一种苗期玉米耐盐性的筛选鉴定方法与流程

本发明涉及农作物种植技术领域，尤其是涉及一种苗期玉米耐盐性的筛选鉴定方法。

背景技术：

土壤的盐碱化是造成农作物减产的主要因素之一。据统计，全世界约有20％的农业用地其盐碱化程度在不断加重。我国有2.6×10⁷hm²的盐碱地，其中有6.6×10⁶hm²是耕地面积，主要集中在华北、东北、西北内陆地区和长江以北等粮食主产区。近年来，由于环境影响和人类活动等不利因素的影响，越来越多耕地正面临发生次生盐碱化的危险。预计到2050年，全世界将会有超过50％的耕地盐碱化。因此，盐碱地综合利用研究与防治成为科研的热点，其中选育抗盐或耐盐的农作物品种是最经济有效的途径。

盐胁迫是影响植物生长和农作物产量的一个重要环境限制因素。盐胁迫易引发离子胁迫和渗透胁迫，最终导致植物叶面积扩展受阻、光合作用以及生物量积累降低等。渗透胁迫是盐毒害作用最先产生的方式。土壤中盐分过多使土壤溶液水势(Water potential)下降，会造成植物吸水困难，甚至体内水分有外渗的危险，从而导致植物生理干旱。

渗透胁迫会造成植物发育迟缓，抑制植物组织和器官的生长和分化，使植物的发育进程提前衰老加速，生长量降低，最终导致植株因饥饿而死亡。

植物被转移到盐逆境中几分钟后，生长速率即有所下降，其下降程度与根际渗透压(Rhizosphere osmotic pressure)呈正比。最初盐胁迫造成植物叶面积扩展速率(The expansion rate of leaf area)降低，随着含盐量的增加，叶面积停止增加，叶、茎和根的鲜重及干重降低。盐分主要是通过减少单株植物的光合面积而造成植物碳同化量(Carbon assimilation)的减少。

盐渍土壤中某种离子含量过高而往往排斥植物对其它离子的吸收，形成不平衡的土壤溶液，导致特殊的离子毒害作用。在盐胁迫下，高浓度Na⁺可置换细胞膜结合的Ca²⁺，使膜结合Na⁺增加，膜系统的组分、透性、运输、离子流率等都会受到影响而发生变化，导致质膜透性的改变，Na⁺大量进入细胞，细胞内Na⁺增加，而K⁺外渗，使Na⁺/K⁺值增大，抑制液泡膜焦磷酸酶(H⁺-Ppase)活性和胞质中的H⁺跨液泡膜运输，跨液泡膜运输的pH梯度下降，液泡碱化，不利于Na⁺在液泡内积累。从而打破原有的离子平衡，当Na⁺/K⁺比值增大到阈值时植物即受害。

另外，在盐胁迫等逆境条件下，活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)产生与清除之间的动态平衡被破坏，从而导致活性氧的大量积累。植物体内积累过多的活性氧，若不能及时清除就会造成氧化胁迫，形成一些活性氧物质，如：单线态氧(¹O₂)、过氧化氢(H₂O₂)、羟自由基(OH·)、超氧化物阴离子(O₂·^－)等。活性氧具有很强的氧化能力，对不饱和脂、蛋白质、核酸等生物分子具有破坏作用，可引起酶失活、色素脱色、蛋白降解和脂质过氧化(Membrane lipid peroxidation,LPO)等反应，严重可阻断DNA复制和转录，导致DNA损伤和突变，造成细胞死亡。活性氧还可使膜脂过氧化(LPO)，产生丙二醛(Malondialdehyde,MDA)，MDA是膜脂过氧化作用的主要产物之一，具有很强的细胞毒性，对膜和细胞中的许多生物功能分子如蛋白质、核酸和酶均有很强的破坏作用。

