本发明属于生物技术领域，具体涉及预测儿童患者药物肾毒性的生物标志物及应用。
背景技术：
药物肾毒性(drug induced liver injury，DILI)是指药物引起的肾脏毒性反应。肾脏是药物代谢和排泄的重要器官，由于其特殊的结构和功能，对药物的毒性作用极具易感性。药物肾毒性已成为临床前药物中止研发和临床不良反应的主要原因。据估计，由于药物造成的肾损伤占所有急性肾损伤病例中的19％～25％。药物相关的肾损害常常具有不同的临床特征和不同的病理类型，其临床表现主要为与应用某种药物密切相关的急性肾损害或慢性肾功能不全，尤以肾小管功能损害最为突出。其病理可表现为急性肾小管坏死或急、慢性肾小管间质肾病，进展和预后不尽相同，部分病例甚至会发展为终末期肾衰竭及死亡。由于儿童固定的药物剂量、体重相关或体表面积相关的给药方式、代谢酶的不成熟以及对儿童发生药物肾毒性的危险认识不足等原因，发生药物肾毒性的风险更高，且更凶险。有效的预防肾毒性在儿童患者中的发生，具有重要意义。临床研究发现，在给药方案与用药剂量相同的情况下，药物导致的肾毒性具有较大的个体差异，而这种差异在一定程度上与个体遗传多态性相关。但因这些研究大多在成人中进行，而成人因饮食生活习惯(如吸烟、饮酒、高脂饮食等)，合并症(如糖尿病等)等因素的影响，使得遗传多态性对成人肾毒性的预测能力有限。
技术实现要素：
我们发现遗传多态性对儿童药物肾毒性的作用更大，这可能与儿童发育还未完全，对药物的副作用更敏感等原因相关。因此，本发明主要是基于遗传药理学知识或/和药物基因组学知识，采用遗传多态性预测肾毒性在儿童患者中的发生风险，对临床安全合理用药提供重要的指导，避免使用风险高的药物或必须使用风险高的药物时及早进行风险管控，最大限度降低严重药物不良反应的发生率和不良反应的危害程度。本发明提供了预测儿童患者肾毒性的生物标志物，该生物标志物可用于制备预测儿童患者肾毒性药物和试剂盒。
本发明是指采用遗传药理学知识或/和药物基因组学知识，预测儿童患者使用铂类药物(顺铂(Cisplatin)、卡铂(Carboplatin))、钙调磷酸酶抑制剂(环孢素A(Cyclosporine A)、他克莫司(Tacrolimus))、替诺福韦(Tenofovir)、异环磷酰胺(Ifosfamide)、万古霉素(Vancomycin)、阿扎那韦(Atazanavir)等药物时发生肾毒性的风险。具体包括 以下内容：
1.铂类药物：①ERCC1 118C、ERCC1 8092C>A、ERCC1Asn118Asn、ERCC1 19007T/C、ERCC1 8092C/A、XPD c.934AA、XPD c.2251C、XPD-Asn312/751Gln、TP53 72Arg、EPHX1rs1051740T/C、eIF3α Arg803Lys、SLC22A2 808G、SLC22A2rs316019基因多态性中的任何一个或多个多态性，均可预测儿童患者使用铂类药物(顺铂、卡铂)发生肾毒性的风险，若同时出现2个或2个以上的多态性预测能力更强。②ERCC1 118C、ERCC1 8092C>A、ERCC1Asn118Asn、ERCC1 19007T/C、ERCC1 8092C/A、XPD c.934AA、XPD c.2251C、XPD-Asn312/751Gln、TP53 72Arg、EPHX1rs1051740T/C、eIF3α Arg803Lys、SLC22A2 808G、SLC22A2rs316019多态性中多个多态性组成的单倍型，也可预测儿童患者使用铂类药物(顺铂、卡铂)发生肾毒性的风险。
2.环孢素A：①CYP3A5*3、ABCB1 2677G>T、ABCB1 3435C>T、PRKCB rs11074606、CypA-promoter(-11G/C)、TGF-β1codon 25(Arg(25)>Pro)基因多态性中的任何一个或多个多态性，均可预测儿童患者使用环孢素A发生肾毒性的风险，若同时出现2个或2个以上的多态性预测能力更强。②CYP3A5*3、ABCB1 2677 G>T、ABCB13435C>T、PRKCB rs11074606、CypA-promoter(-11G/C)、TGF-β1 codon 25(Arg(25)>Pro)多态性中多个多态性组成的单倍型，也可预测儿童患者使用环孢素A发生肾毒性的风险。
