本发明属于农杆菌介导植物转化技术领域，尤其涉及一种建立康乃馨农杆菌介导高效转染体系的方法。
背景技术：
康乃馨(dianthuscaryophyllus)体态玲珑、斑斓雅洁、端庄大方、芳香清幽，是美好典雅的典范。人们常将康乃馨作为送给母亲的礼物，用它来表达对母亲的爱与祝福。康乃馨随着母亲节的兴起，成为全球销量最大的花卉。康乃馨是肯尼亚的主要出口种类，也是美洲哥伦比亚最大的出口花卉品种，在亚洲的日本、韩国、马来西亚等国都有大量栽培。在欧洲，德国、匈牙利、意大利、波兰、西班牙、土耳其、英国和荷兰等国栽培的规模也很大。康乃馨为石竹科多年生草本植物，包括许多变种与杂交种，在温室里几乎可以连续不断开花。康乃馨原产地中海地区，主要分布于欧洲温带及我国福建、湖北等地，是世界应用最普遍的花卉之一。康乃馨茎秆硬脆，常单生枝端，有时2或3朵，香气浓郁，常见色彩有粉色、红色或白色。康乃馨大部分代表了爱、魅力和尊敬之情。与玫瑰不同的是，康乃馨代表的爱表现较清淡和温馨，适于亲情之爱，所以儿女多将康乃馨献给自己的母亲。
农杆菌介导的植物基因转化系统目前广泛应用于植物基因工程研究。根癌农杆菌中含ti质粒，该质粒的部分dna片段可整合到宿主细胞中，从而整合到植物的基因组中。
“根癌农杆菌法转化康乃馨的条件探索(安徽农业科学,sci.2008,36(13):5329-5330)”一文以康乃馨叶片为受体材料,.通过抗g418(一种抗生素)筛选,探讨预培养时间、根癌农杆菌菌液浓度、共培养时间等因素对根癌农杆菌介导康乃馨遗传转化的影响。这篇文献仅仅对根癌农杆菌转化康乃馨的条件进行摸索，并指出20mg/mlg418是康乃馨叶片转化的适宜浓度；随着预培养时间的增加,康乃馨叶片的存活率降低,预培养2～3d时抗性芽分化率较高；当根癌农杆菌od600为0.5～0.8时,抗性芽分化率较高,适合康乃馨转化；共培养2～3d时,康乃馨叶片生长状态好,抗性芽分化率最高；预培养、共培养各2～3d,菌液浓度od600为0.5～0.8是根癌农杆菌介导康乃馨遗传转化的适宜条件。在这篇文献中最高的芽分化率为6.7％，转化效率很低。
范惠琴等人在“发根农杆菌ri质粒转化康乃馨初步研究(上海农业学报2001,17(1):35～38)”一文中介绍了利用具有ri质粒的发根农杆菌(agrobacteriumrhizogenes)pri15834对康乃馨组培苗的带叶茎节进行转化试验。转化后的外植体在k0附加500mg/l羧苄青霉素培养基上培养2～3周后,受感染的伤口部位长出无向地性的毛状根,频率为37.07％。将毛状根切碎分别在k0、k1、k2培养基上继续培养3周,毛状根在k0上表现为无限生长,在k1上主要表现为长愈伤组织,频率为51.42％,而在k2上则主要表现为长绿苗,频率为25％。这说明发根农杆菌的ri质粒已整合到康乃馨细胞基因组中并得到表达。在该文献中，虽然首次使用的发根农杆菌ri质粒进行转化，较以往的报道的转化频率有所提高，但也只提高到转化频率为37.07％，转化率依然较低，而且采用ri质粒转化，稳定性不高。
技术实现要素：
针对现有技术康乃馨转化效率低的不足，本发明提供一种建立康乃馨农杆菌介导高效转染体系的方法，使用农杆菌介导康乃馨转化，打通康乃馨农杆菌介导高效转染体系。这是通过农杆菌转染体系培育新型康乃馨最为重要的一步。建立康乃馨农杆菌介导高效转染体系意味着能够突破康乃馨自身遗传屏障，获得难以通过传统育种方式生产的新品种。
本发明的技术方案如下：一种建立康乃馨农杆菌介导高效转染体系的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤(1)种子萌发无菌苗阶段：将康乃馨种子消毒灭菌后半嵌接种(一半置于培养基中，一半裸露在空气中)于基础培养基中培养成无菌苗；
培养条件为：22～26℃光照培养，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx，培养时间为30～90天；
