一种表面带氨基、羧基和羟基多官能团的自发荧光的聚合物微球的制备的制作方法

本发明涉及一种表面带氨基、羧基和羟基官能团的自发荧光的聚合物微球及其制备方法，属于高分子材料领域。该微球表面的多官能团为后续的荧光微球与蛋白等生物分子的结合提供位点，适用于作为示踪和药物载体等生物医药领域的应用。

背景技术：

荧光微球指直径在纳米或微米级范围，负载有荧光物质，受外界能量刺激能发出荧光的固体颗粒。近年来发展起来的聚合物荧光微球由于粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高，微球表面弧度有利于抗原决定簇和抗体结合位点的暴露面处于最佳的反应状态，因此在标记、示踪、检测、标准、固定化酶、免疫医学、高通量药物筛选、基因研究以及某些高新技术领域的基础研究和应用方面引起广泛的重视。

理想的荧光微球不仅要求能产生较强的荧光、微球尺寸均匀、粒径分布窄、化学稳定性好、表面含有丰富的功能基团，且制备工艺简单，价格便宜。目前荧光微球的制备方法主要分物理法和化学法。物理法是将荧光性物质，如荧光素、量子点或稀土离子等吸附在聚合物微球表面或包覆于其中。聂微等（沈阳药科大学学报，2013,30，329）以三氯甲烷和异丙醇为溶胀剂，吖啶橙和罗丹明为荧光素，通过溶剂逐渐挥发法对聚苯乙烯微球染色，制备粒径为1-5μm的荧光微球。闫凯等（高分子学报，2013,11，1453）在种子磁性微球存在下，以对苯乙烯磺酸钠、稀土配合物等功能单体，通过无皂种子乳液聚合制备磁性荧光微球。但物理方法制备的荧光微球存在大小不一、荧光物质分布不均以及易脱落等缺点。化学法是将荧光性材料接枝到微球表面，或将含荧光生色团的单体与其它可聚合单体通过悬浮聚合、乳液聚合以及分散聚合等方法获得荧光微球。化学法制得的荧光微球各方面性能均较为稳定，能避免微球在应用过程中荧光物质的泄漏。颜晓梅等（Journal of Material Chemsity,2010,20,1179）通过分散聚合制备微米级的聚苯乙烯微球，之后再将荧光染料罗丹明6G和带有羧基官能团的物质在聚苯乙烯种子微球表面共聚，形成核壳结构的荧光微球。然而，接枝法获得的荧光微球其荧光物质是成点状分布在微球表面。目前共聚法主要采用可聚合的荧光性单体与苯乙烯共聚，或共轭高分子聚合制备荧光微球。Sherman等（Langmuir, 2005, 21(11)，5218）使用乙烯基苄基（三甲基）-氯化铵对疏水性量子点进行修饰，后与苯乙烯共聚获得复合荧光微球。范丽娟等（CN102643488B）将聚对苯乙烯撑前驱体溶液吸附在磺化的聚苯乙烯微球表面提供，在溶液中催化四氢噻吩基团消除，得到壳层材料为聚对苯乙烯撑共轭高分子荧光微球。但这类高分子荧光微球生物相容性较差，合成中用到的大量有机溶剂也不利于其在生物医药领域的应用，并且还需对微球表面进行官能化修饰的后处理步骤，以便后续的微球与蛋白等生物分子结合。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术存在的不足，提供一种可自发荧光，无毒性，表面带有大量氨基、羧基，有利于下一步生物医学应用的高分子微球及其制备方法。近年绿色荧光蛋白（GFP）作为一种无需底物、自身发光的蛋白为生物科学领域的应用带来巨大影响。组成蛋白质的氨基酸中，酪氨酸发色团羟基连接在苯环上，使得酪氨酸不仅具有较强的荧光性，还具有多种反应活性。本发明方法以生物小分子酪氨酸为原料，形成油包水的均一乳液，然后升温乳液缩聚形成初始微球，后经戊二醛固化，脱水得到颗粒尺寸为1-10微米，呈现良好单分散性、自发荧光的酪氨酸-缩甲醛微球。

本发明目的通过以下技术方案实现：本发明所述的表面带氨基、羧基和羟基多官能团的自发荧光的聚合物微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）酪氨酸水相溶液的配制：将一定比例的酪氨酸和草酸溶解在盐酸溶液中，配制得到浓度为4-30wt%的酪氨酸溶液；然后加入适量乳化剂，混合乳化均匀即成水相，所述乳化剂为Tween20，用量为浓度为4-30wt%的酪氨酸溶液重量的0.3-2wt%；