植物在适应盐胁迫环境时形成了许多耐受调节机理，如Na⁺的外排、Na⁺区隔化进入液泡、可溶性物质的积累和活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的清除等。在外界盐胁迫条件下，土壤中盐分过多会降低土壤水势，由于水势的降低，影响了植物对水分和养分的吸收，导致生理干旱和养分亏缺。这种作用是盐害最重要的短期效应。为避免这种伤害，细胞内会积累一些可溶性物质来降低细胞内渗透势(Osmotic potential)。一方面，植物细胞从外界吸收无机离子，如盐生植物中的Na⁺、K⁺和Cl^-；另一方面，植物受到渗透胁迫造成的不平衡，通常在细胞内积累渗透保护物质(Osmoprotectant)以降低细胞的渗透势，由于它们不干扰细胞内正常的生化反应，因此将它们统称为“相容性溶质(Compatibility solute)”。这些相容性溶质主要包括脯氨酸(Proline,Pro)、甜菜碱(Betaine)、多胺(Polyamine,PA)、甘油醇(Glycerol)、山梨醇(Sorbitol)和肌醇(Inositol)以及一些多糖分子。无机和有机渗透调节物质，二者共同进行渗透调节降低细胞水势，使水分的跨膜运输朝着有利于细胞生长的方向流动，以保证植物正常的生理代谢需求。

此外，在盐胁迫下，植物体内的吲哚乙酸(Indoleacetic acid,IAA)、细胞分裂素(Cytokinin,CTK)、赤霉素(Gibberellic acid,GA)等激素均发生不同程度的变化，脱落酸(Abscisic acid,ABA)是受环境条件影响最大的一种激素。很多的研究发现，逆境条件下很多植物中的ABA水平明显上升。

玉米(Zea mays L.)既是重要的粮食和饲料作物，又是重要的工业原料。目前我国是玉米生产第二大国，市场上玉米供求的矛盾日益加剧，提高玉米的综合生产力已经成为一项紧迫的任务。玉米是对盐碱中度敏感的作物，耐盐性相对较差，只能在NaCl含量在0.3％以下的土壤上生长。

玉米苗期是整个生长周期的关键时期，该时期对各种外界不利环境因素的胁迫比较敏感，其中盐胁迫使玉米幼苗生长受阻，芽势弱，胚根少且短，苗弱，成活率低，严重影响其生长发育及产量。

因此，玉米在苗期对盐胁迫的耐受程度表明其耐盐性的高低，玉米的耐盐性对其能否顺利度过生长敏感期乃至整个生长期都是至关重要的，对苗期玉米耐盐性的筛选将为下一步耐盐玉米选育奠定基础。

综上研究报道，一方面，盐胁迫造成植物发育迟缓，植物叶面积停止增加，光合速率下降，叶、茎和根的鲜重及干重降低，积累大量的活性氧，产生丙二醛(MDA)，破坏膜系统，使植物的发育进程提前衰老加速，以致死亡。

因此，盐胁迫早期可通过测定叶绿素含量、丙二醛含量及活性氧(H₂O₂)含量来鉴定植株受盐胁迫损伤的程度，盐胁迫后期可通过观察植物的叶片枯萎程度来鉴定耐盐性强弱。

另一方面，植物自身可通过积累有机渗透保护物质(如可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等)来调节或缓冲高盐引发的渗透胁迫，这些可溶性物质可降低细胞水势，使水分的跨膜运输朝着有利于细胞生长的方向流动。据此，植物体内这些可溶性物质含量的高低可表征其自身的耐盐性强弱，所以也可通过测定植株受盐胁迫后的可溶性物质含量来鉴定其耐盐性。

上述测定各物质含量使用成本高，用量大且操作步骤繁琐，且有一定的危险性(所需加热过程中若操作不当，液体易喷出，灼伤皮肤)。丙二醛、过氧化氢、可溶性糖、脯氨酸等含量的测定所需用的一些化学物质包括硫代巴比妥酸(TBA)、茚三酮(Ninhydrin)、甲苯、蒽酮(Anthrone)等的成本高，且有剧毒，对人体伤害大，不易分解，污染环境。

因此，如何提供一种成本低、简单易行、且对人体和环境无害、易于进行大规模操作的苗期玉米耐盐性的筛选鉴定方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种苗期玉米耐盐性的筛选鉴定方法，该筛选鉴定方法成本低、简单易行、且对人体和环境无害、易于进行大规模操作。

为解决上述的技术问题，本发明提供的技术方案为：

一种苗期玉米耐盐性的筛选鉴定方法，首先将多个待筛选鉴定的玉米品种的萌发良好一致的幼苗进行正常的营养液培养，等玉米幼苗长到三叶一心期后，用营养液对全部待筛选鉴定的玉米品种的幼苗均进行0mM Pi的缺磷胁迫处理，处理一定时间后，观察幼苗长势特征，根据玉米幼苗是否有缺磷症状来判断其是否耐盐，具有缺磷症状的玉米幼苗为耐盐性玉米品种，未有缺磷症状的玉米幼苗为非耐盐性玉米品种；