所述康乃馨种子消毒杀菌过程如下：使用无菌水冲洗3～15次，在75％乙醇中浸泡20～120s，再使用无菌水清洗3～15次，在0.1～0.2％升汞中浸泡3～15min，再使用无菌水清洗种子8～15次，并放在滤纸上晾干。
所述基础培养基的成分如下：sh基础配方+琼脂8～16g·l-1+蔗糖20～60g·l-1，ph5.2～5.8，118～125℃高压灭菌20～30min；
sh基础配方成分如下：硝酸钾2.5～5.0g·l-1，硫酸镁0.195～0.4g·l-1，磷酸二氢铵0.3～0.6g·l-1，氯化钙151～300mg·l-1，甘氨酸2～4mg·l-1，肌醇100～200mg·l-1，盐酸硫胺素0.4～0.8mg·l-1，盐酸吡哆素0.5～1.0mg·l-1，烟酸0.5～1.0mg·l-1，乙二胺四乙酸铁纳19.8～40mg·l-1，六水氯化钴0.1～0.2mg·l-1，五水硫酸铜0.2～0.4mg·l-1，硼酸5～10mg·l-1，碘化钾1～2mg·l-1，一水硫酸锰10～20mg·l-1，二水钼酸钠0.1～0.2mg·l-1，七水硫酸锌1～2mg·l-1；
以下步骤中所述的sh基础配方也采用该配方。
步骤(2)无菌苗扩繁阶段：将步骤(1)中萌发长到3～10cm的无菌苗切成带有叶节的小段，不能伤害叶节，把叶节接入到基础培养基中；
所述基础培养基的成分如下：sh基础配方+琼脂8～16g·l-1+蔗糖20～60g·l-1；ph5.2～5.8，118～125℃高压灭菌20～30min。
无菌苗扩繁培养条件为：22～26℃光照培养15～20天，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx。
步骤(3)农杆菌培养阶段：将农杆菌加入到同时添加了卡那霉素和利福平的ym培养基中进行培养；
农杆菌在ym培养基中培养后离心，2000～4000r/min，4～8℃离心10～20min，弃上清，下层加入重悬液使od600值达到0.4～0.8，最后向菌液中加入as使终浓度为50～200μmol·l-1，混匀备用；
所述ym培养基成分如下：蛋白胨10-20g/l，酵母提取物5-10g/l，氯化钠10-20g/l，ym培养基可从市场购买得到；农杆菌在ym培养基中培养条件如下：26～30℃培养10～14h，有无光照不影响效果。
所述重悬液为sh基础配方+琼脂8～16g·l-1+蔗糖20～60g·l-1。
农杆菌菌液采用其他培养方法制备得到也可以。
步骤(4)侵染和共培养阶段：将步骤(2)获得的无菌苗切成2～7mm2的叶片块放入三角瓶中，向三角瓶中倒入步骤(3)获得的菌液，三角瓶口密封，抽真空侵染，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中进行暗培养得到愈伤组织；共培养基上垫有滤纸，一般为1～3层，阻碍农杆菌过度生长，也可以延长共培养时间，提高存活率。
所述共培养基成分如下：sh基础配方+tdz0.01～2.0mg·l-1+iba0.1～2.0mg·l-1+蔗糖20～60g·l-1+葡萄糖10～60g·l-1+琼脂8～16g·l-1+as50～200μmol·l-1；共培养基ph5.2～5.8，118～125℃灭菌20-30min；
侵染时间过短，农杆菌与康乃馨组织接触时间短，侵染效果不好，导致转换率低；侵染时间过长，造成康乃馨叶受损、被侵染细胞死亡以及农杆菌抑制不住等问题，作为优选，本发明侵染条件如下：真空度为0.4～1.0kpa，侵染时间为15～36h。
共培养条件为：暗培养，温度22～26℃，培养时间为3～7天。
步骤(5)筛选阶段：将步骤(4)获得的愈伤组织转接到筛选培养基中进行两次筛选，培养得到幼芽；
所述两次筛选操作如下：将步骤(4)获得的愈伤组织转接到筛选培养基中进行第一次筛选，培养15～20天后，更换筛选培养基，进行第二次筛选，培养25～30天得到幼芽；
