用于人类MET基因外显子14缺失突变检测的核苷酸序列及试剂盒的制作方法

本发明涉及检测人类MET基因外显子14缺失突变的引物、探针及试剂盒。
背景技术：
：MET原癌基因位于7q31，全长为125982bp，由24个外显子组成。成熟的METmRNA全长为6641bp，翻译后的MET蛋白由1390个氨基酸组成。MET是原癌基因编码的蛋白产物，为干细胞生长因子受体，具有酪氨酸激酶活性，与多种癌基因产物和调节蛋白相关，参与细胞信息转到、细胞骨架重排的调控，是细胞增殖、分化和运动的重要因素。目前，在肺癌患者中，MET基因外显子14缺失突变被认为是一种潜在的驱动性突变。存在这种突变的NSCLC患者对MET抑制剂具有显著疗效。目前，对MET基因外显子14缺失突变检测方法主要为直接测序法。直接测序法主要步骤为：1)PCR扩增；2)琼脂糖凝胶电泳确认；3)产物切胶回收纯化；4)上机测序。此种方法检测成本低，但检测灵敏度较低，易产生假阴性加过；开盖操作，易产生假阳性结果；检测步骤比较繁琐，耗费时间长。技术实现要素：本发明提供了检测人类MET基因外显子14缺失突变的引物、探针及试剂盒。本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是：检测人类MET基因外显子14缺失突变的引物组合，包括：MET-BL1ACACTTCGGGCACTTACAAGCCTATCCAAATGAGGAGTGTGTACTCTTGCATCGTAGCGMET-IC-F1CCACGGGACAACACAATACAGTACMET-IC-R1CATAGGACCGTATTTCGGCGAAMET-M1-F1GGTTTTTCCTGTGGCTGAAAAAGAGMET-M1-R1GGCATGAACCGTTCTGAGATGA检测人类MET基因外显子14缺失突变的探针组合，包括：MET-IC-P1CCTATGTGGATCCTGMET-M1-P1CAAATTAAAGATCAGTTTCC。检测人类MET基因外显子14缺失突变的试剂盒，其包括前述的引物组合。检测人类MET基因外显子14缺失突变的试剂盒，其包括前述的探针组合。检测人类MET基因外显子14缺失突变的体系，包括：原料名称浓度体积DEPC水0.001余量10*TOSbuffer(pH9.0)3.5-4.5μl17#dNTP25mM0.3-0.5μlBSA5mg/ml0.008-0.1μl甲酰胺ML/瓶0.55-0.65μlMET-BL1100uM1.9-2.1μlMET-IC-F1100uM0.04-0.06μlMET-IC-R1100uM0.04-0.06μlMET-IC-P1100uM0.02-0.03μlMET-M1-F1100uM0.08-0.12μlMET-M1-R1100uM0.08-0.12μlMET-M1-P1100uM0.04-0.06μl1#RT-TAQ0.9-1.1μl样本RNA50-500ng/μL8-10μl总体积30-40μl其中，DEPC水的0.001代表DEPC和水的体积比。检测人类MET基因外显子14缺失突变的方法，用于非疾病诊断目的，包括如下步骤：1)提取样本中的RNA；2)以步骤1)得到的RNA为模板，采用前述的引物、探针，进行RT-PCR，由FAM信号指示；体系中同时含有扩增人类MET基因的检测试剂，用于监控样本RNA有无加入和人类MET基因表达量，由HEX(VIC)信号指示；同时，PCR扩增反应系统含有UNG酶，选择性断裂含有dU的PCR片段中的尿嘧啶糖苷键，有效降低因PCR产物污染产生的假阳性；3)结果判定：阴性对照的FAM信号应无扩增曲线升起。若任意一管FAM信号有扩增曲线升起，则此次实验结果无效，建议重新检测；阳性对照的FAM和HEX(VIC)信号应有扩增曲线升起，且其Ct值一般小于30；样本HEX(VIC)信号扩增Ct值：a)若Ct值≤27，则继续分析；b)若Ct值＞27，说明RNA可能存在片段化或降解或抑制剂或漏加，但若FAM信号Ct值＜35，实验结果仍然可信，否则建议重新检测或重新提取RNA后再进行检测；5.样本FAM信号扩增Ct值：a)若Ct值＜35，则该样本含有人类基因外显子14缺失突变；b)若Ct值≥35，则该样本不含有人类基因外显子14缺失突变。本发明技术方案与