根据玉米幼苗缺磷症状的严重程度来判断相应的玉米品种的耐盐性的高低，玉米幼苗的缺磷症状越严重表征相应的玉米品种的耐盐性越高。

优选的，缺磷胁迫处理过程中，所用营养液中各元素浓度为：

优选的，缺磷胁迫处理后，用营养液对全部缺磷胁迫处理后的玉米品种的幼苗均再进行一定浓度的Zn²⁺的锌胁迫处理，处理一定时间后，根据玉米幼苗的长势变化来进一步判断其是否耐盐，锌胁迫处理前后长势由好转坏的玉米幼苗为非耐盐性玉米品种，锌胁迫处理前后长势由坏转好的玉米幼苗为耐盐性玉米品种；

锌胁迫处理过程中，所用营养液中的Zn²⁺浓度为20μM～50μM，所用营养液中的Pi浓度为1mM。

优选的，锌胁迫处理过程中，所用营养液中各元素浓度为：

与现有技术相比，本发明提供了一种苗期玉米耐盐性的筛选鉴定方法，本发明发现和验证了苗期玉米的耐盐性与其磷敏感性以及锌敏感性的关系；经试验表明玉米自交系的盐耐性与其磷敏感性是呈现一致的，耐盐性玉米自交系对缺磷较为敏感，即耐盐性玉米自交系在缺磷胁迫处理下具有缺磷症状，因此，可通过判断玉米自交系对磷的敏感程度，即在缺磷胁迫处理下是否具有缺磷症状，是否具有缺磷症状的典型“紫红叶”表现，来间接判断相应玉米品种是否耐盐，具有缺磷症状的玉米幼苗为耐盐性玉米品种，未有缺磷症状的玉米幼苗为非耐盐性玉米品种；进一步的，本发明对全部缺磷胁迫处理后的玉米品种的幼苗均再进行一定浓度的Zn²⁺的锌胁迫处理，营养液中包含正常配比含量的Pi以及较正常配比含量更高的Zn²⁺，用正常配比含量的Pi修复缺磷胁迫处理后的玉米幼苗，用较正常配比含量更高的Zn²⁺对玉米幼苗进行锌胁迫处理，处理一定时间后，根据玉米幼苗的长势变化来进一步判断其是否耐盐，锌胁迫处理前后长势由好转坏的玉米幼苗为非耐盐性玉米品种，锌胁迫处理前后长势由坏转好的玉米幼苗为耐盐性玉米品种；本发明前后两步结合，提高了筛选鉴定的精确性，且该方法切实有效，操作简便易行，无需使用化学药品进行检测，因而成本低，且对人体无毒害，对环境无污染，为进一步进行大批量筛选玉米耐盐自交系、培育耐盐作物奠定了一定的理论基础。

