提高植物耐盐能力的GmSLT蛋白及核酸和应用的制作方法

本发明属于植物学
技术领域：
，具体涉及一种提高植物耐盐能力的GmSLT蛋白及核酸和应用。
背景技术：
：盐渍是造成农作物减产、耕作面积减少的主要原因之一。因此，提高作物的耐盐能力，将对我国农业经济可持续性发展做出积极贡献。而解决这个问题重要方法就是通过生物技术培育出优良的耐盐新品种，其中不可或缺的是利用植物的耐盐基因资源。植物在应对逆境胁迫时,从时间、空间上构成了严密的结构，基因表达的转录水平、转录后水平以及蛋白质水平等调控手段构成了协调复杂的网络。这些基因并非孤立地在盐胁迫应答中起作用,而是通过信号网络的整合作用,协调一致地发挥作用,使植物在盐渍胁迫下,保持细胞和整个植物体内的离子平衡；保持细胞与环境及细胞间的水分和渗透平衡；维护蛋白质、核酸生物大分子的结构和生物学功能；保持生理代谢、能量代谢平衡。研究表明，植物的耐盐性是一个受多基因控制的数量性状，十分复杂。植物通过植株整体生理、代谢的调节、基因表达等的调控抵御不利的盐渍环境。有报道称，当一些钠/氢阳离子转运体、转录因子、渗透物质合成物等的基因被转入植物，并过量表达后，这些转基因植物的耐盐能力都有了不同程度的提高。说明相关基因在植物耐盐性方面起着关键的作用。为此，有必要研究与植物耐盐密切相关的基因转入植物，以期望提高植物的耐盐能力。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高植物耐盐能力的GmSLT蛋白及核酸和应用。本发明的基因能够用于改良植物，提高其耐盐能力。第一方面，本发明涉及一种提高植物耐盐能力的GmSLT蛋白，所述蛋白包含如下氨基酸序列中的一种或多种：如SEQIDNO.3所示的结构域ABS序列，如SEQIDNO.4所示的TM序列，以及如SEQIDNO.5所示的ZBS序列。优选地，所述蛋白包含如SEQIDNO:2所示氨基酸序列。优选地，所述蛋白的序列如SEQIDNO:2所示。第二方面，本发明涉及一种编码前述GmSLT蛋白的核酸序列。优选地，所述核酸序列如SEQIDNO:1所示。第三方面，本发明还涉及一种前述核酸序列在增强植物耐盐能力中的应用。第四方面，本发明涉及一种含有前述核酸序列的重组表达载体。第五方面，本发明涉及一种含有前述核酸序列的转基因细胞系。第五方面，本发明涉及一种含有前述核酸序列的重组菌株。第七方面，本发明还涉及一种提高植物耐盐能力的方法，包括如下步骤：将权前述的核酸序列导入植物中，培育，获得耐盐能力的转基因植物。优选地，所述植物为单子叶植物、双子叶植物、或裸子植物。优选地，所述植物为农作物、花卉植物、或林业植物。优选地，所述植物为大豆、水稻、拟南芥、小麦、玉米、棉花、油菜、高粱、或马铃薯。第八方面，本发明还涉及一种培育耐盐植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：将前述方法获得的转基因植物与目标植物杂交，进而获得耐盐植物以及杂交后代。第九方面，本发明还涉及一种提高植物耐盐能力结构域序列，，所述结构域序列为如SEQIDNO.3所示的结构域ABS序列，如SEQIDNO.4所示的TM序列，或者如SEQIDNO.5所示的ZBS序列。本发明具有如下的有益效果：本发明通过生物信息学及基因时空表达分析，获得了一种耐盐基因，命名为GmSLT；将该基因转化酵母，可以明显提高酵母的耐盐能力；转化拟南芥和水稻，也能够增强相应植物的耐盐性；本发明的基因能够用于改良植物，提高其耐盐能力。