3、他克莫司：①CYP3A5*1、ABCB1C1236T、CYP2C8*3、ABCB1G2677T/A、ABCB1C3435T、ABCB1(null)、TGF-β1codon 10(Leu(10)>Pro)、TGF-β1codon 25(Arg(25)>Pro)、PRKCB rs11074606、CypA-promoter(-11G/C)基因多态性中的任何一个或多个多态性，均可预测儿童患者使用他克莫司发生肾毒性的风险，若同时出现2个或2个以上的多态性预测能力更强。②CYP3A5*1、ABCB1C1236T、CYP2C8*3、ABCB1G2677T/A、ABCB1C3435T、ABCB1(null)、TGF-β1codon 10(Leu(10)>Pro)、TGF-β1codon 25(Arg(25)>Pro)、PRKCB rs11074606、CypA-promoter(-11G/C)多态性中多个多态性组成的单倍型，也可预测儿童患者使用他克莫司发生肾毒性的风险。
4、替诺福韦：①ABCC2 1249G>A、ABCC2 24C、ABCC4T4976C、ABCC2rs8187707、OCRL rs128718244C>T、OCRL rs 128718318A>G基因多态性中的任何一个或多个多态性，均可预测儿童患者使用替福诺韦发生肾毒性的风险，若同时出现2个或2个以上的多态性预测能力更强。②ABCC2 1249G>A、ABCC2 24C、ABCC4T4976C、ABCC2rs8187707、OCRL rs128718244C>T、OCRL rs 128718318A>G多态性中多个多态性组成的单倍型，也可预测儿童患者使用替福诺韦发生肾毒性的风险。
5.异环磷酰胺：①GSTP1codon 105A-G、GSTP1+313A-G基因多态性中的任何一个或多个多态性，均可预测儿童患者使用异环磷酰胺发生肾毒性的风险，若同时出现2个或2个以上的多态性预测能力更强。②GSTP1codon 105A-G、GSTP1+313A-G多态性中多个多态性组成的单倍型，也可预测儿童患者使用异环磷酰胺发生肾毒性的风险。
6.万古霉素：①染色体6q22.31rs2789047基因多态性中的任何一个或多个多态性，均可预测儿童患者使用万古霉素发生肾毒性的风险，若同时出现2个或2个以上的多态性预测能力更强。②染色体6q22.31rs2789047多态性中多个多态性组成的单倍型，也可预测儿童患者使用万古霉素发生肾毒性的风险。
7.阿扎那韦：①UGT1A-3'-UTR c.211C/T、UGT1A-3'-339C/G、UGT1A-3'-440C/G基因多态性中的任何一个或多个多态性，均可预测儿童患者使用阿扎那韦发生肾毒性的风险，若同时出现2个或2个以上的多态性预测能力更强。②UGT1A-3'-UTR c.211C/T、UGT1A-3'-339C/G、UGT1A-3'-440C/G多态性中多个多态性组成的单倍型，也可预测儿童患者使用阿扎那韦发生肾毒性的风险。
具体实施方式
1.采集外周静脉血样或口腔脱落细胞。
2.提取基因组DNA。
3.针对不同药物(铂类(顺铂、卡铂)、钙调磷酸酶抑制剂(环孢素A、他克莫司)、替诺福韦、异环磷酰胺、万古霉素、阿扎那韦选择不同的基因检测试剂盒。
⑴铂类药物(顺铂、卡铂)：包含ERCC1 118C、ERCC1 8092C>A、ERCC1Asn118Asn、ERCC1 19007T/C、ERCC1 8092C/A、XPD c.934AA、XPD c.2251C、XPD-Asn312/751Gln、TP53 72Arg、EPHX1rs1051740T/C、eIF3αArg803Lys、SLC22A2 808G、SLC22A2rs316019多态性中的一个或多个组合或单倍型的基因检测试剂盒。
