一种耐热能力优良的巴氏醋酸杆菌及用途的制作方法

本发明属于微生物及发酵工业领域，具体涉及‎一种耐热能力优良的巴氏醋酸杆菌Acetobacer pasteurianus DY4及用途。

背景技术：

醋酸菌（AAB）是专性好氧的革兰氏阴性细菌，具有将乙醇氧化醋酸的能力Deppenmeier et al. 2010)。AAB通常从自然栖息地和醋醅中分离 (Wu et al. 2010)。在发酵过程中，醋酸菌会受到各种各样的应激，如高温。AAB的最适生长温度为25-

30℃，虽然醋酸菌也能在37-40℃生长（Gullo et al.2008），但生长缓慢。醋酸菌发酵过程中积累的发酵热必然使发酵温度高于37℃，导致细胞生长缓慢、醋酸产量低（Adachi et al.2003），这种情况在夏季会变得更加严重。

近年来果醋受到了市场的欢迎，如苹果醋，葡萄醋，杨梅醋，柿醋，梨醋等。夏季，温度较高，常用醋酸菌AS1.41，沪酿1.01等难以耐受高温，醋酸产量不高，制作以上果醋需要较高的冷却成本，同时加之水果价格较高，使得最终成品果醋价格太贵。为提高高温条件下的醋酸发酵水平，醋酸菌耐热功能的改进已成为研究热点，如申请号为CN201310549668、“耐高温醋酸菌及其发酵生产醋酸的应用”的中国专利，该专利中的醋酸菌能在45℃生长（耐高温）），在37℃和7%乙醇条件的乙醇-乙酸转化率为88.8%，在37℃和苹果酒（7%乙醇）条件的乙醇-乙酸转化率为93%，目前还没有报道耐高温性能更加优越的醋酸菌种。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足， 提供‎一种耐热能力优良的巴氏醋酸杆菌Acetobacer pasteurianus DY4，并利用该菌在夏季进行西瓜醋酿制，本菌种能有效降低冷却成本，而且获得的西瓜醋风味优良。

为了实现本发明的目的，本发明人通过大量试验研究和不懈的探索，最终获得了如下技术方案：

本发明从醋醅中分离一株醋酸菌DY4，经过分类鉴定，确定为巴氏醋酸杆菌Acetobacer pasteurianus DY4，菌种保藏地点为中国典型培养物保藏中心（中国武汉 武汉大学），保藏号为：CCTCC NO:M 2015462,保藏日期为2015年7月23日。

本发明对Acetobacer pasteurianus DY4做了形态学、生理生化特征、同源性和发酵特征进行了研究，具体结果如下：

形态学特征：菌落形态为边缘整齐，表面光滑，乳白色，凸起的圆形菌落（图1）；个体形态为长杆状，呈单，对或链状排列（图2）。

生理生化特征：菌株DY4在1%醋酸条件下，可形成对醋酸的过氧化（表1）。

同源性特征：用PCR技术，扩增16SrDNA，DY4的16SrDNA序列与Genbank中巴氏醋酸杆菌MSU10相似度最高，达到99.98%。综合形态学、生理生化、同源性，将菌株归类为Acetobacer pasteurianus （图3）。

发酵特征： Acetobacer pasteurianus DY4在4%乙醇条件下，可在30-40℃具有较稳定的生长和产酸量（乙醇-乙酸转化率均> 90.6%），最适发酵温度为37℃，37℃达最大转化率（97.5%，即40.2g/L乙酸）；在43℃高温时OD₆₀₀可达0.72，产酸可达16.5g/L（最大转化率为40.0%）（图4、5）。

与现有技术相比，本发明的优点为：本发明的巴氏醋酸杆菌Acetobacer pasteurianus DY4对温度的耐受范围广，适于在环境温度较高条件下（例如夏季）酿造醋酸，在夏季酿造果醋方面有很大的应用前景。与常用AS1.41相比，冷却耗电量降低；用DY4酿制西瓜醋，获得了优良的西瓜醋产品，其色泽橙黄清亮，其果香及酸味较浓，其口感爽甜舒适，体态丰满。