所述筛选培养基成分如下：sh培养基配方+tdz0.01～2.0mg·l-1+iba0.1～2.0mg·l-1+蔗糖20～60g·l-1+琼脂8～16g·l-1+羧苄青霉素250～750mg·l-1+潮霉素20～100mg·l-1，ph5.2～5.8。虽然现有技术中，筛选培养基中均加入潮霉素，但是不同的植物筛选时浓度不同。
第一次筛选培养条件如下：22～26℃光照培养，光照强度为1500～2500lx，每天光照时间12～14h；
第二次筛选培养条件如下：将第一次筛选后的组织转移到新的培养基中，22～26℃光照培养，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx。
步骤(6)生根阶段：将步骤(5)中获得的幼芽转接到生根培养基培养，得到抗性苗；
所述生根培养基成分如下：sh基础配方+naa0.2～1.6mg·l-1+蔗糖20～60g·l-1+琼脂8～16g·l-1，ph5.2～5.8。
培养条件如下：22～28℃光照培养7～8周，光照强度为1500～2500lx，光照时间为12～14h/天。
步骤(7)阳性检测阶段：取步骤(6)获得的抗性苗的叶片，提取dna，进行pcr扩增，将pcr产物进行凝胶电泳，得到农杆菌成功侵染康乃馨的阳性苗，建立康乃馨农杆菌介导高效转染体系。
本发明提供的农杆菌介导高效转染体系适合对康乃馨进行转基因功能验证、康乃馨突变体的获得、康乃馨转基因育种。
现有技术中认为康乃馨叶片对农杆菌的耐受力较差，侵染时间不能超过10min，并且共培养时间超过三天后，叶片生长状态较差，存活率降低，其抗性芽分化率降低，本发明克服了现有技术对农杆菌介导康乃馨的认知，通过研究探索农杆菌转化时所涉及到的各项影响条件。
本发明通过探索农杆菌侵染康乃馨，在抽真空(0.4～1.0kpa)条件下农杆菌侵染15～36h，虽然康乃馨叶片在侵染过程中会部分受到损害，侵染时间大幅度延长提高了侵染效果，单片叶片中存活的康乃馨细胞趋近于全部侵染，侵染的康乃馨细胞在筛选中比较容易存活，抗性芽分化率比较高，进而大大提高转化率。在共培养中，培养基中加入所述浓度的iba和tdz比较适宜促进侵染后的康乃馨叶片生长、分化，同时有些受损害的康乃馨叶片在共培养过程中得到修复，基本都能形成愈伤组织。虽然本发明采用的植物激素已知，但不同的植物对植物激素敏感度不一样，采用不同的植物激素，植物组织培养结果并不可预料，而且植物激素浓度不同，结果也千差万别。共培养过程中若采用其他植物激素(比如naa、kt等)，侵染后的康乃馨几乎不能形成愈伤组织。
另外，筛选过程也很重要；虽然现有技术中筛选培养基中一般都会有潮霉素，但是不同植物来讲，潮霉素的加入量不同，而且除了加入潮霉素外，还需要根据特定的植物品种，加入特定的激素。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明通过研究农杆菌转化时所涉及到的各项影响条件，包括菌液浓度、侵染时间、侵染条件、共培养时间、抑菌激素浓度等，提供了一套适合康乃馨的农杆菌介导转化体系，提供转化率，同时，本发明提供的转化、培养方法几乎无白化苗和玻璃苗。
附图说明
图1为康乃馨雪舞转化阳性苗pcr扩增后的凝胶电泳图；
图2为康乃馨白雪公主转化阳性苗pcr扩增后的凝胶电泳图；
图3为康乃馨红色恋人转化阳性苗pcr扩增后的凝胶电泳图；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。以下实施例培养基中的溶剂均为蒸馏水。
中英文对照
sh：sh培养基；
tdz：thidiazuron(即：噻苯隆)
naa：a-萘乙酸
as：乙酰丁香酮；
iba：吲哚丁酸；
kt：激动素；
实施例1：“雪舞”康乃馨的诱导愈伤及农杆菌介导高效转染