附图说明

图1为本发明中QXN233与QXH0121的玉米幼苗在低磷胁迫处理下的生长结果；

图2为本发明中QXN233与QXH0121的玉米幼苗(花盆培养模式)在盐胁迫和无磷胁迫处理下的生长结果；

图3为本发明中QXN233与QXH0121的玉米幼苗(液体培养模式)在盐胁迫和无磷胁迫处理下的生长结果；

图4为本发明中QXN233的玉米幼苗在磷胁迫处理以及盐+磷胁迫处理下下的生长结果；

图5为本发明中QXN233与QXH0121的玉米幼苗在盐+磷胁迫处理下下的生长结果；

图6为本发明中QXN233与QXH0121的地上部(茎)和地下部(根)重量；

图7中，A为本发明中QXN233与QXH0121的玉米幼苗在盐胁迫处理与盐+磷胁迫处理下的叶绿素含量；

B为本发明中QXN233与QXH0121的玉米幼苗在盐胁迫处理与盐+磷胁迫处理下的膜质过氧化损伤程度；

C为本发明中QXN233与QXH0121的玉米幼苗在盐胁迫处理与盐+磷胁迫处理下的脯氨酸含量；

D为本发明中QXN233与QXH0121的玉米幼苗在盐胁迫处理与盐+磷胁迫处理下的可溶性蛋白含量；

E为本发明中QXN233与QXH0121的玉米幼苗在盐胁迫处理与盐+磷胁迫处理下的可溶性糖含量；

F为本发明中QXN233与QXH0121的玉米幼苗在盐胁迫处理与盐+磷胁迫处理下的超氧化物歧化酶活性SOD；

图8为本发明中QXN233与QXH0121的玉米幼苗在正常Hongland营养液培养下的生长结果；

图9为本发明中QXN233与QXH0121的玉米幼苗在盐胁迫和高锌胁迫处理下的生长结果；

图10为本发明中QXN233与QXH0121的玉米幼苗在锌胁迫处理下的生长结果；

图11为本发明中QXN233与QXH0121的玉米幼苗在盐+锌胁迫处理下的生长结果；

图12为本发明实施例1中的8个玉米品种的玉米幼苗在缺磷胁迫处理下的生长结果；

图13为本发明实施例1中的8个玉米品种的玉米幼苗在缺磷胁迫处理下的花青素含量；

图14为本发明实施例1中的8个玉米品种的玉米幼苗在盐胁迫处理下的生长结果；

图15为本发明实施例1中的8个玉米品种的玉米幼苗在盐胁迫处理下的丙二醛(MDA)含量。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

参照图1～图11，1.玉米自交系的盐耐性与其磷敏感性的关系：

1.1初步验证：

在高18cm、直径23cm的花盆里，填充适宜的普通园艺用蛭石(高度14cm)，首次浇透Hongland营养液(营养液配方见表1)，将萌发良好一致的玉米非耐盐性自交系QXN233和耐盐性自交系QXH0121幼苗小心移栽入盆内，以后每隔3-5天浇1次新鲜的正常Hongland营养液(营养液配方如上述所示，400ml/每盆)。

待玉米幼苗长到三叶一心期(约2周)，进行低磷胁迫处理，具体为：低磷处理组中每个处理花盆浇灌含有0.001mM H₂PO₄^–(即Pi)的Hongland营养液；而对照组中每个花盆浇灌含有正常的1mM Pi和稍低的0.5mM Pi的Hongland营养液。这样处理3周后，可明显看出：

(1)二者的对照组要显著优于其处理组中的玉米幼苗的生长(图1所示)；

(2)且观察发现，处理组中，耐盐性自交系QXH0121幼苗叶片呈现紫红色，并不断由老叶向新叶蔓延加重，是典型的玉米缺磷症状(图1A)；而不耐盐性自交系QXN233幼苗叶片表现出正常的绿色，仅茎部呈现一定的紫红色(图1B)。

接下来，我们对玉米自交系QXN233和QXH0121分别进行了盐胁迫和无磷胁迫处理。待玉米幼苗长到3叶一心期(约2周)，分别进行200mM NaCl和0mM Pi处理。

具体方案为：

盐处理组中每个处理花盆浇灌含有200mM NaCl的Hongland营养液；

无磷处理组中每个处理花盆浇灌不含Pi(即0mM Pi)的Hongland营养液；

对照组中每个花盆浇灌正常的Hongland营养液。

这样处理30d后，可明显看出：

(1)二者的对照组均生长正常良好；

(2)200mM NaCl处理下，二者较对照生长受阻，植株整体表现为矮小，不耐盐性自交系QXN233幼苗茎叶纤细，叶片呈现卷曲枯萎状，根系细长(图2A)；而耐盐性自交系QXH0121叶片伸展、宽大，茎部较粗，根系粗壮、较发达(图2C)，即玉米幼苗长势QXN233<QXH0121(图2A和2C)，确证了二者的耐盐性；

(3)在无磷处理下，QXN233的玉米幼苗与对照组相比生长较矮小，但根系略增多(图2B)；而QXH0121比对照株中的幼苗生长也较矮小，且茎部呈现出明显的紫红色，即表现出典型的玉米缺磷症状(图2D)，QXN233与之相比，叶片和茎部仍显示正常的绿色，并未变紫红(图2B)，生长态势明显优于QXH0121，即受胁迫严重程度QXH0121>>QXN233(图2B和2D)。