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1：GmSLT功能结构域示意图；图2：GmSLT表达对酵母W303-1a耐盐性点滴试验；图3：在盐胁迫条件下过表达GmSLT具有酵母基因与野生型酵母对比；图4：GmSLT基因关键结构域在耐盐中的作用；图5：转GmSLT水稻To代幼苗GmSLT基因检测；其中WT为亲本，NTC1、NTC2为空白对照，P1，P2为阳性对照；图6：部分转GmSLT基因水稻植株GmSLT基因的表达检测；图7：转GmSLT基因水稻的1#株系T1代幼苗耐盐试验结果图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。本发明实施例中所用的材料、试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于):双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：水稻、拟南芥、小麦、玉米、大豆、棉花、马铃薯、油菜等。实施例1、大豆候选基因的克隆通过生物信息学分析，预测得到一些大豆耐盐候选基因。大豆合丰39幼苗(参考文献--司振峰，夏大亮，王宝峰，柏合荫，师转哲，2001。大豆品种-合丰39号。《中国农技推广》,2001(4):33-33)经150mM氯化钠溶液处理后，利用实时荧光定量PCR对这些候选基因进行时空表达模式分析，发现盐胁迫后有多个候选基因变化明显。其中，GmSLT是上述方法预测获得一个大豆耐盐基因，并进行了大豆幼苗根叶基因时空表达模式分析，在150mM盐胁迫后表达上调明显，推测为大豆耐盐相关的基因，并对该基因进行了克隆；根据预测基因GmSLT的序列，利用软件PrimerPremier5设计一对引物，利用高保真酶KOD扩增。扩增模板是获得大豆的cDNA(利用盐胁迫后的大豆幼苗根叶提取RNA再反转录为cDNA)。1、引物设计如下:GmSLT-F5’-TCTAGAATGGGCGATACTT-3(SEQIDNO.6)；GmSLT-R5’-GAGCTCTCAAGTCAACATAAGAT-3(SEQIDNO.7)；反应体系：反应条件：2、PCR产物纯化回收，使用PCR产物纯化试剂盒(上海捷瑞)。3、纯化产物加A反应50μl反应体系：72℃连接30min；4、大肠杆菌感受态细胞的制备1)接种大肠杆菌DH5α，挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜(约16小时)；2)取1ml过夜培养物转接于100mlLB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2-3小时(250-300rpm),至OD600为0.4-0.6；3)将0.1MCaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作；4)吸取1ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5)4℃下3000g冷冻离心5分钟；6)弃去上清，加入100μl预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7)4℃下3000g冷冻离心5分钟；8)弃去上清，加入100μl预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9)细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂(15％-40％甘油)后超低温冷冻贮存备用(－70℃)。5、连接反应使用TaKaRapMD18-Tsimplevector，参照说明书操作。目的片段和载体控制摩尔比约为6：1，加样混匀。加等体积的solutionI5μl，轻混匀，稍离心，16℃连接数小时。6、转化取连接反应液5μl热击法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。