步骤1种子萌发无菌苗阶段：将种子置于无菌水中冲洗3次，倒去无菌水，加入75％乙醇，摇晃30s，倒出乙醇，无菌水清洗3次，倒出无菌水，加入0.1％升汞，浸泡5min，倒出升汞并回收，无菌水清洗种子8次，把种子放在滤纸上吹干。将种子一半接触空气，半嵌接种于基础培养基sh+琼脂8g·l-1+蔗糖20g·l-1，ph5.8，121℃高压灭菌20min。22-24℃光照培养，每天光照12h，光照强度1800-2000lx；
sh基础配方为：硝酸钾2.5g·l-1，硫酸镁0.195g·l-1，磷酸二氢铵0.3g·l-1，氯化钙151mg·l-1，甘氨酸2mg·l-1，肌醇100mg·l-1，盐酸硫胺素0.4mg·l-1，盐酸吡哆素0.5mg·l-1，烟酸0.5mg·l-1，乙二胺四乙酸铁纳19.8mg·l-1，六水氯化钴0.1mg·l-1，五水硫酸铜0.2mg·l-1，硼酸5mg·l-1，碘化钾1mg·l-1，一水硫酸锰10mg·l-1，二水钼酸钠0.1mg·l-1，七水硫酸锌1mg·l-1；
步2无菌苗扩繁阶段：30天后，将步骤1中萌发长到3cm左右的无菌苗叶片切成带有叶节的小段，不能伤害叶节，把叶节接入到基础培养基中，25℃光照培养。
步骤3农杆菌准备阶段：将导入植物双元载体pcambia1300的农杆菌加入到同时添加了卡那霉素和利福平抗生素的ym培养基中，摇床培养的转速200r/min，28℃培养过夜，之后把菌液放入离心机，4000r/min，4℃离心10min，倒掉上清液，加入重悬液使od600值达到0.4-0.8；重悬液为sh基础配方，ph5.2，118℃高温灭菌20min。最后向菌液中加入as，终浓度为100μmol·l-1，混匀备用；
sh基础配方成分如下：硝酸钾3.0g·l-1，硫酸镁0.3g·l-1，磷酸二氢铵0.4g·l-1，氯化钙200mg·l-1，甘氨酸3mg·l-1，肌醇150mg·l-1，盐酸硫胺素0.6mg·l-1，盐酸吡哆素0.5～1.0mg·l-1，烟酸0.75mg·l-1，乙二胺四乙酸铁纳25mg·l-1，六水氯化钴0.15mg·l-1，五水硫酸铜0.25mg·l-1，硼酸7mg·l-1，碘化钾1.5mg·l-1，一水硫酸锰15mg·l-1，二水钼酸钠0.15mg·l-1，七水硫酸锌1.5mg·l-1，以下步骤也采用该配方；
步骤4侵染和共培养阶段：在基础培养基中培养15-16天后，将步骤2中获得的无菌苗切成2～4mm2左右的叶片块，放入100ml三角瓶中约600～700块叶片块，向三角瓶中倒入适量步骤3获得的菌液，套上封口膜并用橡筋勒紧，抽真空到0.4～0.6kpa，保持16～18h，倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基(sh基础配方+tdz0.04mg·l-1+iba0.1mg·l-1+蔗糖20g·l-1+葡萄糖10g·l-1+琼脂8g·l-1+as100μmol·l-1，ph5.2，118℃灭菌20min)(共培养基上垫2层滤纸)，23～25℃暗培养7天。
步骤5筛选阶段：将步骤4中获得的愈伤组织转接到筛选培养基(sh基础配方+tdz0.04mg·l-1+iba0.1mg·l-1+蔗糖30g·l-1+琼脂8g·l-1+羧苄青霉素300mg·l-1+潮霉素40mg·l-1，ph5.8)，22～26℃光照培养，每天光照12～14h，光照强度1500～1800lx。培养15天后，更换筛选培养基，进行二次筛选，同样的条件下培养30天；
步骤6生根阶段：将步骤5中获得的幼芽转接到生根培养基(sh基础配方+naa0.3mg·l-1+蔗糖20g·l-1+琼脂8g·l-1，ph5.2～5.4)，
培养条件如下：25℃光照培养8周，光照强度为2000～2100lx，光照时间为12h/天。
步骤7阳性检测阶段：将步骤6获得的抗性苗取叶片，提取dna，进行pcr扩增，将pcr产物进行凝胶电泳，确定是否存在阳性条带，确定阳性苗。
pcr扩增条件：
其中2c-3c-4c循环30次。