⑵环孢素A：包含CYP3A5*3、ABCB1 2677G>T、ABCB1 3435C>T、PRKCBrs11074606、CypA-promoter(-11G/C)、TGF-β1codon 25(Arg(25)>Pro)多态性中的一个或多个组合或单倍型的基因检测试剂盒。
⑶他克莫司：包含CYP3A5*1、ABCB1C1236T、CYP2C8*3、ABCB1G2677T/A、ABCB1C3435T、ABCB1(null)、TGF-β1codon 10(Leu(10)>Pro)、TGF-β1codon 25(Arg(25)>Pro)、PRKCB rs11074606、CypA-promoter(-11G/C)多态性中的一个或多个组合或单倍型的基因检测试剂盒。
⑷替诺福韦：包含ABCC2 1249G>A、ABCC2 24C、ABCC4T4976C、ABCC2 rs8187707、OCRL rs128718244C>T、OCRL rs 128718318A>G多态性中的一个或多个组合或单倍型的基因检测试剂盒。
⑸异环磷酰胺：包含GSTP1codon 105A-G、GSTP1+313A-G多态性中的一个或多个组合或单倍型的基因检测试剂盒。
⑹万古霉素：包含染色体6q22.31rs2789047多态性中的一个或多个组合或单倍型的基因检测试剂盒。
⑺阿扎那韦：包含UGT1A-3'-UTR c.211C/T、UGT1A-3'-339C/G、UGT1A-3'-440C/G多态性中的一个或多个组合或单倍型的基因检测试剂盒。
4.根据检测采用基因检测试剂盒的结果，预测药物诱导肾毒性发生风险。
⑴铂类药物(顺铂、卡铂)：若儿童患者出现ERCC1 118C、ERCC1 8092C>A、ERCC1Asn118Asn、ERCC1 19007T/C、ERCC1 8092C/A、XPD c.934AA、XPD c.2251C、XPD-Asn312/751Gln、TP53 72Arg、EPHX1rs1051740T/C、eIF3αArg803Lys、SLC22A2808G、SLC22A2rs316019多态性中的一个，使用铂类药物发生肾毒性的风险较高，儿童患者慎用铂类药物；若出现多个多态性组合或单倍型阳性，使用铂类药物发生肾毒性的风险高，不建议儿童患者使用铂类药物；若上述基因多态性均为阴性，则使用铂类药物发生肾毒性的风险低，儿童患者可安全使用铂类药物。
⑵环孢素A：若儿童患者出现CYP3A5*3、ABCB1 2677G>T、ABCB1 3435C>T、PRKCB rs11074606、CypA-promoter(-11G/C)、TGF-β1codon 25(Arg(25)>Pro)多态性中的一个，使用环孢素A发生肾毒性的风险较高，儿童患者慎用环孢素A；若出现多个多态性组合或单倍型阳性，使用环孢素A发生肾毒性的风险高，不建议儿童患者使用环孢素A；若上述基因多态性均为阴性，则使用环孢素A发生肾毒性的风险低，儿童患者可安全使用环孢素A。
⑶他克莫司：若儿童患者出现CYP3A5*1、ABCB1C1236T、CYP2C8*3、ABCB1G2677T/A、ABCB1C3435T、ABCB1(null)、TGF-β1codon 10(Leu(10)>Pro)、TGF-β1codon 25(Arg(25)>Pro)、PRKCB rs11074606、CypA-promoter(-11G/C)多态性中的一个，使用他克莫司发生肾毒性的风险较高，儿童患者慎用他克莫司；若出现多个多态性组合或单倍型阳性，使用他克莫司发生肾毒性的风险高，不建议儿童患者使用他克莫司；若上述基因多态性均为阴性，则使用他克莫司发生肾毒性的风险低，儿童患者可安全使用他克莫司。
⑷替诺福韦：若儿童患者出现ABCC2 1249G>A、ABCC2 24C、ABCC4T4976C、 ABCC2rs8187707、OCRL rs128718244C>T、OCRL rs 128718318A>G多态性中的一个，使用替诺福韦发生肾毒性的风险较高，儿童患者慎用替诺福韦；若出现多个多态性组合或单倍型阳性，使用替诺福韦发生肾毒性的风险高，不建议儿童患者使用替诺福韦；若上述基因多态性均为阴性，则使用替诺福韦发生肾毒性的风险低，儿童患者可安全使用替诺福韦。
