从荞麦花粉中分离的鞣质类化合物及其应用的制作方法

本发明涉及从荞麦花粉中分离的鞣质类化合物及其应用，属于食品、药品、保健品和化妆品领域。

背景技术：

荞麦花粉是蓼科荞麦属草本双子叶植物荞麦(buckwheat)的花粉，荞麦蜂花粉是蜜蜂从荞麦花中采集花粉后，与自身腺体分泌的物质及唾液混合后，形成的不规则扁圆形团状物，富含人体所需的多种营养物质，具有多种生理功能。目前对荞麦花粉和蜂花粉的研究主要集中多糖和黄酮方面，荞麦花粉和蜂花粉多糖能降低四氧嘧啶所致高血糖大鼠的血糖值，黄酮对毛细血管壁具有很强的保护作用，能增强心脏的收缩，用于心悸、心脑衰弱和毛细血管脆弱等症状。而目前对荞麦花粉和蜂花粉用于美白化妆品、预防前列腺疾病方面研究的相关报道甚少，更无从了解这些功能的物质基础。

技术实现要素：

本发明首次从荞麦花粉和荞麦蜂花粉中分离鉴定出一类鞣质类化合物，主要由1，2，3，4，6-五-o-没食子酰-d-葡萄糖和1，2，3，4，6-五-o-没食子酰-2-o-间-双没食子酰-d-葡萄糖二种成分组成。荞麦花粉和蜂花粉鞣质类化合物的提取制备方法如下：

(1)乙醇提取物的制备：

荞麦蜂花粉经粉碎后，加入体积分数为60-80％的乙醇溶液，荞麦蜂花粉与乙醇溶液的比例为1:(8-10)kg/l，于30-45℃条件下搅拌提取3-5h，过滤取上清液，如此重复2-3次，合并所得上清液减压浓缩后即得荞麦蜂花粉醇提物。

(2)乙酸乙酯萃取物的制备

将荞麦蜂花粉醇提物用2-5倍体积的乙酸乙酯萃取，萃取二次，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩，得乙酸乙酯萃取物。

(3)分离纯化

将乙酸乙酯萃取物上大孔树脂柱，大孔树脂为ab-8或x-5型，依次用去离子水、体积分数为30-95％的乙醇溶液进行梯度洗脱，具体是用乙醇溶液洗脱是用30％、50％、95％体积浓度的乙醇溶液分别20l、40l、30l进行洗脱或者用40％、50％、75％体积浓度的乙醇溶液分别20l、40l、30l进行洗脱，收集以体积分数50％的乙醇溶液洗脱部分，减压浓缩后上样到mci柱，依次用浓度30-50％的乙醇进行洗脱，tlc法跟踪检测洗脱液中的成分，并根据tlc检测结果将具有相同成分的洗脱液合并，得两个洗脱组分，减压浓缩后再分别将两个组分反复上ods柱，用30-45％体积浓度的乙醇溶液洗脱，tlc法跟踪检测洗脱液中的成分，最后得二个单体化合物a，b，均为黄色无定形粉末，易溶于水、甲醇、乙醇等溶剂；

本发明的有益效果在于：

本发明首次从荞麦花粉和荞麦蜂花粉中提取分离到1，2，3，4，6-五-o-没食子酰-d-葡萄糖和1，2，3，4，6-五-o-没食子酰-2-o-间-双没食子酰-d-葡萄糖两种化合物；

本发明得到的乙醇提取物，乙酸乙酯萃取物，化合物a，化合物b浓度为1000μg/ml时，对酪氨酸酶活性的抑制作用分别达到50.27％、55.83％、68.86％、63.98％，具有美白的功效；

本发明制备的乙酸乙酯萃取物、化合物a、化合物b均具有抑制前列腺炎症的功能，在对角叉菜胶所致大鼠前列腺炎症的抑制效果试验中，与模型组相比，乙酸乙酯萃取物对前列腺湿重、前列腺指数、il-8和脾脏指数这四个指标有显著的抑制作用，显著性分析结果显示化合物a、化合物b有非常明显的差异。