电泳条件：电压100v，电流100ma
本发明检测的抗性植株对于潮霉素具有一定的抗性，证明导入的潮霉素抗性基因已经表达。
参考图1，9号，26号，43号泳道为标记dna；51号泳道是阴性对照，50号泳道是潮霉素基因pcr阳性对照；1号,2号,3号,5号,6号,10号,11号,12号,13号,14号,15号,16号,20号,21号,22号,23号,24号,25号,27号,28号,30号,32号,33号,34号,35号,36号,37号,39号,40号,41号,42号,45号,46号,47号,48号,49号，共计36个泳道获得与阳性对照相同的电泳条带，证明为阳性植株。
筛选之后分化所得的阳性苗经过如上验证，证实了本发明中通过农杆菌遗传介导的方法能将外源基因引入康乃馨基因组。
实施例1中，愈伤组织形成率98.7％，长绿苗的频率为98.1％，生根率99.8％，转化率78.3％，如表1、表2和表3所示。
表1
表2
表3
实施例2：“白雪公主”康乃馨的诱导愈伤及农杆菌介导高效转染
步骤1种子萌发无菌苗阶段：将种子置于无菌水中冲洗3次，倒去无菌水，加入75％乙醇，摇晃30s，倒出乙醇，无菌水清洗3次，倒出无菌水，加入0.1％升汞，浸泡5min，倒出升汞并回收，无菌水清洗种子8次，把种子放在滤纸上吹干。将种子一半接触空气，半嵌接种于基础培养基sh+琼脂10g·l-1+蔗糖40g·l-1，ph5.6，125℃高压灭菌30min。24-26℃光照培养，每天光照12h，光照强度2200-2400lx；
sh基础配方成分如下：硝酸钾3.5g·l-1，硫酸镁0.29g·l-1，磷酸二氢铵0.46g·l-1，氯化钙180mg·l-1，甘氨酸2.5mg·l-1，肌醇160mg·l-1，盐酸硫胺素0.5mg·l-1，盐酸吡哆素0.8mg·l-1，烟酸0.7mg·l-1，乙二胺四乙酸铁纳26mg·l-1，六水氯化钴0.16mg·l-1，五水硫酸铜0.24mg·l-1，硼酸8mg·l-1，碘化钾1.6mg·l-1，一水硫酸锰16mg·l-1，二水钼酸钠0.18mg·l-1，七水硫酸锌1.4mg·l-1。
步骤2无菌苗扩繁阶段：30天后，将步骤1中萌发长到3cm左右的无菌苗叶片切成带有叶节的小段，不能伤害叶节，把叶节接入到基础培养基(同步骤1)中，25℃光照培养。
步骤3农杆菌准备阶段：将导入植物双元载体pcambia1300的农杆菌加入到同时添加了卡那霉素和利福平抗生素的ym培养基中，摇床培养的转速200r/min，28℃培养过夜，之后把菌液放入离心机，4000r/min，4℃离心10min，倒掉上清液，加入重悬液使od600值达到0.4-0.8；重悬液为sh基础配方，ph5.2，118℃高温灭菌20min。最后向菌液中加入终浓度100μmol·l-1as，混匀备用；
sh基础配方为：硝酸钾5.0g·l-1，硫酸镁0.4g·l-1，磷酸二氢铵0.6g·l-1，氯化钙151～300mg·l-1，甘氨酸4mg·l-1，肌醇200mg·l-1，盐酸硫胺素0.8mg·l-1，盐酸吡哆素1.0mg·l-1，烟酸1.0mg·l-1，乙二胺四乙酸铁纳40mg·l-1，六水氯化钴0.2mg·l-1，五水硫酸铜0.4mg·l-1，硼酸10mg·l-1，碘化钾2mg·l-1，一水硫酸锰20mg·l-1，二水钼酸钠0.2mg·l-1，七水硫酸锌2mg·l-1。
步骤4侵染和共培养阶段：在基础培养基中培养15-20天后，将步骤2中获得的无菌苗切成2～7mm2左右的叶片块，放入100ml三角瓶中约600～800块叶片块，向三角瓶中倒入适量步骤3获得的菌液，套上封口膜并用橡筋勒紧，抽真空到0.4～1.0kpa，保持15～36h，倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基(sh基础配方(与步骤3相同)+tdz0.5mg·l-1+iba0.6mg·l-1+蔗糖40g·l-1+葡萄糖35g·l-1+琼脂10g·l-1+as120μmol·l-1，ph5.2～5.4，120～121℃灭菌25min)(共培养基上垫2层滤纸)，暗培养，温度22～26℃，3～7天。