⑸异环磷酰胺：若儿童患者出现GSTP1codon 105A-G、GSTP1+313A-G多态性中的一个，使用异环磷酰胺发生肾毒性的风险较高，儿童患者慎用异环磷酰胺；若出现多个多态性组合或单倍型阳性，使用异环磷酰胺发生肾毒性的风险高，不建议儿童患者使用异环磷酰胺；若上述基因多态性均为阴性，则使用异环磷酰胺发生肾毒性的风险低，儿童患者可安全使用异环磷酰胺。
⑹万古霉素：若儿童患者出现染色体6q22.31rs2789047多态性中的一个，使用万古霉素发生肾毒性的风险较高，儿童患者慎用万古霉素；若出现多个多态性组合或单倍型阳性，使用万古霉素发生肾毒性的风险高，不建议儿童患者使用万古霉素；若上述基因多态性均为阴性，则使用万古霉素发生肾毒性的风险低，儿童患者可安全使用万古霉素。
⑺阿扎那韦：若儿童患者出现UGT1A-3'-UTR c.211C/T、UGT1A-3'-339C/G、UGT1A-3'-440C/G多态性中的一个，使用阿扎那韦发生肾毒性的风险较高，儿童患者慎用阿扎那韦；若出现多个多态性组合或单倍型阳性，使用阿扎那韦发生肾毒性的风险高，不建议儿童患者使用阿扎那韦；若上述基因多态性均为阴性，则使用阿扎那韦发生肾毒性的风险低，儿童患者可安全使用阿扎那韦。
案例1：5例儿童患者药物引起肾毒性的基因型分析
1.回顾性总结和分析5例儿童患者药物引起的肾毒性资料，包括：年龄、用药种类、临床表现、肾功能指标等。所有病例诊断均参照《常见严重药品不良反应技术规范及评价标准》肾损害药品不良反应的判定评价标准。根据血清肌酐上升水平将肾损害程度分为一般和严重两类。(见下表1)。
2.采取5例儿童患者药物引起肾损伤的外周静脉血。
3.提取基因组DNA。
4.分别采用预测儿童患者使用环孢素A引起肾毒性风险基因检测试剂盒、预测儿童患者使用他克莫司引起肾毒性风险基因检测试剂盒、预测儿童患者使用顺铂引起肾毒性风险基因检测试剂盒，检测环孢素A、他克莫司、顺铂引起肝损伤儿童患者的基因型。
5.检测结果见表1，①环孢素A引起的肾损伤儿童患者基因型分别为：CYP3A5*3、ABCB1 3435C>。②他克莫司引起的肾损伤儿童患者基因型分别为：CYP3A5*1、ABCB1G2677T/A、ABCB1C3435T。③顺铂引起的肾损伤儿童患者基因型分别为：SLC22A2 808GG、SLC22A2rs316019、ERCC1 19007T/C、ERCC1 8092C/A。
表1
案例2：5例服用他克莫司、顺铂未发生肾损伤患儿的基因型分析
1.回顾性分析5例儿童患者服用他克莫司(3例)、顺铂(2例)未发生肾损伤的资料，包括：年龄、用药种类、临床表现、肾功能指标等。
2.收集5例儿童患者的外周静脉血。
3.提取基因组DNA。
4.基因型检测：①采用预测儿童患者使用他克莫司引起肾损伤风险基因检测试剂盒、检测上述3例使用他克莫司未发生肾损伤的儿童患者基因型。②采用预测儿童患者使用顺铂引起肾损伤风险基因检测试剂盒，检测上述2例使用顺铂未发生肾损伤的儿童患者基因型。
5.检测结果：①3例服用他克莫司的儿童患者基因型中未发现能引起肾损伤的相关基因多态性或单倍型(CYP3A5*1、ABCB1C1236T、CYP2C8*3、ABCB1G2677T/A、ABCB1C3435T、ABCB1(null)、TGF-β1codon 10(Leu(10)>Pro)、TGF-β1codon 25(Arg(25)>Pro)、PRKCB rs11074606、CypA-promoter(-11G/C))。②2例服用顺铂的儿童患者基因型中未发现能引起肾损伤的相关基因多态性或单倍型(ERCC1 118C、ERCC1 8092C>A、ERCC1Asn118Asn、ERCC1 19007T/C、ERCC1 8092C/A、XPD c.934AA、XPD c.2251C、XPD-Asn312/751Gln、TP53 72Arg、EPHX1rs1051740T/C、eIF3αArg803Lys、SLC22A2808G、SLC22A2rs316019)。