上述实验验证了耐盐性自交系QXH0121对缺磷较为敏感，而非耐盐性自交系QXN233对缺磷不敏感，可较强的耐受一定程度的缺磷胁迫。本实验初步表明玉米自交系的盐耐性与其缺磷敏感性是呈现一致的，因此，可通过判断玉米自交系对缺磷的敏感程度，即是否具有“紫红叶”表现的缺磷症状，来间接判断对盐的耐受程度。

同样，我们采用液体培养的方式再次重复了上述实验：

将萌发良好一致的玉米非耐盐性自交系QXN233和耐盐性自交系QXH0121幼苗小心移栽入锥形瓶内，以后每隔1天换1次新鲜的正常Hongland营养液(营养液配方如上述所示，350ml/每瓶)。

待玉米幼苗长到三叶一心期(约2周)，对玉米自交系QXN233和QXH0121分别进行了盐胁迫和无磷胁迫处理，具体方案为：

盐处理组每个处理锥形瓶中含有25mM NaCl的Hongland营养液；

无磷处理组中每个处理锥形瓶中不含Pi(即0mM Pi)的Hongland营养液；

对照组中每个锥形瓶中含有正常的Hongland营养液。

盐胁迫处理15天后，可明显看到：

(1)非耐盐性自交系QXN233叶片呈现枯萎卷曲状(图3A和3B，箭头所示)，而耐盐性自交系QXH0121叶片仍能保持正常的伸展状态(图3A和3C)；

(2)无磷胁迫35天后，耐盐性自交系QXH0121茎部呈现明显的紫红色，并向老叶和新叶蔓延(图3D和3F，箭头所示)，非耐盐性自交系QXN233仍呈现正常的绿色(图3D和3E)。

本实验的结果也表明玉米自交系的盐耐性和缺磷敏感性是呈现一致的，同样表明，可通过判断玉米自交系对缺磷敏感程度，即是否具有“紫红叶”表现来间接判断对盐的耐受性。另外，据此，我们也推测，耐盐性的自交系对缺磷应该较为敏感，而高磷应该能缓解一定的盐胁迫症状。于是，我们进一步通过实验进行了后期验证。

表1正常Hongland营养液配方

1.2.后期验证过程：

在高18cm、直径23cm的花盆里，填充适宜的普通园艺用蛭石(高度14cm)，首次浇透Hongland营养液，将萌发良好一致的玉米非耐盐性自交系QXN233幼苗小心移栽入盆内，以后每隔3-5天浇1次新鲜营养液(400ml/每盆)。待玉米幼苗长到三叶一心期(约2周)，分别进行磷胁迫处理以及盐和磷胁迫共同处理，具体为：

磷处理组设3个梯度，分别为分别为1mM、3mM、11mM Pi，其中1mM是正常Hongland营养液中的Pi浓度；

各个磷梯度分别0mM NaCl和200mM NaCl盐胁迫处理两两组合，做共同处理组，即为0mM NaCl+1mM Pi、0mM NaCl+3mM Pi、0mM NaCl+11mM Pi和200mM NaCl+1mM Pi、200mM NaCl+3mM Pi、200mM NaCl+11mM Pi。

这样处理2周后，可明显看出，200mM NaCl处理下，玉米幼苗长势1mM<11mM<3mM Pi(图4)。因此，上述实验结果表明营养液中增添至3mM Pi能够有效缓解200mM NaCl的盐胁迫伤害作用。所以，我们选择200mM NaCl处理分别与1mM和3mM Pi的两两组合作为进一步后期验证的目标。

1.3.进一步后期验证：

在高18cm，直径23cm的花盆里，填充适宜的普通园艺用蛭石(高度14cm)，首次浇透Hongland营养液，将萌发良好一致的玉米非耐盐性自交系QXN233和耐盐性自交系QXH0121幼苗小心移栽入内，以后每隔3-5天浇1次新鲜营养液(400ml/每盆)。