步骤5筛选阶段：在共培养基中暗培养6天后，将步骤4中获得的愈伤组织转接到筛选培养基(sh基础配方(与步骤3相同)+tdz0.5mg·l-1+iba0.6mg·l-1+蔗糖40g·l-1+琼脂10g·l-1+羧苄青霉素350mg·l-1+潮霉素20mg·l-1，ph5.2～5.4)，25～26℃光照培养，每天光照12～13h，光照强度1900～2100lx。筛选16天后，更换筛选培养基，进行二次筛选；
步骤6生根阶段：二次筛选培养25天后，将步骤5中获得的幼芽转接到生根培养基(sh基础配方+naa0.5mg·l-1+蔗糖40g·l-1+琼脂10g·l-1，ph5.5)；
培养条件如下：22～28℃光照培养7周，光照强度为2400lx，光照时间为13h/天。
步骤7阳性检测阶段：将步骤6获得的抗性苗取叶片，提取dna，进行pcr扩增，将pcr产物进行凝胶电泳，确定是否存在阳性条带，确定阳性苗。
pcr扩增条件：
其中2c-3c-4c循环30次。
电泳条件：电压100v，电流100ma
本发明检测的抗性植株对于潮霉素具有一定的抗性，证明导入的潮霉素抗性基因已经表达。
参考图2，9号，26号，43号泳道为标记dna；51号泳道是阴性对照，50号泳道是潮霉素基因pcr阳性对照；1号，2号，3号，5号，6号，7号，10号，12号，13号，15号，16号，20号，21号，22号，23号，24号，25号，27号，28号，30号，31号，33号，35号，36号，37号，38号，39号，39号，41号，42号，45号，46号，48号，49号，共计34获得与阳性对照相同的电泳条带，证明为阳性植株。
筛选之后分化所得的阳性苗经过如上验证，证实了本发明中通过农杆菌遗传介导的方法能将外源基因引入康乃馨基因组。
实施例2中，愈伤组织形成率98.4％，长绿苗的频率为98.3％，生根率98.7％，转化率73.9％，如表4、表5和表6所示。
表4
表5
表6
实施例3：“红色恋人”康乃馨的诱导愈伤及农杆菌介导高效转染
步骤1种子萌发无菌苗阶段：将种子置于无菌水中冲洗3次，倒去无菌水，加入75％乙醇，摇晃30s，倒出乙醇，无菌水清洗3次，倒出无菌水，加入0.1％升汞，浸泡5min，倒出升汞并回收，无菌水清洗种子8次，把种子放在滤纸上吹干。将种子一半接触空气，半嵌接种于基础培养基(sh基础配方+琼脂12g·l-1+蔗糖50g·l-1，ph5.6，125℃高压灭菌20min。)22-26℃光照培养，每天光照12h，光照强度2500lx；
sh基础配方成分如下：硝酸钾2.5g·l-1，硫酸镁0.2g·l-1，磷酸二氢铵0.3g·l-1，氯化钙160mg·l-1，甘氨酸2mg·l-1，肌醇100mg·l-1，盐酸硫胺素0.4mg·l-1，盐酸吡哆素0.5mg·l-1，烟酸0.5mg·l-1，乙二胺四乙酸铁纳20mg·l-1，六水氯化钴0.1mg·l-1，五水硫酸铜0.2mg·l-1，硼酸5mg·l-1，碘化钾1mg·l-1，一水硫酸锰10mg·l-1，二水钼酸钠0.1mg·l-1，七水硫酸锌1mg·l-1；
步骤2无菌苗扩繁阶段：30天后，将步骤1中萌发长到3cm左右的无菌苗叶片切成带有叶节的小段，不能伤害叶节，把叶节接入到基础培养基(同步骤1)中，25℃光照培养。
步骤3农杆菌准备阶段：将导入植物双元载体pcambia1300的农杆菌加入到同时添加了卡那霉素和利福平抗生素的ym培养基中，摇床培养的转速200r/min，28℃培养过夜，之后把菌液放入离心机，4000r/min，4℃离心10min，倒掉上清液，加入重悬液使od值达到0.4-0.8；重悬液为sh基础配方，ph5.2，118℃高温灭菌20min。最后向菌液中加入终浓度120μmol·l-1as，混匀备用；