（2）油相的配制：将乳化剂加入液体石蜡中，混合均匀，置于35 ～ 75℃恒温水浴中配制得到油相；所述乳化剂为司盘80，用量为液体石蜡重量的0.5 ～ 2wt％ ；

(3) 乳化缩聚：在搅拌条件下采用注射器将步骤（1）获得的水相滴加到步骤（2）获得的油相中，水相与油相的体积比为(5 ～ 10) ∶ 1 ；乳化温度为40 ～ 70℃，在500 ～ 7000r/min 下乳化10 ～ 30min，再逐滴加入一定量甲醛溶液，乳化缩聚10-24h后转移到冰水浴中；

(4) 固化与脱水：继续搅拌，向其中滴加适量戊二醛，继续搅拌，用分液漏斗缓慢滴加入无水异丙醇，滴加完毕之后，继续搅拌3-6h，放置0.5-3h；

(5) 洗涤、分离、过筛与干燥：倾去上清液，用无水异丙醇反复清洗，抽滤，再用乙醚清洗数次；抽滤，真空干燥，即得淡黄色微球干粉。

步骤（1）所述的酪氨酸与草酸的物质的量比为1：（0.01~0.1）。

步骤（1）所述的盐酸的浓度为0.1 -2 mol/L 。

步骤（3）所述的酪氨酸与甲醛物质的量比为1：（0.6-1.5）。

步骤（4）所述的戊二醛投加量与酪氨酸物质量比为（0.5-1.5）：1，异丙醇投加量为100-150mL。

本发明上述的方法制得的一种表面带氨基、羧基和羟基多官能团的自发荧光的聚合物微球，其特征在于：所述自发荧光的聚合物微球呈单分散分布，平均粒径为0.1-20μm。

所述自发荧光的聚合物微球的激发波长为330-420nm，最大发射波长为510-540nm。

本发明所述的表面带氨基、羧基和羟基多官能团的自发荧光的聚合物微球的制备方法，具体地说包括以下步骤：

（1）配制水相：将一定比例的酪氨酸和草酸溶解在一定浓度的盐酸溶液中，配制得到浓度为4-30wt%的酪氨酸溶液；然后加入适量乳化剂，混合乳化均匀即成水相，所述乳化剂为Tween20，用量为浓度为4-30wt%的酪氨酸溶液重量的0.3-2wt%；

（2）配制油相：将乳化剂加入液体石蜡中，混合均匀，置于35 ～ 75℃恒温水浴中配制得到油相；所述乳化剂为司盘80，用量为液体石蜡重量的0.5 ～ 2wt％ ；

(3) 乳化：在搅拌条件下采用注射器将步骤（1）获得的水相滴加到步骤（2）获得的油相中，水相与油相的体积比为(5 ～ 10) ∶ 1 ；乳化温度为40 ～ 70℃，在500 ～ 7000r/min 下乳化10 ～ 30min，再逐滴加入一定量甲醛溶液，乳化缩聚10-24h后转移到冰水浴中；

(4) 固化与脱水：继续搅拌，向其中滴加适量戊二醛，继续搅拌3-5h，用分液漏斗滴加无水异丙醇，每分钟20 滴，滴加完毕之后，继续搅拌3-6h，放置0.5-3h；

(5) 洗涤、分离与干燥：倾去上清液，用异丙醇反复清洗，抽滤，再用乙醚清洗数次；抽滤，干燥，即得淡黄色微球干粉。

所述的一种表面带氨基、羧基和羟基多官能团的自发荧光的聚合物微球，其特征在于：所述荧光微球呈单分散分布，粒径可根据需要在0.1-20μm进行调控；荧光微球的激发波长为330-420nm，最大发射波长为510-540nm。

步骤（1）所述的酪氨酸与草酸的物质的量比为1：（0.01~0.1）。

步骤（1）所述的盐酸浓度为0.1-2mol/L。

步骤（3）所述的酪氨酸与甲醛物质的量比为1：（0.6-1.5）。

步骤（4）所述的戊二醛投加量与酪氨酸物质量比为（0.5-1.5）：1，异丙醇投加量为100-150mL。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

（1）以多官能团的酪氨酸为荧光原料，通过乳液缩聚一步制备粒度分布较为均匀、可在0.1-20μm范围调控的荧光微球，荧光物质分布均匀、性能稳定、不易泄漏与脱落。

（2）与先合成聚合物再通过乳化-凝聚法制备荧光微球工艺相比，该乳液缩聚一步制备荧光微球直接采用酪氨酸单体为原料，不受聚合物溶解性限制；制备过程通过改变酪氨酸溶液的浓度实现微球粒径的调控，工艺简单，反应过程易于控制，生产成本低，重现性好，适合工业化批量生产。