待玉米幼苗长到3叶一心期(约2周)，进行盐胁迫处理以及盐和磷胁迫共同处理，具体为：

盐处理组中每个处理花盆浇灌含有200mM NaCl的Hongland营养液；

而应对组中每个花盆浇灌同时含有3mM Pi+200mM NaCl的Hongland营养液。

这样处理2周后，可明显看出：

(1)应对组要显著优于处理组中的玉米幼苗的生长(图5中玉米幼苗长势3mM Pi+200mM NaCl>>200mM NaCl)；

(2)1月过后，盐处理组中非耐盐性自交系QXN233的玉米幼苗已近乎死亡，而应对组中的玉米幼苗地上部仍大部分持绿(图5A，红框所示)；

(3)而耐盐性自交系QXH0121的应对组中的玉米幼苗状态也较盐处理组有明显的改善(图5B，红框所示)。

因此，本实验再次证实了营养液中增添至3mM Pi能够有效缓解200mM NaCl的高盐分对玉米幼苗(包括耐盐性玉米与非耐盐性玉米)的盐胁迫伤害，同时，本实验也证实了我们的推测，耐盐性的自交系对缺磷较为敏感，而一定浓度的Pi的补给能显著缓解严重的盐胁迫症状，这可能与较高的Pi浓度加快了玉米幼苗的生长，促使玉米整株体积增大，有效稀释了植株体内的盐分有关。

对各种生理指标的测定也进一步证实了这一实验结论：

(1)3mM Pi的补给均显著提高非耐盐性自交系QXN233和耐盐性自交系QXH0121的地上部(茎)和地下部(根)重量(图6)；对非耐盐性自交系QXN233而言，200mM NaCl胁迫下，3mM Pi的补给显著提高了非耐盐性自交系QXN233的地上部(茎)和地下部(根)的重量(图6A和6B)，而耐盐性自交系QXH0121的改善程度不如非耐盐性自交系QXN233明显(图6C和6D)，暗示了QXH0121自身已具较强的耐盐性，3mM Pi的增加对非耐盐性自交系QXN233耐盐性的改善更显著。

(2)在200mM NaCl+3mM Pi处理下，QXN233的叶绿素(图7A)、脯氨酸(图7C)、可溶性蛋白(图7D)和可溶性糖(图7E)显著高于仅200mM NaCl处理组，并且，其超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)(图7F)也显著高于200mM NaCl处理组，而其膜质过氧化损伤程度显著低于200mM NaCl处理组(图7B)。同样，除可溶性蛋白(图7D)，QXH0121的其它生理指标的变化同QXN233。因此，将Hongland营养液Pi含量提高到3mM，可有效拮抗200mM NaCl对非耐盐性玉米自交系QXN233和耐盐性玉米自交系QXH0121幼苗造成的盐胁迫伤害。

2.玉米自交系的盐耐性与其锌敏感性的关系：

2.1初步验证：

在高18cm、直径23cm的花盆里，填充适宜的普通园艺用蛭石(高度14cm)，首次浇透Hongland营养液(营养液配方见表1)，将萌发良好一致的玉米非耐盐性自交系QXN233和耐盐性自交系QXH0121幼苗小心移栽入盆内，以后每隔3-5天浇1次新鲜的正常Hongland营养液(营养液配方如上述所示，400ml/每盆)。

待玉米幼苗长到三叶一心期(约2周)，观察发现，耐盐性自交系QXH0121幼苗叶片出现黄色斑点，并不断加重蔓延，而非耐盐性自交系QXN233幼苗叶片表现出正常的绿色，如图8所示，萌发生长1月后，可以明显看到，QXH0121幼苗叶片中下部有明显的枯黄斑点，并逐渐变白干枯，即呈现为玉米的“花白叶”，是典型的玉米缺锌症状。

接下来，我们对玉米自交系QXN233和QXH0121分别进行了盐胁迫和高锌胁迫处理。待玉米幼苗长到3叶一心期(约2周)，分别进行200mM NaCl和100μM ZnSO₄处理。

具体方案为：

盐处理组中每个处理花盆浇灌含有200mM NaCl的Hongland营养液；

高锌处理组中每个处理花盆浇灌含有100μM ZnSO₄的Hongland营养液；

对照组中每个花盆浇灌正常的Hongland营养液。

这样处理30d后，可明显看出，二者的对照组均生长正常良好；200mM NaCl处理下，二者较对照组生长受阻，植株整体表现为矮小，非耐盐性自交系QXN233幼苗茎叶纤细，叶片呈现卷曲枯萎状，根系细长(图9A)；而耐盐性自交系QXH0121叶片伸展、宽大，茎部较粗，根系粗壮、较发达(图9C)，即玉米幼苗长势QXN233<QXH0121(图9A和9C)，确证了二者的耐盐性。

