本发明涉及生物
技术领域：
，具体是涉及一种在镉诱导下，利用植株早期的镉吸收相关基因mrna的表达变化筛选富镉能力强的芸薹属植物的方法，该方法可以用于芸薹属植物吸镉能力的种质资源鉴定。
背景技术：
：随着金属矿山的采冶，肥料和农药的大量使用，导致了目前许多土壤受到不同程度的镉污染。植物修复重金属污染的土壤是一种比较可行的方法，利用超积累植物来吸收中度或轻度污染土壤中的镉，收获植物并处理，从而降低土壤中镉的含量，达到土壤安全利用的目的。已有的报道表明，部分十字花科植物对镉有很强的富集能力，如发现印度芥菜对镉有很强的耐受和富集能力，且生物量大，但印度芥菜的生长和分布有很强的地域性，很难大规模推广。芸薹属植物种质资源丰富，分布广，其中某些品种或品系在累积镉的能力很强，甚至超过印度芥菜。我们在前期的研究中，通过转录组测序分析发现，芸薹属植物在镉胁迫下，一些基因的mrna表达量的增加与植株富集镉的能力呈正相关，通过ncbi-blast发现，这些基因与植物吸收镉的生物途径密切相关，因此可以利用这些基因的表达变化来评价植物富集镉的能力，通过定量pcr来检测植物在镉诱导下这些基因的表达变化来评价植物对镉的吸收能力，从而到达快速选择高富集镉植物的目的。全基因组测序表明了芸薹属各物种（如：白菜、甘蓝、甘蓝型油菜和芥菜型油菜等）之间基因序列的相似性比较高，因此，在一定浓度的镉处理下，可以利用定量pcr来测定芸薹属植物中与镉吸收呈正相关的基因的表达变化来选择镉富集能力强的芸薹属植物。芸薹属植物生物量大，其中大部分种类耐旱和耐盐碱，是重金属污染植物修复的重要候选植物，通过该方法可以快速筛选用于修复重金属中低度污染土壤的芸薹属植物。技术实现要素：本发明针对芸薹属植物镉吸收分子机制的相关信息较少，提供一种快速筛选高富集镉的芸薹属植物的基因，本发明还提供一种早期镉胁迫下利用基因的mrna表达变化筛选富集镉芸薹属植物的方法。本发明的技术方案：一种快速筛选高富集镉的芸薹属植物的基因，其引物的具体序列如下：u-镉-1：f:5'-tacggtacacgctttaggtta-3'r:5'-taatgggtctattgagtggtg-3'u-镉-2：f:5'-acggagttgttgacggatgaa-3'r:5'-atggaggttgtatttgtaagaagca-3'u-镉-3：f:5'-ttcgactacagaggaaatccacctt-3'r:5'-taatgggtctattgagtggtg-3'u-镉-4：f:5'-caacagattcagaactgcgagat-3'r:5'-ggagaaagcgtgagaaagagg-3'u-镉-5：f:5'-ttgctccttcacccacatttc-3'r:5'-ttccactaagagcccaagaca-3'u-镉-6：f:5'-acgaccgctccaggtttgccttac-3'r:5'-gcatccgcaccacgcttctca-3'所述f为上游引物，r为下游引物。一种快速筛选高富镉芸薹属植物的方法，包括如下步骤:（1）以芥菜型油菜的种子为材料，表面灭菌，接种于常规ms固体培养基上培养；设置对照组和处理组，处理组含镉为30mg·kg-1，对照组不含镉，置于温室中生长；然后从处理组和对照组的芥菜型油菜根和叶中提取总rna，进行转录组测序分析，获得表达量在根和叶中同时增加2.00倍以上mrna序列所对应的基因，在这些基因保守区设计引物；（2）定量pcr分析mrna序列所对应的基因表达量的变化与镉富集的相关性：取芥菜型油菜的种子，灭菌后，接种于不同镉浓度的常规ms固体培养基上培养，然后取各培养基上的植株，测定各处理组根部和叶片的镉含量，分别提取根部和叶片的总rna，反转录后进行定量pcr实验，同时以actin基因为参照基因，重复多次；（