1)将感受态细胞从-70℃取出，冰中融化，然后加入5μl连接反应液，轻混匀，放于冰中30min；2)42℃水浴中热击45秒，迅速放入冰中2min；3)加入890μlLB液体培养基，180rpm，摇床中培养1小时；4)取下层100μl菌液，涂布于LB(Amp/X-gal/IPTG)平板上，37℃倒置培养过夜。7、菌落PCR鉴定用牙签挑取一点白色单菌落，放入100μl无菌水中搅匀，然后用1μl菌液作为模板进行菌落PCR。25μl反应体系如下，反应条件同本例(1)：8、大肠杆菌质粒提取1)挑取单菌落接种于3-5ml含抗生素的LB液体培养基中，37℃摇培过夜。2)取1-3ml菌液于干净离心管中，12000r/min离心5min，弃尽上清，收集菌体。3)向沉淀加入200μl预冷的SolutionI溶液，振荡混匀，悬浮菌体。4)加入200μlSolutionII，迅速且柔和颠倒离心管数下混匀(不超过5min)。5)加入200μl预冷的SolutionIII溶液，颠倒离心管数下轻混匀，冰上放置5min。6)12000r/min，离心10min。7)小心吸取上清液转入另一个干净的离心管中，加入400μl(或等体积)Tris饱和酚：氯仿(1∶1)溶液，反复轻振荡，混匀，12000r/min离心5min。8)吸取上清液至另一个离心管中(避免吸附蛋白)，加入400μl氯仿，反复振荡混匀，12000r/min离心5min。9)小心吸取上清液至另一个离心管中，加入预冷的2倍体积无水乙醇和1/10体积的3M醋酸钠溶液，混匀后，-20℃放置10min。10)然后，12000r/min离心5-10min，弃尽上清。加入70％乙醇0.5ml洗涤2次，真空干燥或风干，沉淀用50μlTE+RNase(20μg/ml)溶解，然后-20℃保存。9、质粒酶切鉴定用NEB限制性内切酶BamHI、SalI,20μl体系37℃酶切数小时。10、测序与分析将菌落PCR和酶切鉴定为阳性的菌落，用单菌落LB+Amp小养过夜，取少量菌液送公司测序，使用通用引物测序，得到序列如SEQIDNO:1所示；将测序结果与申请人前期预测的GmSLT序列进行比较，并利用DNAMAN、NCBI、softberry和Phytozome等生物信息学工具进行分析。实施例2、酵母耐盐试验设计引物扩增耐盐基因ORF的全长，使其带有双酶切位点可以和酵母载体pRUL129相连，构建重组质粒。KOD扩增后，连接到pMD-18T，转化DH5α，抽质粒双酶切过夜，胶回收纯化后，连接到经同样酶酶切的pRUL129载体。利用化学转化法或者电转化法将构建的转基因载体转化酿酒酵母W303-1A，28℃培养3天，可以见到白色的酵母菌落。挑取单菌落，小养后进行测序验证正确。1、电转化法酿酒酵母W303-1A感受态制备和转化本步骤的实施可参考文献--秦玉静金建玲鲍晓明高东,1999。影响酿酒酵母电击转化率的条件。山东大学学报(自然科学版)Vol.34No.2。1)将转化用酵母菌株的单菌落接种于5mlYPD培养基中，30℃过夜培养至饱和；2)转化前一天晚上，在装有500mlYPD培养基的2L无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，于30℃剧烈振摇，直到细胞密度达1×108(OD600约为1.3-1.5，1：10稀释约为0.3-0.35)；3)于4℃，4000g离心5min收获培养细胞，细胞用80ml无菌水重悬。为了增加细胞对电击的感受性，继续步骤4。如果不需要可接步骤6；4)加入10ml，pH7.5，10×TE缓冲液，摇晃均匀，再加入10ml1M乙酸锂，旋转摇匀，于30℃，85rpm摇动45min；5)加入2.5ml1mol/LDTT,并同时旋转摇动，于30℃85rpm摇动15min；6)将酵母菌悬液洗涤3次，每次以4000-6000g于4℃离心沉淀细胞，依次重悬细胞所用的溶液如下：第一次沉淀：250ml冰冷的水第二次沉淀：20-30ml冰冷的1mol/L山梨醇第三次沉淀：0.5ml冰冷的1mol/L山梨醇最终菌液体积应为1.3-1.5ml，此时菌密度为1×1010。