背景技术：
相比，它具有如下优点：1、本发明以NSCLCFFPE样本RNA为检测对象。在外显子13和15上设计特异性引物、在外显子13和15之间设计特异性探针、在外显子14上设计特异性的BLOCK引物，并结合一步RT-PCR方法对样本RNA中MET基因外显子14缺失突变进行检测，由FAM信号指示；体系中同时含有扩增人类MET基因的检测试剂，用于监控样本RNA有无加入和人类MET基因表达量，由HEX(VIC)信号指示。同时，本试剂盒PCR扩增反应系统含有UNG酶，可以选择性断裂含有dU的PCR片段中的尿嘧啶糖苷键，有效降低因PCR产物污染产生的假阳性。本发明所用的检测时间约为120分钟。本发明的灵敏度为：NSCLC(非小细胞肺癌)FFPE样本RNA中含有450拷贝数的METexon14skipping(跳跃缺失)装甲RNA均可准确检出。附图说明下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。图1为实施例1灵敏度的测试结果图。图2为实施例2准确性的测试结果图；图3为实施例2的阳性FFPE样本测序结果图。具体实施方式表1反应体系原料名称浓度体积(μL)DEPC水0.00122.52910*TOSbuffer(pH9.0)417#dNTP25mM0.4BSA5mg/ml0.096甲酰胺ML/瓶0.6MET-BL1100uM2MET-IC-F1100uM0.05MET-IC-R1100uM0.05MET-IC-P1100uM0.025MET-M1-F1100uM0.1MET-M1-R1100uM0.1MET-M1-P1100uM0.051#RT-TAQ1样本RNA50-500ng/μL9总体积40表2引物和探针引物探针名称序列MET-BL1ACACTTCGGGCACTTACAAGCCTATCCAAATGAGGAGTGTGTACTCTTGCATCGTAGCG-NH2MET-IC-F1CCACGGGACAACACAATACAGTACMET-IC-R1CATAGGACCGTATTTCGGCGAAMET-IC-P1VIC-5-CCTATGTGGATCCTG-3-MGBMET-M1-F1GGTTTTTCCTGTGGCTGAAAAAGAGMET-M1-R1GGCATGAACCGTTCTGAGATGAMET-M1-P1FAM-5-CAAATTAAAGATCAGTTTCC-3-MGB本试剂盒以NSCLCFFPE样本RNA为检测对象。通过设计特异性引物和探针并结合一步RT-PCR方法对样本RNA中MET基因外显子14缺失突变进行检测，由FAM信号指示；体系中同时含有扩增人类MET基因的检测试剂，用于监控样本RNA有无加入和人类MET基因表达量，由HEX(VIC)信号指示。同时，本试剂盒PCR扩增反应系统含有UNG酶，可以选择性断裂含有dU的PCR片段中的尿嘧啶糖苷键，有效降低因PCR产物污染产生的假阳性。本试剂盒含有MET反应液、MET混合酶和MET阳性对照。其中MET反应液主要成分包括引物、探针、镁离子、dNTPs、PCRbuffer；MET混合酶主要成分包括Taq酶、逆转录酶和UNG酶；阳性对照主要成分包括MET基因外显子14缺失突变和野生型质粒DNA(详见表3)。表3试剂盒组成在每次PCR反应中，每份样本和MET阳性对照(MET-PC)、阴性对照(NTC，自备纯化水)共同进行分析。1.取出MET反应液、MET混合酶和MET阳性对照。MET反应液和MET阳性对照解冻，振荡混匀，然后与MET混合酶快速离心15s待用。2.