3）确定富镉基因：根据定量pcr检测基因表达量和镉含量测定的结果，与对照组相比，找到在所有的处理组根和叶中表达量都增加了2.00倍以上的基因，确定这些基因为富镉基因，扩增这些基因的引物如下：u-镉-1：f:5'-tacggtacacgctttaggtta-3'r:5'-taatgggtctattgagtggtg-3'u-镉-2：f:5'-acggagttgttgacggatgaa-3'r:5'-atggaggttgtatttgtaagaagca-3'u-镉-3：f:5'-ttcgactacagaggaaatccacctt-3'r:5'-taatgggtctattgagtggtg-3'u-镉-4：f:5'-caacagattcagaactgcgagat-3'r:5'-ggagaaagcgtgagaaagagg-3'u-镉-5：f:5'-ttgctccttcacccacatttc-3'r:5'-ttccactaagagcccaagaca-3'u-镉-6：f:5'-acgaccgctccaggtttgccttac-3'r:5'-gcatccgcaccacgcttctca-3'所述f为上游引物，r为下游引物；（4）利用富镉基因的引物检测在镉浓度为10-50mg·kg-1的ms培养基上培养多天的芸薹属植株的根和叶中基因表达的变化；（5）作出结论：富镉基因在根和叶中的表达量比对照都增加2.00倍以上的芸薹属植物属于高富镉的植物。作为优选，步骤（1）中的处理组和对照组置于温室中生长30天，日夜长比为16/8h，日夜温为22/16℃，光照强度为250μmolm-2s-1。作为优选，步骤（2）中常规ms固体培养基的镉浓度分别为0，10，20，30，40，50mg·kg-1，日夜长比为16/8h，日夜温为22/16℃，光照强度为200μmolm–2s–1培养15天。作为优选，步骤（4）中所述芸薹属植株在常规ms培养基上培养15天，日夜长比为16/8h，日夜温为22/16℃，光照强度为200μmolm–2s–1。作为优选，其特征在于，步骤（1）中采用高通量测序技术平台进行转录组深度测序；利用软件primerpremier5.0在基因保守区设计引物。本发明的有益效果：本发明以镉诱导下表达上调的镉吸收基因序列为基础，设计引物，建立了反转录-定量pcr技术体系，在此基础上进行优化，建立了利用镉诱导下检测基因mrna的变化来快速选择高富集镉的芸薹属植物的方法，此方法快速、敏感和特异性强，节约了鉴定的时间和费用，提高了芸薹属植物富镉性状的鉴定效率，具有很好的应用价值。具体实施方式实施例1一种快速筛选高富镉芸薹属植物的方法，包括如下步骤:1）以原子光谱吸收法确定的高富集镉的芥菜型油菜为材料，取饱满的种子，用升汞表面灭菌后，用无菌吸水纸吸干种子表面的水分，接种于常规ms固体培养基培养基上。设置对照和处理，处理组镉浓度为30mg·kg-1，对照组不含镉，日夜长比为16/8h，日夜温为22/16℃，光照强度为250μmolm-2s-1，在温室中生长30天。提取处理和对照组芥菜型油菜的根和叶的总rna，采用高通量测序技术平台进行转录组深度测序，去除平均质量值小于20的读段，得到可用读段，然后对可用读段进行denovo拼接后组装得到芥菜型油菜混合转录组库，通过数据分析，得出差异表达的mrna序列，选取表达量在根和叶中同时增加2.00倍以上mrna序列和对应的基因，结合芸薹属植物已公布的同源基因的序列，利用软件primerpremier5.0在基因保守区设计引物，以actin基因为表达参照基因并设计引物，为下一步的定量pcr分析这些基因表达量的变化与镉富集的相关性备用。2）取上述芥菜型油菜的种子，用升汞表面灭菌后，用无菌吸水纸吸干种子表面的水分，接种于常规ms固体培养基培养基上。