7)电转化前，在无菌冰冷的微量离心管中加入40μl酵母菌细胞和小于等于100ng待转化的DNA(体积小于5μl)，混匀。转移至冰冷的电转槽中，接下来按照Bio-Rad电穿孔仪的说明操作。8)脉冲后往电击槽中加入1ml预冷的1mol/L山梨醇，轻轻吹吸混匀；9)梯度涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30℃培养3-6天，直到平板上出现菌落。2、酿酒酵母W303-1A总DNA和质粒的提取1)取培养30h的酵母菌液1-2ml，12000rpm,1min离心；2)用STE洗涤2次；3)用100μlTE缓冲液重悬，加入50μl玻璃珠(sigama公司)，加入100μl酚氯仿，剧烈震荡1h,；4)4℃，12000rpm离心10min；5)取上清，加等体积氯仿，抽提蛋白和酚；6)重复步骤5直至液面分界处没有蛋白残留；7)取上清，加入两倍体积冰无水乙醇，-20℃静置20min,12000rpm离心10min；8)弃上清，70％乙醇洗涤一次，自然干燥；9)溶于50-100μlTE中，加入RNaseA(终浓度为20μg/ml),37℃反应30min后保存于-20℃；10)PCR检测，因为裂解效率低，质粒含量不高，建议模板量为1～2μl/25μl反应体系。3、过表达GmSLT基因对酵母盐胁迫下生长能力影响实验采用点滴试验(Yeastdroptestassay)与生长曲线法检测GmSLT基因对酵母盐胁迫下生长能力的影响(可参考文献--陈宏运，叶燕锐，朱怡，郑穗平，林影，2008。酵母耐性评价方法的比较。食品与发酵工业,2008,34(12):51-57)。点滴法为将相同浓度的野生型与转化GmSLT的酵母点种于添加0,300mM，500mMNaCl的酵母基本培养基上，28度培养2-3天，观察酵母生长情况，拍照记录。生长曲线法为：将酵母接种至基本培养基，28℃过夜培养，调整OD600到0.5，以1ml培养基悬浮接入100ml新的丰富培养基液体YPD(含300mMNaCl)，使初始OD600为0.005，28℃,150rpm，培养3d，间隔6小时检测一次OD值。由附图2中可以看到，当培养基中NaCl浓度达到在300mM时，W303-1A以及转化pRUL129空质粒的W303-1A生长均减慢，但过表达GmSLT的W303-1A酵母在培养基中NaCl浓度达到在500mM时，仍能生长。从附图3中可以看到，当培养基中NaCl浓度达到在300mM时，从30小时开始，过表达GmSLT的W303-1A酵母生长速度显著高于W303-1A以及转化pRUL129空质粒的W303-1A。到第72h时，带有GmSLT转基因的酵母OD600已达到8.85，而带有空质粒的对照仅达到4.05，野生型W303-1A为3.02。上述实验证明，过表达GmSLT基因，可显著提高酵母对盐胁迫适应能力。证明GmSLT基因功能与耐盐密切相关。4、GmSLT各结构域与耐盐功能相关性1)Over-LappingPCR：为验证GmSLT各结构域功能，采用Over-LappingPCR的方法，分别进行了ABS、TM、TM303、TH178以及ZBS结构域的缺失，详见图1。根据此方法分别设计引物P2，P3以及共用引物P1，P4，分别进行2轮各20-cycle的PCR。