分装：根据样本、阳性对照及阴性对照所需反应管总数，按每测试中分别含30μLMET反应液和1μLMET混合酶的比例将两者混合，振荡混匀15s，快速离心15s，以每管31μL分装到8联PCR反应管中。建议每次多算一份的量混合(推荐在冰盒上操作)。3.加样：在相应8联PCR反应管中分别加入9μL待检样本RNA、9μLMET阳性对照和9μL阴性对照，盖上8联PCR反应管盖，快速离心数15s。注：1)FFPE样本RNA浓度推荐为10-500ng/μL。2)上机前请确认PCR管内总体积为40μL(31μL试剂加9μL模板)。4.将8联PCR反应管按表3推荐布局放入实时PCR仪器。打开仪器窗口，按照下列的扩增程序进行设置。第一阶段：42℃5min，95℃1个循环；第二阶段：95℃10s，50℃20s，60℃30s，10个循环第三阶段：95℃10s，50℃30s，60℃30s，36个循环信号收集：第三阶段60℃时收集FAM和HEX(VIC)信号，执行实时PCR，保存文件。【阳性判断值及检验结果的解释】1.确认未选择校正荧光参照，按管号顺序依次选择单一检测反应管进行分析，同时选择阳性对照反应管、样本反应管和阴性对照管，然后用户可根据实际情况确定扩增曲线升起的拐点处，得到各反应管的Ct值。2.阴性对照的FAM信号应无扩增曲线升起。若任意一管FAM信号有扩增曲线升起，则此次实验结果无效，建议重新检测。3.阳性对照的FAM和HEX(VIC)信号应有扩增曲线升起，且其Ct值一般小于30，但可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。4.样本HEX(VIC)信号扩增Ct值：a)若Ct值≤27，则继续分析；b)若Ct值＞27，说明RNA可能存在片段化或降解或抑制剂或漏加，但若FAM信号Ct值＜35，实验结果仍然可信，否则建议重新检测或重新提取RNA后再进行检测。5.样本FAM信号扩增Ct值：a)若Ct值＜35，则该样本含有人类基因外显子14缺失突变；b)若Ct值≥35，则该样本不含有人类基因外显子14缺失突变。实施例1灵敏度质粒、装甲RNA处理：装甲RNA制备方法：MET基因外显子14缺失突变质粒为上海生工合成。将含有目的基因质粒的菌株涂布于含有氨苄青霉素(Amp，100μg/mL)抗性的LB固体平板，37℃倒置培养16h至培养皿上长出菌落。挑取单菌落，置5mLLB液体培养基(含100μg/mLAmp)中，37℃，200rpm振摇过夜。取1.5mL过夜培养物抽提质粒，PCR检验正确后，菌液加入甘油至终浓度15％，-20±5℃保存备用。取上述菌液平板划线分离单菌落，挑取单菌落置于5mLLB液体培养基(含100μg/mLAmp)中，37℃，200rpm振摇5h，使用终浓度为1mM的ITPG诱导过夜。离心收集细菌，使用超声波处理液(5mMMgSO4，0.1MNaCl，50mMTris(pH8.0)重悬，震荡混匀后离心去除细胞碎片，加入DNaseI消化质粒DNA和细菌基因组DNA。离心取上清即得到装甲RNA原液，PCR检验正确后，2-8℃保存备用。将得到装甲RNA原液按不同浓度(50拷贝/μL、500拷贝/μL和5000拷贝/μL)进行稀释，以进行灵敏度的检测。本检测体系对不同浓度(50拷贝/μL、500拷贝/μL和5000拷贝/μL)的装甲RNA进行考察，浓度为50拷贝/μL的装甲RNA进行的两个重复检测均能稳定检出。因此，本发明对NSCLCFFPE样本RNA中含有450copies的METexon14skipping装甲RNA均可准确检出。结果见图1实施例2准确性本检测体系对经过一代测序验证的38例NSCLCFFPE阴性样本和1例NSCLCFFPE阳性样本进行考察，38例阴性FFPE样本检测结果均为阴性，1例阳性FFPE样本检测结果为阳性。阳性样本测序结果见图2和图3：因此，本发明对NSCLCFFPE样本检测的准确性好。以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。当前第1页1 2 3