同样在100μM ZnSO₄处理下，QXN233的玉米幼苗较对照生长矮小，地上部叶片出现卷曲，老叶枯萎死亡，根系严重缺水，生长受阻，干枯且短(图9B)；而QXH0121虽然较对照幼苗也较矮小，但与QXN233相比，叶片宽大，茎粗壮，根系长且白亮(图9D)，生长态势明显优于QXN233，即受胁迫严重程度QXH0121<<QXN233(图9B和9D)。本实验验证了非耐盐性自交系QXN233对锌元素不敏感，高锌可使其严重受害；而耐盐性自交系QXH0121对锌较为敏感，可较强的耐受一定程度的高锌胁迫。

本实验初步表明玉米自交系的盐耐性和锌敏感性是呈现一致的，因此，可通过判断玉米自交系对锌的敏感程度，即是否具有“花白叶”表现来间接判断对盐的耐受程度。另外，据此，我们也推测，耐盐性的自交系对缺锌应该较为敏感，而高锌应该能缓解一定的盐胁迫症状。于是，我们进一步通过实验对此进行了后期验证。

2.2后期验证：

在高18cm、直径23cm的花盆里，填充适宜的普通园艺用蛭石(高度14cm)，首次浇透Hongland营养液，将萌发良好一致的玉米非耐盐性自交系QXN233和耐盐性自交系QXH0121幼苗小心移栽入盆内，以后每隔3-5天浇1次新鲜营养液(400ml/每盆)。

待玉米幼苗长到三叶一心期(约2周)，分别进行锌胁迫处理以及盐和锌胁迫共同处理，具体为：

锌处理组设4个梯度，分别为0μM、1μM(正常)、20μM、50μM ZnSO₄，其中1μM是表1中正常Hongland营养液中的Zn²⁺浓度；

各个锌梯度分别和200mM NaCl组合，做共同处理组，即为200mM NaCl+0μM Zn²⁺、200mM NaCl+1μM Zn²⁺、200mM NaCl+20μM Zn²⁺、200mM NaCl+50μM Zn²⁺。

这样处理1月后，可明显看出：

Zn²⁺浓度为0μM(即缺锌)下，耐盐性自交系QXH0121长势明显不如非耐盐性自交系QXN233，QXH0121叶片焦枯，根系较少，极为不发达，相反，QXN233能保持较良好的生长状态，尤其根系生长较长且密度大，因此，耐盐性自交系QXH0121对缺锌较非耐盐性自交系QXN233更加敏感。

随着Zn²⁺浓度的升高，20μM Zn²⁺对QXN233已造成严重胁迫，根系失水变短，地上部枯萎几近死亡；当Zn²⁺升至50μM时，QXN233已完全死亡，表明QXN233不耐高锌胁迫，即0μM>20μM>50μM(图10A)。

但是，耐盐性自交系QXH0121呈现相反的生长状态，随着Zn²⁺浓度的升高，QXH0121的生长表现越来越好(0μM<20μM<50μM)，较QXN233更上一筹(图10B)，这是与其充足的锌水平相一致的，表明一定范围内，充足的锌能较快促进耐盐性自交系QXH0121的生长。

进一步通过实验表明：

200mM NaCl处理下，非耐盐性自交系QXN233玉米幼苗长势0μM>1μM>20μM>50μM(图11A和11B)；

相反地，200mM NaCl处理下，耐盐性自交系QXH0121玉米幼苗长势0μM<1μM<20μM<50μM(图11C和11D)。

二者在盐+锌组合下的生长态势是与单独在锌胁迫处理下的生长态势是一致的。

因此，本实验的结果表明：

对非耐盐性自交系QXN233而言，锌的补给不能缓解或提高其耐盐性，高锌甚至加重了其盐胁迫；

而对于耐盐性自交系QXH0121，充足的锌元素能够缓解或提高其耐盐性，如营养液中增添至20或50μM Zn²⁺能够明显缓解200mM NaCl的盐胁迫伤害作用。

所以，本实验证实了我们的推测，耐盐性的玉米自交系对缺锌较为敏感，而高锌能缓解一定的盐胁迫症状，这可能与较高的Zn²⁺浓度加快了玉米幼苗的生长，促使玉米整株体积增大(图11C)，有效稀释了植株体内的盐分有关。