所设计的引物序列是：GmSLTΔABS-P25‘-CTCATGCAA-CCAAGCACCCCAAATG-3‘(SEQIDNO.8)GmSLTΔABS-P35‘-GGGGTGCTTGG-TTGCATGAGAAATCTAAG-3‘(SEQIDNO.9)GmSLTΔTM-P25‘-GATTTCTCATG-TTGGTGCACTTCCTTCCAG-3‘(SEQIDNO.10)GmSLTΔTM-P35‘-GTGCACCAA-CATGAGAAATCTAAGACC-3‘(SEQIDNO.11)GmSLTM303-F5‘-GGATCCATTGATCTATCTCCTGT-3‘(SEQIDNO.12)GmSLTM303-R5‘-GTCGAC-TCAAGTCAACATAAGATCA-3‘(SEQIDNO.13)GmSLTH178F-F5‘-ACATGAACGGGCTCTCTCGCCAAGG-3‘(SEQIDNO.14)GmSLTH178F-R5‘-CCTTGGCGAGAGAGCCCGTTCATGT-3‘(SEQIDNO.15)GmSLTΔZBS-P25‘-TCTCGGCACT-CCCGTTCATGTAACTCCTC-3‘(SEQIDNO.16)GmSLTΔZBS-P35‘-CATGAACGGG-AGTGCCGAGAAGGGTTTTG-3‘(SEQIDNO.17)P15‘-GGATCC-ATGGGCGATACTTCTC-3‘(SEQIDNO.18)P45‘-GTCGAC-TCAAGTCAACATAAGATCA-3‘(SEQIDNO.19)2)构建酵母转化载体重组pRUL129经测序验证的带有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的突变基因与带有同样酶切位点的酵母载体pRUL129相连，用电转化法转化酿酒酵母，在含1M山梨醇的选择平板上28℃培养3天。挑取单菌落做PCR验证，证明四种突变基因均已转入了酵母。3)GmSLT结构域与耐盐功能试验用点滴实验(Yeastdroptestassay)的方法对多种转化酵母进行耐盐试验。结果见图4。从图4中可以观察到，当培养基中的NaCl浓度达到300mM、500mM时，过表达完整GmSLT基因或缺失ZBS的酵母生长明显比其他酵母。该实验结果表明，在各结构域中，ABS，TM等结构域一旦缺失，GmSLT基因功能几乎完全丧失，及这两个结构域对于GmSLT的耐盐功能是必不可少的。相对而言，ZBS结构缺失后，对GmSLT基因功能功能影响较小。实施例3、转GmSLT水稻耐盐试验1、植物转化载体构建以经改造的双元载体pCAMBIA1301(参考文献陈宏运，叶燕锐，朱怡，郑穗平，林影，2008。酵母耐性评价方法的比较。食品与发酵工业,2008,34(12):51-57)作为植物表达载体(多克隆位点前增加有35S启动子)，参见实施例2，将基因GmSLT利用BamHⅠ和SalⅠ两个酶切位点从载体pMD-18TSimpleVector上双酶切下来，回收纯化，然后克隆到pCAMBIA1301的多克隆位点BamHⅠ和SalⅠ之间，称为35S：：GmSLT。2、农杆菌准备1)将35S：：GmSLT转化农杆菌LBR4404(参考文献--何迎春，高必达,2002。含烟草几丁质酶基因的质粒pBG1121的构建及水稻转化《湖南农业大学学报:自然科学版》,2002,28(2):93-96)，然后进行菌落PCR鉴定验证正确，并将阳性菌落加保护剂冻存于-70℃。2)转化前从-70℃冰箱中取出保种的农杆菌，接种于含相应抗生素的YEP固体培养基上，28℃培养箱培养2-3d。3)挑取农杆菌单菌落接入3mL无菌YEP液体培养基中(含25mg/L利福平+25mg/L链霉素+50mg/L卡那霉素)，28℃、200rpm培养约20h。4)再将所得到的菌液接入200mL含同样抗生素YEP液体培养基中，28℃、200rpm再培养约20h，待农杆菌的浓度达到OD600＝0.5左右。5)4℃、3000rpm离心15min，弃上清，用转化液重新悬浮，待用。3、转GmSLT基因水稻的获得(参考文献：张雪梅，袁涛，徐秀珍，王智杰，李春阳等，2000。植物表达质粒pBin438-IFN-γ的构建及向农杆菌LBA4404的高效转化。《四川大学学报(自然科学版)》,2000(s1)；易自力，曹守云，王力，储成才，李祥等，2001。