附图说明

图1：化合物a的¹³cnmr谱图

图2：化合物b的¹³cnmr谱图

图3：化合物a的¹hnmr谱图

图4：化合物b的¹hnmr谱图

图5：化合物a的135dept谱图

图6：化合物b的135dept谱图

具体实施方式

实施例1

荞麦蜂花粉经粉碎后，加入体积分数为80％的乙醇溶液，荞麦蜂花粉与乙醇溶液的比例为1:10(kg/l)，于45℃条件下搅拌提取3h，过滤取上清液，如此重复3次，合并所得上清液减压浓缩后即得荞麦蜂花粉醇提物。将荞麦蜂花粉醇提物用2倍体积的乙酸乙酯萃取，萃取二次，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩，得乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物上大孔树脂柱，大孔树脂为ab-8，依次用去离子水、体积分数为30％、50％、95％的乙醇溶液分别20ml、40ml、30ml进行梯度洗脱，收集以体积分数50％的乙醇溶液洗脱部分，减压浓缩后上样到mci柱，依次用浓度30-50％的乙醇进行洗脱，tlc法跟踪检测洗脱液中的成分，并根据tlc检测结果将具有相同成分的洗脱液合并，得两个洗脱部分，减压浓缩后再分别将各部分反复上ods柱，用30％体积浓度的乙醇溶液洗脱，tlc法跟踪检测洗脱液中的成分，最后得二个单体化合物a，b。

实施例2化合物a、b结构鉴定

由化合物a的¹h-nmr(dmso-d6，500mhz)谱可知，δ7.08、δ7.05、δ6.92、δ6.87、δ6.82(2h，s)处共有5组质子信号，每组含2个h，说明该化合物存在对称结构。δ6.39处有一个h，j＝8.0，推测这个h为糖上的端基质子信号，δ5.98～δ4.31处为糖上的其他质子信号。从化合物a的¹³c-nmr(dmso-d6，125mhz)谱可知，δ91.7、δ72.2、δ72.0、δ70.6、δ67.8、δ61.5处为吡喃葡萄糖基上的糖的6个碳信号。δ165.5～δ164.0、δ145.7～δ145.4、δ139.7～δ138.8、δ118.9～δ117.4、δ109.1～δ108.8处共有5组碳信号，每组含5个碳。从135dept谱中只见到δ109.1～δ108.8，为ch信号，其余为季碳。根据以上结果并参照相关文献可得该化合物含有5个没食子酰，综合分析得出该化合物为1，2，3，4，6-五-o-没食子酰-d-葡萄糖。

化合物b的¹h-nmr(dmso-d6，500mhz)谱和¹³c-nmr(dmso-d6，125mhz)谱与化合物a的类似。从化合物b的¹h-nmr谱可见，δ6.46处有一个h(j＝8.0)，推测这个h为糖上的端基质子信号，δ6.04～δ4.31处为糖上的其他质子信号。从化合物b的13c-nmr谱可见，δ165.7～δ163.7、δ146.9～δ144.7、δ140.2～δ139.1、δ119.2～δ117.5、δ109.6～δ108.6处共有5组碳信号。另外，δ164.9，δ150.8，δ146.9，δ140.2，δ126.8，δ109.1有1组碳信号，这组碳信号应为一个没食子酰基上再连一个没食子酰。根据以上结果推测，结合化合物b的135dept谱图，确定该化合物为1，2，3，4，6-五-o-没食子酰-2-o-间-双没食子酰-d-葡萄糖。

下面实施例3和实施例4活性的研究以实施例1制备的乙醇提取物，乙酸乙酯萃取物，化合物a，化合物b为研究对象。

实施例3对酪氨酸酶活性的抑制作用

表1加样表

按表1依次向试管中加入ph为6.8的磷酸盐缓冲溶液，样品溶液，浓度为0.5g/ml的酪氨酸溶液，浓度为1mg/ml的熊果苷对照液，于35℃水浴10min，然后加入酪氨酸酶液，在35℃下孵育30min，迅速转入比色皿中，在475nm处测吸光度值。样品用空白对照1调零，阴性对照用空白对照2调零，阳性对照用空白对照3调零，抑制率的计算如下式