本发明只能先进行缺磷胁迫处理再进行锌胁迫处理，不能先进行缺锌胁迫处理再进行磷胁迫处理，因为先进行缺磷胁迫处理再进行锌胁迫处理中，经过缺磷胁迫处理后的玉米幼苗先被正常配比含量的Pi修复，消除磷元素对玉米幼苗生产的影响因素，接着被较正常配比含量更高的Zn²⁺进行锌胁迫处理，此时，耐盐性玉米幼苗会由缺磷胁迫处理下的生长较坏变得生长较好，非耐盐性玉米幼苗会由缺磷胁迫处理下的生长较好变得生长较坏，二者都存在这样一个明显的长势反转过程，变化明显，使得耐盐性与非耐盐性很容易分辨，一目了然；而如果反过来，先进行缺锌胁迫处理再进行磷胁迫处理，此时需要用包含正常配比含量的Zn²⁺以及较正常配比含量更高的Pi的营养液进行磷胁迫处理，经过缺锌胁迫处理后的玉米幼苗先被正常配比含量的Zn²⁺修复，消除锌元素对玉米幼苗生产的影响因素，接着被较正常配比含量更高Pi的进行磷胁迫处理，此时，耐盐性玉米幼苗会由缺锌胁迫处理下的生长较坏变得生长较好，非耐盐性玉米幼苗会由缺锌胁迫处理下的生长较好依旧保持生长较好，与上述相比，至少非耐盐性玉米幼苗在先进行缺锌胁迫处理再进行磷胁迫处理的整个过程中，长势没有明显的变化，不易分辨，如此就使得整个苗期玉米耐盐性的筛选鉴定的精确性不如先进行缺磷胁迫处理再进行锌胁迫处理的那么高。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种苗期玉米耐盐性的筛选鉴定方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1

一种苗期玉米耐盐性的筛选鉴定方法，

首先将8个待筛选鉴定的玉米品种(分别命名为：121、134、137、138、141、142、143、233)的萌发良好一致的幼苗进行正常的液体培养，等玉米幼苗长到三叶一心期后，对全部待筛选鉴定的玉米品种的幼苗均进行0mM Pi的缺磷胁迫处理，处理35天后，观察幼苗长势特征，根据玉米幼苗否有缺磷症状，即叶片是否表现出“紫红叶”或出现“暗红色”来判断其是否耐盐，具有缺磷症状的玉米幼苗为耐盐玉米品种，未有缺磷症状的玉米幼苗为非耐盐玉米品种，如图12所示，可得8个待筛选鉴定的玉米品种中的121、141、137和138为耐盐玉米品种，其中的134、142、143和233为非耐盐玉米品种。

根据玉米幼苗缺磷症状的严重程度来判断相应的玉米品种的耐盐性的高低，玉米幼苗的缺磷症状越严重表征相应的玉米品种的耐盐性越高，根据测定的缺磷(0mM Pi)胁迫处理35天后各品种的花青素含量(图13)，可判断上述8种玉米的缺磷敏感性顺序为121>138>137>141>134>142>143>233，因而推测这些玉米品种的耐盐性应为121>138>137>141>134>142>143>233。

然后，对全部缺锌胁迫处理后的上述8种玉米品种的幼苗均再进行锌胁迫处理，所用营养液中的Zn²⁺浓度为20μM，所用营养液中的Pi浓度为1mM，处理2-3周后，根据玉米幼苗的长势变化来进一步验证判断其是否耐盐，锌胁迫处理前后长势由好转坏的玉米幼苗为不耐盐玉米品种，锌胁迫处理前后长势由坏转好的玉米幼苗为耐盐玉米品种，可得8个待筛选鉴定的玉米品种中的121、141、137和138为耐盐玉米品种，其中的134、142、143和233为非耐盐玉米品种。

接下来，对这些品种进行100mM NaCl胁迫处理，通过采用检测盐胁迫下植株幼苗的产生的丙二醛(MDA)含量的方法对上述耐盐性大小顺序结果进行验证，MDA含量越高表明细胞膜损伤程度越大，同时表征耐盐性越低，100mM NaCl胁迫下，水培处理5天后，实验结果如图14和15所示，由此，这些玉米品种的耐盐性确实为121>138>137>141>134>142>143>233。

本发明未详尽描述的方法和装置均为现有技术，不再赘述。

本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。