提高农杆菌转化水稻频率的研究，遗传学报,2001,28(4):352-358)。有多种方法获得转基因水稻，本例以粳稻日本晴作为材料，通过成熟胚诱导愈伤组织，然后用含有GmSLT基因的农杆菌EHA105侵染愈伤组织，最后分化得到转基因植株。具体步骤如下：1)诱导愈伤及继代诱导培养基—MS混合粉末4.4g/L；2,4-D：4mg/L；蔗糖：30g/L；脯氨酸：2.8g/L；水解酪蛋白：0.3g/L；植物凝胶：3g/L(PH5.8)继代培养基—MS混合粉末4.4g/L；2,4-D：2mg/L；Fe-EDTA：5ml/L；蔗糖：30g/L；水解酪蛋白：0.3g/L；植物凝胶：3g/L(PH5.8)将水稻成熟种子，去壳后用次氯酸钠溶液消毒，再用灭菌去离子水洗涤多次，之后放到无菌滤纸上吸干，将种子平放于诱导培养基上，28℃黑暗下培养一个月左右；当胚性愈伤组织生长出来后，选择球型愈伤组织，置于继代培养基上，28℃黑暗下继代培养1周左右。2)农杆菌转化和共培养，共培养基—N6大量：50ml/L；B5微量：10ml/L；B5有机：1ml/L；肌醇：0.1g/L；2,4-D：2mg/L；Fe-EDTA：5ml/L；蔗糖：30g/L；葡萄糖：10g/L；植物凝胶：3g/L；灭菌后加AS:150μM(PH5.2)；参见实施例3将载体35S：：GmSLT转化农杆菌EHA105，并检验得到阳性菌落。再将阳性农杆菌用含抗生素的YEP平板活化培养28℃，2d，然后在平板上刮下菌，重新悬浮于含有适量AAM培养液中，在28℃，摇床上剧烈振荡培养2个小时，调整菌液OD600值约0.15。紧接着，将继代后的愈伤组织浸泡在农杆菌菌液中，约25min。之后，用无菌滤纸吸干菌液，将愈伤组织转接到含有一张无菌滤纸的共培养基上，暗20℃共培养3d。3)选择及分化培养选择培养基—N6大量：50ml/L；B5微量：10ml/L；B5有机：1ml/L；2,4-D：2mg/L；Fe-EDTA：5ml/L；蔗糖：30g/L；脯氨酸：0.5g/L；水解酪蛋白：0.3g/L；肌醇：0.1g/L；Phytagel：3g/L，灭菌后加头孢霉素：500mg/L；加潮霉素50mg/L(PH5.8)预分化培养基—N6大量：50ml/L；B5微量：10ml/L；B5有机：1ml/L；NAA：1mg/L；Fe-EDTA：5ml/L；蔗糖：30g/L；脯氨酸：0.5g/L；水解酪蛋白：0.3g/L；肌醇：0.1g/L；植物凝胶：3g/L，灭菌后加头孢霉素：250mg/L；ABA：5mg/L；6-BA：2.5mg/L；加潮霉素50mg/L；(PH5.8)分化培养基—N6大量：50ml/L；B5微量：10ml/L；B5有机：1ml/L；NAA：0.5mg/L；Fe-EDTA：5ml/L；6-BA：4mg/L；蔗糖：30g/L；水解酪蛋白：0.3g/L；肌醇：0.1g/L；植物凝胶：4.6g/L。(PH＝5.8)共培养后，将愈伤移到三角瓶中，加入无菌水洗涤愈伤组织3次，然后用添加了0.5g/L头孢霉素的无菌水洗涤多次至澄清，倒掉后再加(含0.5g/L头孢霉素)无菌水，放在摇床上摇2个小时，28℃，150转，(若发现液体浑浊，应再用0.5g/L头孢霉素无菌水洗涤至澄清，)之后将愈伤移至无菌滤纸上，吸干多余水分，超净台吹1小时左右，再将愈伤组织转移到选择培养基上(可挑选较大的愈伤组织分散在培养基上)，暗28℃培养两周。再挑取从原愈伤组织上生长出来的抗性愈伤组织，转移到预分化培养基上，暗28℃预分化培养1周。然后，将愈伤组织转移到分化培养基上，28℃分化培养：先在黑暗下培养3d，然后在持续光照下，光周期16h昼/8h夜，培养两周以上，这样愈伤组织会分化出幼苗。将分化出的幼苗转移到含MS培养基的三角瓶培养长大为植株(根系发达)，最后移栽到营养土培养。4)水稻阳性植株的鉴定a、转GmSLT水稻To代幼苗普通PCR检测利用SDS简易提取法，剪去少量水稻叶片，液氮磨碎，提取DNA。