病的抗性。通过筛选发现‘圆黄’梨、‘秋白’、‘满园香’、‘绿句句’和‘路易斯’等梨品种对梨腐烂病具有高抗的特点。进一步通过对各梨树品种中的内生菌进行分离和抗腐烂病筛选，从中获得一株对梨树腐烂病具有良好防治效果的内生真菌Y28。

菌株Y28的微生物学特征见表1。

表1 菌株Y28不同结构的形状及大小

菌株Y28的理化特征如下：

1、温度对菌株Y28菌丝生长及产孢的影响

菌株Y28在3℃-35℃下均能生长，菌丝在30℃扩展最快，菌落日扩展0.4cm-0.5cm。10℃下菌丝虽能生长，但极难形成孢子；在20℃-30℃下菌落表面都可同时产生两类孢子，偶而只产生子囊孢子，35℃下菌落表面多为灰绿色分生孢子，零星产生一些黄色小点即闭囊壳。说明温度不仅影响菌丝生长，同时对有性繁殖和无性繁殖也产生影响。

2、pH值对菌株Y28菌丝生长及产孢的影响

菌株Y28菌丝在pH 2-10的基质上均能生长，最适pH值为4，在此环境下，菌落日扩展0.6cm-0.7cm。菌株Y28喜酸性环境，符合真菌的一般特性。在pH 4-7时均可形成两类孢子，pH值为2或10时，不形成任何类型的孢子。因此，菌株Y28菌丝生长及孢子产生均受到基质酸碱度的影响。

菌株Y28的ITS序列如SEQ ID NO:1所示，将其ITS序列在GenBank中进行比对，并构建菌株Y28的系统进化树(图3)。

基于以上信息，将菌株Y28鉴定为黄色蠕形霉(Talaromyces flavus)。该菌现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.11918，保藏日期2016年2月1日。

本发明还提供黄色蠕形霉Y28在防治果树腐烂病中的应用，特别是防治由腐烂病菌(Valsapyri HB1)所致梨树腐烂病中的应用。

本发明所述果树包括梨树和苹果树等，优选梨树。

前述的应用，其是将黄色蠕形霉Y28的菌丝体、菌饼、发酵液或孢子悬液接种至果树的根、茎、枝条、叶片上，进行腐烂病的生物防治。

本发明还提供黄色蠕形霉Y28在制备果树腐烂病的生防菌剂中的应用。

本发明还提供由黄色蠕形霉Y28制备的果树腐烂病的(复合)生防菌剂，其活性成分为黄色蠕形霉Y28的发酵液、菌体裂解液或孢子悬液。

本发明进一步提供黄色蠕形霉Y28的培养方法：

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯浸粉6.0g/L；葡萄糖20.0g/L；琼脂20.0g/L。

培养条件：控制pH值5.6；温度：25℃；湿度：15％-50％，避光培养。

本发明还提供黄色蠕形霉Y28的发酵方法：

将已在PDA平板上培养4天的Y28菌丝挑取适量接种于PDB培养基中振荡培养。培养条件为：转速：180r/min；温度：25℃；湿度：15％-50％，避光培养。

本发明还提供由所述黄色蠕形霉Y28制备的复合微生物菌剂。

本发明以高抗腐烂病的梨树品种为材料，从梨树叶片和枝条分离、纯化得到内生真菌，获得具有良好抗腐烂病效果的生防菌，为制备生物杀菌剂提供宝贵资源。通过具有生防效果的内生真菌的筛选和应用来替代原有的化学杀菌剂，以减少化学杀菌剂对环境和果品的不利影响，为绿色梨果生产奠定基础。

试验表明，本发明的菌株Y28在真菌离体对峙抑菌试验中抑菌率达70.50％，在一年生枝条离体复筛试验中抑菌率达55.54％，是较好的防治梨树腐烂病的生防菌株。

附图说明

图1为本发明实施例1中梨树腐烂病内生拮抗菌的初筛结果。其中，A为对照，B为菌株Y28，1-4分别表示培养1-4天的菌丝生长情况。

图2为本发明实施例1中梨树腐烂病内生拮抗菌的复筛结果。其中，A为对照，B为菌株Y28，左图表示未剥皮的接种情况，右图表示已剥皮的接种情况。

图3为根据菌株Y28的ITS测序结果构建的系统进化树。

图4为本发明实施例2中利用菌株Y28孢子悬液田间处理梨树腐烂病刮治后伤口的愈合情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1 内生真菌Y28的筛选与鉴定

1.内生真菌Y28的分离、纯化及筛选

1.1叶片与枝条(各50个样品)内生真菌的分离

将采集的样品(样品来自安徽省合肥市国家林业创新基地合肥高新技术农业园果树实习基地‘秋白’等梨品种)先用流动的自来水冲洗去除表面杂质，再在超净工作台内进行表面消毒:用无菌水冲洗表面，无菌滤纸吸去水分，将组织于15％次氯酸钠溶液中浸泡5～10s后用无菌水冲洗3次。将消毒后的组织用解剖刀切至植物组织内部，并将内部组织割成约5mm×5mm的小方块，放置在无菌的PDA上培养并编号。