（3）本发明采用的荧光原料酪氨酸为人体组成蛋白质的重要成分，制备的酪氨酸缩甲醛微球不仅具有良好的生物相容性，而且合成的微球表面带有大量的氨基、羧基和羟基多官能团，为微球的生物反应提供位点，有利于其在示踪、药物载体等生物医药领域的应用。

附图说明

图1为本发明实施例1所制备的酪氨酸缩甲醛荧光微球的FT-IR谱图。

图2为本发明实施例1所制备的酪氨酸缩甲醛荧光微球的SEM照片。

图3为本发明实施例1所制备的酪氨酸缩甲醛荧光微球的发射光谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，仅在于说明本发明而不是限制本发明的范围。

实施例1

（1）称取1.9g酪氨酸溶解在6mL 0.5mol/L HCl溶液中，加入0.05g草酸，搅拌，使之完全溶解。加入0.08g tween 20 ，搅拌，混合均匀；

（2）在500mL烧杯中加入100mL液体石蜡,加入2.25gspan 80，搅拌，混合均匀；

（3）在60℃条件下，将酪氨酸溶液用注射器缓慢滴加到含有span80 的100mL液体石蜡中，800r/min下乳化30min，逐滴加入2mL37 wt%甲醛溶液，乳化缩聚14h后转移到冰水浴中；

(4)继续搅拌，向其中滴加4mL 50wt%戊二醛溶液，继续搅拌2h，用分液漏斗逐滴加入100mL无水异丙醇，滴加速率为20d/min，滴加完毕之后，继续搅拌3h，放置30min ；

(5)倾去上清液，用异丙醇反复清洗，抽滤，再用乙醚清洗数次，真空40℃干燥，得到淡黄色粉末状产物。

产物经红外光谱鉴定为酪氨酸-甲醛缩聚物；从扫描电子显微镜的形貌分析可以看出，形貌为单分散规整圆球状颗粒，粒子平均尺度为1-10μm；从荧光光谱可以看出，产物受波长为365nm光激发，在540nm处有强发射峰，见图1、图2和图3。

实施例2

（1）称取1.9g酪氨酸溶解在12mL 1mol/L HCl溶液中，加入0.05g草酸，搅拌，使之完全溶解。加入0.08g tween 20，搅拌，混合均匀；

（2）在500mL烧杯中加入100mL液体石蜡,加入2.25g span 80，搅拌，混合均匀；

（3）在60℃条件下，将酪氨酸溶液用注射器缓慢滴加到含有span80 的100mL液体石蜡中，800r/min下乳化30min，逐滴加入2mL 37 wt%甲醛溶液，乳化缩聚14h后转移到冰水浴中；

(4)继续搅拌，向其中滴加4mL 50 wt %戊二醛溶液，继续搅拌2h，用分液漏斗逐滴加入100mL无水异丙醇，滴加速率为20d/min，滴加完毕之后，继续搅拌3h，放置2h；

(5)倾去上清液，用异丙醇反复清洗，抽滤，再用乙醚清洗数次，沉淀物即为淡黄色，粒径为1-20微米的酪氨酸缩甲醛荧光微球。各项表征结果与实施例1合成产物类似。各项表征结果与实施例1合成产物类似。

实施例3

（1）称取1.9g酪氨酸溶解在6mL 1mol/L HCl溶液中，加入0.05g草酸，搅拌，使之完全溶解。加入0.08g tween 20 ，搅拌，混合均匀；

（2）在500mL烧杯中加入100mL液体石蜡,加入2.25g span 80，搅拌，混合均匀；

（3）在60℃条件下，将酪氨酸溶液用注射器缓慢滴加到含有span80 的100mL液体石蜡中，7000r/min下乳化30min，逐滴加入2mL 37 wt %甲醛溶液，乳化缩聚14h后转移到冰水浴中；

(4)继续搅拌，向其中滴加4mL 50wt%戊二醛溶液，继续搅拌4h，用分液漏斗逐滴加入100mL无水异丙醇，滴加速率为20d/min，滴加完毕之后，继续搅拌5h，放置1h ；

(5)倾去上清液，用异丙醇反复清洗，抽滤，再用乙醚清洗数次，沉淀物即为淡黄色，粒径为0.1-5微米的酪氨酸缩甲醛荧光微球。各项表征结果与实施例1合成产物类似。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请保护范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。