取在常规ms培养基上，镉浓度水平分别为0、10、20、30、40和50mg·kg-1，日夜长比为16/8h，日夜温为22/16℃，光照强度为200μmolm–2s–1培养15天的植株。测定各处理组根部和叶片的镉含量，分别提取根部和叶片的总rna，反转录后进行定量pcr实验，同时以actin基因为参照基因，重复3次。3）根据定量pcr检测基因mrna表达量和镉含量测定的结果，与对照相比，找到了6个基因在所有的处理组根和叶中表达量都增加了2.00倍以上，且这些基因表达量与镉富集量的相关系数在0.95以上，二者并呈现极显著正相关，因此确定这些基因为富镉基因，扩增这些基因的引物序列如表1。表1富集镉基因和actin基因引物引物名称上游引物下游引物u-镉-15'-tacggtacacgctttaggtta-3'5'-taatgggtctattgagtggtg-3'u-镉-25'-acggagttgttgacggatgaa-3'5'-atggaggttgtatttgtaagaagca-3'u-镉-35'-ttcgactacagaggaaatccacctt-3'5'-cgtcagccaagaaaccaccaa-3'u-镉-45'-caacagattcagaactgcgagat-3'5'-ggagaaagcgtgagaaagagg-3'u-镉-55'-ttgctccttcacccacatttc-3'5'-ttccactaagagcccaagaca-3'u-镉-65'-acgaccgctccaggtttgccttac-3'5'-gcatccgcaccacgcttctca-3'actin5'-agatgcctgatggacaagtga-3'5'-ccaatcatagactgctggtaaag-3'4）利用上述引物检测基因表达变化评价芸薹属植物富镉能力。取在常规ms培养基上，镉浓度水平为10-50mg·kg-1，日夜长比为16/8h，日夜温为22/16℃，光照强度为200μmolm–2s–1培养15天的芸薹属植物的植株。分别提取植株根部和叶片的总rna，反转录后，以actin基因的表达为参照，进行定量pcr实验，重复3次，取平均数。定量pcr扩增的反应条件和结果分析按常规的方法进行。作出结论:如果引物u-镉-1、u-镉-2、u-镉-3、u-镉-4、u-镉-5和u-镉-6检测的基因在处理组芸薹属植物的根部和叶片比对照组都显著增加2.00倍以上，则可以判定该芸薹属植物材料是具有很强的镉富集能力，可以作为镉的高富集植物。实施例2确定镉诱导下芥菜型油菜根和叶中表达量同时增加的富镉基因的引物。选取已确定的高富集镉的芥菜型油菜为材料，取饱满的种子，用升汞表面灭菌后，用无菌吸水纸吸干种子表面的水分，接种于常规ms固体培养基培养基上。设置对照和处理，处理组镉浓度为30mg·kg-1，对照组不含镉，日夜长比为16/8h，日夜温为22/16℃，光照强度为250μmolm-2s-1，在温室中生长30天。提取处理和对照组芥菜型油菜的根和叶的总rna，采用高通量测序技术平台进行转录组深度测序，去除平均质量值小于20的读段，得到可用读段，然后对可用读段进行denovo拼接后组装得到芥菜型油菜混合转录组库，通过数据分析，得出差异表达的mrna序列，选取表达量在根和叶中同时增加2.00倍以上mrna序列和对应的基因，结合芸薹属植物已公布的同源基因的序列，在基因保守区设计引物，同时以actin基因为参照基因并设计引物，引物序列为：正向引物5'-agatgcctgatggacaagtga-3'，反向引物：5'-ccaatcatagactgctggtaaag-3'。取上述芥菜型油菜的种子，用升汞表面灭菌后，用无菌吸水纸吸干种子表面的水分，接种于常规ms固体培养基上。