附图说明

图1为 Acetobacer pasteurianus DY4 耐高温平板培养基透明圈(43℃)及菌落形态特征图。

图2为Acetobacer pasteurianus DY4在 高倍镜（40 x 10）下菌种形态图。

图3为Acetobacer pasteurianus DY4进化树。

图4为不同温度下Acetobacer pasteurianus DY4的生长情况。

图5为不同温度下Acetobacer pasteurianus DY4的产酸量。

具体实施方式

实施例1 耐高温高醇醋酸菌的初步分离纯化

为能清楚说明本发明方案的技术特点，下面结合具体实施例，对本发明进行阐述。但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

醋酸菌分离源的选择：

（1）醋醅来自丹阳醋厂；

（2）耐高温高醇醋酸菌的初步分离纯化

①醋酸菌的富集培养：

传统固态发酵工艺的醋厂(多个)醋醅1g，加入100mL水中，30℃下培养5-8天，取得自然发酵液5mL，装入含有100mL富集培养基的三角瓶中，30℃,180r/min培养2天，即可得到醋酸菌富集培养液。

富集培养基组成： 2%葡萄糖，2%酵母粉，0.01% MgSO₄，余下为蒸馏水；

②醋酸菌的定性实验：

取含有醋酸菌的富集培养液20mL以10000r/min的速度离心3min，离心除去醋酸菌发酵液中的菌体,取上清液5mL以2.5mol/L NaOH溶液中和至PH 7.0, 煮沸，加入质量浓度5%的氯化铁溶液4-6滴，如出现红褐色沉淀则菌种确实产生了醋酸；

③耐高温醋酸菌筛选:

取含有醋酸菌的富集培养液1mL，用生理盐水依次稀释到10^-6，分别取200μL 10^-5和10^-6的稀释液涂布于碳酸钙平板上，在43℃条件下培养至菌落产生透明圈，挑选透明圈最大的单个菌落，命名为DY4（图1）。

④醋酸菌的显微形态观察（图2）。

实施例2 醋酸菌DY4的鉴定

（1）根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版对菌株进行形态学，生理生化进行了鉴定（表1）。

表1 DY4与AS1.41的生理生化特征

（2）醋酸菌16Sr DNA鉴定

挑取醋酸菌接种于 10mL/100mL 三角瓶液体培养基中，30℃、180r/min 恒温振荡培养箱中振荡培养24h。取2mL菌液于离心管中，12000r/min 离心 2min，去上清液，按照上海生工生物工程技术服务有限公司的 SK1201-ΜNIQ-10 柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒说明书提取菌株的基因组DNA，作为模板。选择通用引物进行16S rDNA扩增实验：

引物1序列 7f（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'），

引物2序列 1540r（5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）。

PCR扩增体系：Template基因组1μL，Primer μp (10μM) 0.5 μL，Primer down (10 μM) 0.5 μL，dNTP mix (10Mm each) 0.5 μL，10 x Taq reaction Bμffer 2.5 μL，Taq (5μ/μL) 0.2 μL，H₂O 24.8 μL。

PCR扩增程序：预变性的条件为94℃ 5min；变性的条件为94℃ 30s，退火的条件为55℃ 30s，延伸的条件为72℃ 1min，从变性到延伸30个循环；72℃延伸8min，保温5min；降至16℃取出PCR产物，使用1% 琼脂糖进行凝胶电泳，EB染色后，由凝胶成像系统检测。

（3）扩增产物测序和序列分析

16S rDNA 扩增产物经纯度检测后，委托上海生工基因测序中心进行测序。测得的序列与NCBI 数据库中已知序列进行比对及相似性分析。

（4） 醋酸菌鉴定结果:

与NCBI 数据库中已报道的16S rDNA 序列进行比对。醋酸菌DY4和Acetobacter pasteμ rianμ s MSU10 进化位置最接近，所以菌株DY4为Acetobacter pasteμ rianμ s （图3）。

实施例3 DY4醋酸菌耐高温实验

取对数期Acetobacter pasteμ rianμ s DY4、 AS1.41菌液4mL加入到含有96mL液体培养基(2%葡萄糖，2%酵母粉，0.01% MgSO₄，4%无水乙醇)的500mL锥形瓶中，分别在30℃, 33℃，35℃, 37℃,40℃，41℃，42℃,43℃,44℃的条件小摇培，摇床转速180r/min，每天测量菌种的生长量OD₆₀₀值及产酸量，直到生长量OD₆₀₀值及产酸量达到稳定为止，绘图，比较最终生长量和产酸量，得出菌种耐受的极限温度（图4、图5）。

结论：菌DY4可在30-40℃具有较稳定的生长和产酸量（乙醇-乙酸转化率均> 90.6%），最适发酵温度为37℃，37℃达最大转化率（97.5%，即40.2g/L乙酸）；在43℃高温时OD₆₀₀可达0.72，产酸可达16.5g/L（最大转化率为40.0%）（图4、5）。AS1.41最适发酵温度为33℃,超过35℃时的转化率＜90%,40℃以后的生长和产酸急剧下降，41℃时的转化率仅有0.6%，当温度超过41℃即停止产酸（图4、5）。

实施例4 利用醋酸菌DY4制备西瓜醋

（1）原料预处理：选择无腐烂变质，颜色自然，瓜皮有弹性，敲击有清脆响声，成熟的西瓜，并用清水洗净上面的泥土和杂质备用；

（2）制备西瓜汁：切开洗净的西瓜，用勺子舀出西瓜瓤，用榨汁机榨出西瓜汁并用六层纱布过滤，滤出的西瓜汁倒入瓷缸或铝锅内，加热至70℃，保持20分钟，待西瓜汁冷却澄清后，用吸管吸出上层澄清液，放入经过消毒杀菌的瓷缸或瓷坛内。先用手持糖度计测定西瓜汁中的含糖量，加入纯净白糖将瓜汁含糖量调整到20%；

（3）酿酒酵母和产酯酵母种子液的制备：取斜面保藏的酿酒酵母CICC1027接种至500mL西瓜汁中，28℃培养22h，得到酿酒酵母种子液；

取斜面保藏的异常汉逊酵母CICC1650接种至500mL西瓜汁中，26℃培养22h，得到产酯酵母种子液；

（4）酒精发酵：以3%（v/v）的接种量将酿酒酵母种子液和以1.5%（v/v）的接种量将异常汉逊酵母种子液接入步骤（2）中含糖量20% 的西瓜汁中，为防止酸败，每100公斤西瓜汁加入硫酸钠10g，调配好的西瓜汁充分搅拌均匀后，密闭发酵，26℃发酵，每天测西瓜酒的酒精含量，待酒精含量达到8%（v/v）时，停止酒精发酵；

（5）醋酸发酵：取斜面保藏的醋酸菌DY4接种至500mL西瓜汁中，28℃ 培养22h，得到醋酸菌DY4种子液按6% 的接种量将醋酸菌DY4种子液加入到含8% 酒精的西瓜酒中，37℃发酵15d；

（6）西瓜醋的制备：对发酵好的发酵液离心，过滤，灭菌，包装，即可得到西瓜醋。

结论：8% 酒精，37℃的乙醇-乙酸转化率达95.6%。

实施例5 利用醋酸菌AS1.41制备西瓜醋

与实施例4相同，除了用AS1.41替代DY4。结论：8% 酒精，37℃的乙醇-乙酸转化率达62.5%。

实施例4、5所得产品的品质评价见表2。

表2 DY4与AS1.41酿造西瓜醋的比较

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