sh基础配方成分如下：硝酸钾3.0g·l-1，硫酸镁0.24g·l-1，磷酸二氢铵0.4g·l-1，氯化钙200mg·l-1，甘氨酸2mg·l-1，肌醇120mg·l-1，盐酸硫胺素0.5mg·l-1，盐酸吡哆素0.6mg·l-1，烟酸0.7mg·l-1，乙二胺四乙酸铁纳22mg·l-1，六水氯化钴0.13mg·l-1，五水硫酸铜0.24mg·l-1，硼酸6mg·l-1，碘化钾2mg·l-1，一水硫酸锰11mg·l-1，二水钼酸钠0.12mg·l-1，七水硫酸锌1.2mg·l-1；
步骤4侵染和共培养阶段：在基础培养基中培养15-20天后，将步骤2中获得的无菌苗切成2～7mm2左右的叶片块，放入100ml三角瓶中约600～800块叶片块，向三角瓶中倒入适量步骤3获得的菌液，套上封口膜并用橡筋勒紧，抽真空到0.4～1.0kpa，保持15～36h，倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基(sh基础配方+tdz1.2mg·l-1+iba1.5mg·l-1+蔗糖50g·l-1+葡萄糖20g·l-1+琼脂12g·l-1+as80μmol·l-1，ph5.5，121～124℃灭菌25min)(共培养基上垫2层滤纸)，22～26℃暗培养。
步骤5筛选阶段：在共培养基中暗培养7天后，将步骤4中获得的愈伤组织转接到筛选培养基(sh基础配方+tdz1.2mg·l-1+iba1.5mg·l-1+蔗糖50g·l-1+琼脂12g·l-1+羧苄青霉素400mg·l-1+潮霉素50mg·l-1，ph5.2～5.4)，25～26℃光照培养，每天光照13～14h，光照强度1900～2000lx。筛选15～20天后，更换筛选培养基，进行二次筛选；
步骤6生根阶段：二次筛选培养20天后，将步骤5中获得的幼芽转接到生根培养基(sh基础配方+naa0.8mg·l-1+蔗糖50g·l-1+琼脂12g·l-1，ph5.6～5.8)，
培养条件如下：25～28℃光照培养，光照强度为2300～2400lx，光照时间为14h/天。
步骤7阳性检测阶段：在生根培养基培养约8周后，将步骤6获得的抗性苗取叶片，提取dna，进行pcr扩增，将pcr产物进行凝胶电泳，确定是否存在阳性条带，确定阳性苗。
pcr扩增条件：
其中2c-3c-4c循环30次。
电泳条件：电压100v，电流100ma。
本发明检测的抗性植株对于潮霉素具有一定的抗性，证明导入的潮霉素抗性基因已经表达。
参考图3，9号，26号，43号泳道为标记dna；51号泳道是阴性对照，50号泳道是潮霉素基因pcr阳性对照；1号，2号，4号，5号，6号，7号，10号，12号，14号，15号，16号，17号，19号，20号，21号，24号，25号，28号，29号，30号，31号，32号，36号，37号，39号，40号，41号，42号，44号，46号，47号，48号，49号，共计33道获得与阳性对照相同的电泳条带，证明为阳性植株。
筛选之后分化所得的阳性苗经过如上验证，证实了本发明中通过农杆菌遗传介导的方法能将外源基因引入康乃馨基因组。
实施例3中，愈伤组织形成率99.1％，长绿苗的频率为98.7％，生根率99.2％，转化率71.7％，如表7、表8和表9所示。
表7
表8
表9
采用此方法进行三种康乃馨的诱导愈伤及农杆菌介导的高效转染，可以使康乃馨快速获得目的性状，而且可以突破康乃馨自身遗传屏障，获得难以通过传统育种方式生产的新品种。以根癌农杆菌为介导转化康乃馨的花瓣、叶片，已有成功的报道，但由于转化难度高，转化效率低，很难获得正常生长的转基因植株。同时，康乃馨品种繁多，遗传背景复杂，很难获得一种适合大部分康乃馨农杆菌介导的高效转染体系。我们对三个品种的康乃馨进行测试，都获得了较高的转化频率。因此，我们的康乃馨农杆菌介导的高效转染体系可能使用于大部分康乃馨品种。