式中：a1为样品吸光值；a2为阴性对照吸光值；a3为阳性对照吸光值。

表2荞麦蜂花粉不同组分对酪氨酸酶活性的抑制作用(％)

由表2的实验结果可知，乙醇提取物，乙酸乙酯萃取物，化合物a，化合物b对酪氨酸酶活性都有很好的抑制，具有美白的功效；浓度为1000μg/ml时，乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物、化合物a、化合物b对酪氨酸酶活性的抑制作用分别达到50.27％、55.83％、68.86％、63.98％。

实施例4抗前列腺炎症活性评估

利用角叉菜胶所致大鼠前列腺炎症的模型对油菜花碱进行了体内抗前列腺炎症试验，通过前列腺湿重、前列腺指数、il-8和脾脏指数四指标来检测油菜花碱对前列腺炎症的作用，结果如表2所示。

表2.荞麦蜂花粉不同组分对对角叉菜胶所致大鼠前列腺炎症的抑制效果

n＝10；*表示与模型组相比有明显差异，p<0.05；**表示与模型组相比有非常明显差异，p<0.01

从表2可以上得出，与模型组相比，乙酸乙酯萃取物对前列腺湿重、前列腺指数、il-8和脾脏指数这四个指标有显著的抑制作用，显著性分析结果显示化合物a、化合物b有非常明显差异，表明乙酸乙酯萃取物、化合物a、化合物b具有抑制前列腺炎症的功能。

实施例5

荞麦蜂花粉经粉碎后，加入体积分数为60％的乙醇溶液，荞麦蜂花粉与乙醇溶液的比例为1:8(kg/l)，于35℃条件下搅拌提取3h，过滤取上清液，如此重复3次，合并所得上清液减压浓缩后即得荞麦蜂花粉醇提物。将荞麦蜂花粉醇提物用2倍体积的乙酸乙酯萃取，萃取2次，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩，得乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物上大孔树脂柱，大孔树脂为ab-8，依次用去离子水、体积分数为30％、50％、95％的乙醇溶液分别20ml、40ml、30ml进行梯度洗脱，收集以体积分数50％的乙醇溶液洗脱部分，减压浓缩后上样到mci柱，依次用浓度30-50％的乙醇进行洗脱，tlc法跟踪检测洗脱液中的成分，并根据tlc检测结果将具有相同成分的洗脱液合并，得两个洗脱部分，减压浓缩后再分别将各部分反复上ods柱，用40％体积浓度的乙醇溶液洗脱，tlc法跟踪检测洗脱液中的成分，最后得二个单体化合物a，b。

实施例6

荞麦蜂花粉经粉碎后，加入体积分数为70％的乙醇溶液，荞麦蜂花粉与乙醇溶液的比例为1:9(kg/l)，于45℃条件下搅拌提取4h，过滤取上清液，如此重复3次，合并所得上清液减压浓缩后即得荞麦蜂花粉醇提物。将荞麦蜂花粉醇提物用3倍体积的乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩，得乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物上大孔树脂柱，大孔树脂为x-5，依次用去离子水、体积分数为40％、50％、75％的乙醇溶液分别20ml、40ml、30ml进行梯度洗脱，收集以体积分数50％的乙醇溶液洗脱部分，减压浓缩后上样到mci柱，依次用浓度30-50％的乙醇进行洗脱，tlc法跟踪检测洗脱液中的成分，并根据tlc检测结果将具有相同成分的洗脱液合并，得两个洗脱部分，减压浓缩后再分别将各部分反复上ods柱，用45％体积浓度的乙醇溶液洗脱，tlc法跟踪检测洗脱液中的成分，最后得二个单体化合物a，b。

以上较佳实施例仅用于说明本发明的内容，除此之外，本发明还有其他实施方式，但凡本领域技术人员因本发明所涉及之技术启示，而采用等同替换或等效变形方式形成的技术方案均落在本发明的保护范围内。