1.2内生真菌的纯化

将接种后的培养基置于25℃恒温培养箱内培养3～7天，待组织周围长出菌落后，采用菌丝尖端挑取法，根据菌落形态、颜色、长出时间的先后，及时挑取材料周围菌丝转接于新鲜培养基上进行培养，反复纯化后转接于PDA斜面上，4℃保存备用。同时将表面消毒后而不做切割的材料在培养基上做组织印迹，作为对照以检查消毒效果。

1.3梨树腐烂病内生拮抗菌初筛—离体对峙实验

采用离体对峙培养法，筛选生防菌。将直径6mm活化的腐烂病菌(Valsapyri HB1)菌饼置于距PDA平板边缘25mm处，于同一水平线距平板边缘25mm处接相同直径的生防菌菌饼，每个菌株重复3次。置于25℃培养箱培养，观察并记录结果。

1.4梨树腐烂病内生拮抗菌复筛—一年生枝条离体组织复筛

选取45根长度为30cm生长势一致的一年生健康枝条，将枝条依次用用清水和纯水清洗一遍后浸泡于15％次氯酸钠溶液5～10s，再用无菌水冲洗3次后用手术刀在枝条上切长宽均约6mm的三个小孔，每孔间距约2cm。打孔处尽量避免节间。45根枝条分15组，每组3根枝条，为3次重复，在上、下2孔中分别接种直径为6mm的生防菌菌饼，中间接相同直径的腐烂病菌饼。保湿培养一周，发病后测量并记录每根枝条的病斑直径。

初筛的实验结果见表2和图1，结果表明在离体对峙抑菌率中，F2的抑菌效果最好，高达77.5％，其次是Y28，其抑菌率达到70.50％。

复筛的实验结果见表3和图2，结果表明在初筛中抑菌效果最好的F2菌株在复筛中其抑菌率仅为43.67％，而复筛抑菌效果最好的f7-2菌株(抑菌率高达74.05％)，在初筛中并没有明显的抑菌作用，且Y28菌株的复筛抑菌率达到55.54％。综上，Y28菌株较好的防治梨树腐烂病的生防菌株。

表2 有效真菌离体对峙抑菌率

表3 一年生枝条离体复筛

2.菌株Y28的鉴定

2.1ITS序列鉴定

菌株Y28的ITS序列如SEQ ID NO:1所示，将其ITS序列在GenBank中进行比对，并构建菌株Y28的系统进化树(图3)。

2.2菌株Y28的微生物学特征

表1 菌株Y28不同结构的形状及大小

2.3菌株Y28的理化特征如下：

2.3.1温度对菌株Y28菌丝生长及产孢的影响

菌株Y28在3℃-35℃下均能生长，菌丝在30℃扩展最快，菌落日扩展0.4cm-0.5cm。10℃下菌丝虽能生长，但极难形成孢子；在20℃-30℃下菌落表面都可同时产生两类孢子，偶而只产生子囊孢子，35℃下菌落表面多为灰绿色分生孢子，零星产生一些黄色小点即闭囊壳。说明温度不仅影响菌丝生长，同时对有性繁殖和无性繁殖也产生影响。

2.3.2pH值对菌株Y28菌丝生长及产孢的影响

菌株Y28菌丝在pH 2-10的基质上均能生长，最适pH值为4，在此环境下，菌落日扩展0.6cm-0.7cm。菌株Y28喜酸性环境，符合真菌的一般特性。在pH 4-7时均可形成两类孢子，pH值为2或10时，不形成任何类型的孢子。因此，菌株Y28菌丝生长及孢子产生均受到基质酸碱度的影响。

基于以上信息，将内生真菌Y28菌株鉴定为黄色蠕形霉(Talaromycesflavus)。

韦善君等在《黄色蠕形霉对棉花上几种病原菌拮抗作用的研究》中表明黄色蠕形霉对棉花大丽轮枝菌、刺盘孢菌的菌丝生长及分生孢子萌发和对棉立枯丝核菌、棉枯萎尖孢镰刀菌的菌丝生长均有明显的抑制作用(1999)，Zhao等在《Fungal colonization of Pu-erhtea in Yunnan》中也从茶样中分离到踝节菌属(2010)，罗惠波等在《浓香型大曲中可培养真菌的分离鉴定与系统发育学分析》中报道踝节菌属占浓香型大曲内真菌的2.90％(2013)，何斐等在《核桃林下魔芋根区土壤微生物区系研究》中报道林下土壤优势微生物放射型根瘤菌之一的黄色蠕形霉数量和比例较林外不同程度增加(2014)，张丹等在《中国南海海绵和珊瑚共附生真菌多样性及其抑菌活性研究》中同样分离出了踝节菌属(2015)。综上，目前没有发现关于踝节菌属黄色蠕形霉危及人类健康或动、植物病原或污染环境的报道。

实施例2 菌株Y28在防治梨树腐烂病方面的应用

收集菌株Y28的子囊孢子利用无菌水配制浓度为10⁸CFU/mL的孢子悬液，将配制好的孢子悬液涂布于已彻底刮除的腐烂病伤口处，刮除面积超过病斑0.5cm-1.0cm，然后涂抹孢子悬浮液。结果表明，涂布孢子悬液的腐烂病病疤愈合良好，病部组织得以明显修复(图4)。

可见，菌株Y28具有安全、高效防控腐烂病的特点，该菌株是潜在防治腐烂病的优良菌株。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。