然后以此为模板，用GmSLT检测引物扩增，进行PCR扩增，并用原始亲本水稻(WT)作对照，结果请参见附图5。引物如下：GmSTL-d-F：5’-CTTCACATGAGGAACTGG-3’(SEQIDNO.20)GmSTL-d-R：5’-CTCAGTCTCATAGCCTTG-3’(SEQIDNO.21)从电泳图(图5)中可以看到，无论以转化GmSTL的水稻苗基因组DNA还是cDNA为模板，均可扩增出与以含GmSTL基因的质粒作为正对照进行PCR扩增完全相同的片段，证明转基因苗中成功导入了GmSTL基因。5)转GmSLT水稻To代部分株系基因表达量分析(RealtimePCR)a)幼苗总RNA提取使用北京康为世纪公司的植物RNA提取试剂盒，操作参考说明书。相关用品的处理：用0.1％的DEPC溶液浸泡蓝色磨棒过夜，然后121℃灭菌30分钟，倒去DEPC溶液，80℃烘干备用。并用DEPC水加无水乙醇配制75％乙醇。b)反转录为cDNA。叶片中提取总RNA，RNA洗脱体积50μl，检验RNA纯度和完整度后，进行反转录。再利用反转录试剂盒，参照说明书合成cDNA。接着，利用制备的cDNA作为模板进行RT-PCR检测，同上普通检测所用的引物进行阳性植株检测，并用原始亲本水稻(WT)作对照。选用检测为阳性的水稻植株制备cDNA模板，再根据有关原则，分别设计了ricetub和GmSLT的实时荧光定量PCR引物，如下：Ricetub-F：5’-GGCAAGATGAGCACCAAGGA-3’(SEQIDNO.22)Ricetub-R：5’-AAGCCACCGCAATACACCAC-3’(SEQIDNO.23)GmSLT-F5’-AGAATCACCACCCATCCA-3’(SEQIDNO.24)GmSLT-R5’-GTGCCAAGACCAACATCC-3’；(SEQIDNO.25)实时荧光定量pcr反应体系(SYBRGreen染色法)，20μl体系，具体成分如下：轻轻混匀后短暂离心反应条件：程序最后采用熔解曲线(meltingcurve)反应，分析PCR产物的特异性。实时荧光定量PCR每个样平行三次重复，以水稻看家基因tub作为内参，用2-ΔΔCT方法计算目标基因相对表达量。从附图6中可看到，野生型亲本苗中未检测到GmSLT的表达，而转基因苗1、3、4号中均检测到了GmSLT的表达，其中1号苗的表达量最高。4、转基因水稻耐盐试验材料：水稻日本晴野生型WT幼苗和转GmSLT水稻To代1#株系幼苗；处理方法：分别浇灌NaCl浓度1M和1.50M的MS+NaCl溶液，每盆浇30ml一次，9d后统计水稻耐盐情况。由下表及图7中可以观察到，采用1M的Nacl分别处理亲本日本晴与转GmSLT的1#小苗9天后，野生型日本晴已出现明显的枯萎现象，而转GmSLT基因的小苗并未出现明显的盐害症状。当采用1.5M的NaCl处理9天后，野生型日本晴已基本枯死，而转GmSLT基因的小苗虽有叶片枯萎现象，但小苗仍存活。由此可以得出结论，过表达GmSLT基因可以显著提高水稻的耐盐特性。转GmSLT基因的水稻苗盐胁迫处理结果盐浓度植株处理后植株表现1MWT水稻叶片枯萎较重1M转GmSLT水稻叶片枯萎轻微1.5MWT水稻部分植株枯死，部分植株枯萎严重1.5M转GmSLT水稻植株存活，叶片枯萎综上所述，本发明通过生物信息学及基因时空表达分析，获得了一种耐盐基因，命名为GmSLT；将该基因转化酵母、水稻等多种生物，均可显著提高相关生物的耐盐性能。本发明的基因能够用于改良工业菌株,如:酵母,以及作物，如：水稻等，可显著提高其耐盐能力。具有降低酵母等工业生产菌株培养要求，减少生产成本，提高目标化合物产量以及扩展作物种植区域、提高产量等应用前景与价值。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。当前第1页1 2 3