取在常规ms培养基上，镉浓度水平分别为0、10、20、30、40、50mg·kg-1，日夜长比为16/8h，日夜温为22/16℃，光照强度为200μmolm–2s–1培养15天的植株。测定各处理芥菜型油菜根部和叶片的镉含量，分别提取芥菜型油菜根部和叶片的总rna，反转录后进行定量pcr实验，同时以actin基因为参照基因，重复3次。根据定量pcr检测基因mrna表达量的结果，与对照相比，确定了6个基因在所有的处理组中根和叶中表达量都显著增加2.00倍以上，这些基因表达量与镉富集量的相关系数在0.95以上且二者呈现显著正相关，因此确定这些基因为富镉基因，以这些基因表达是否上调2.00倍以上来评价芸薹属植物的富镉能力。所述芥菜油菜镉诱导下在根和叶中表达量显著上调6个基因的引物（上游引物简称f，下游引物简称r）具体序列如下：u-镉-1：f：5'-tacggtacacgctttaggtta-3'r:5'-taatgggtctattgagtggtg-3'u-镉-2：f：5'-acggagttgttgacggatgaa-3'r:5'-atggaggttgtatttgtaagaagca-3'u-镉-3：f：5'-ttcgactacagaggaaatccacctt-3'r:5'-taatgggtctattgagtggtg-3'u-镉-4：f：5'-caacagattcagaactgcgagat-3'r:5'-ggagaaagcgtgagaaagagg-3'u-镉-5：f：5'-ttgctccttcacccacatttc-3'r:5'-ttccactaagagcccaagaca-3'u-镉-6：f：5'-acgaccgctccaggtttgccttac-3'r:5'-gcatccgcaccacgcttctca-3'实施例31）以原子吸收光谱法测定确定的高富集镉的芥菜型油菜材料，其镉的富集能力如下，在镉浓度为20mg·kg-1的ms培养基中培养15天，其植株体内的平均富集镉浓度达到217.2mg·kg-1。2）取上述芥菜型油菜的种子，用升汞表面灭菌后，用无菌吸水纸吸干种子表面的水分，接种于常规ms固体培养基培养基上，设置对照组和处理组，镉浓度分别为0、20mg·kg-1。在日夜长比为16/8h，日夜温为22/16℃，光照强度为200μmolm–2s–1的条件下培养15天，提取上述芥菜型油菜根部和叶片的总rna，反转录后进行定量pcr实验，同时以actin基因为参照基因，重复3次，取平均数。定量pcr扩增的反应条件和结果分析按常规的方法进行。3）基因表达变化分析。采用定量pcr对实施例1中的提供的引物进行基因表达的检测，结果如表2。表220mg·kg-1镉处理对芥菜型油菜富镉基因表达量的影响4）当ms培养基中镉浓度为20mg·kg-1，与对照相比，高富集镉的芥菜型油菜材料在镉诱导下6个富镉基因的表达量在根和叶中都增加了2.00倍以上。实施例4以湖南某尾矿周围的镉污染土壤生长的甘蓝型油菜的种子为材料。种子表面灭菌后，用无菌吸水纸吸干种子表面的水分，接种于常规ms固体培养基培养基上，设置对照组和处理组，镉浓度分别为0、50mg·kg-1。在日夜长比为16/8h，日夜温为22/16℃，光照强度为200μmolm–2s–1的条件下培养15天，提取上述甘蓝型油菜根部和叶片的总rna，反转录后进行定量pcr实验，同时以actin基因为参照基因，重复3次，取平均数。定量pcr扩增的反应条件和结果分析按常规的方法进行。利用定量pcr法对实施例1中的提供的引物进行基因表达的检测，结果如表3。表350mg·kg-1镉处理对甘蓝型油菜富镉基因表达量的影响根据表3的结果，当ms培养基中镉浓度为50mg·kg-1，所选择的甘蓝型油菜的根和叶中这6个富镉基因的表达量比对照的增加了2.00倍以上。通过原子吸收光谱仪测定，该材料镉的富集能力如下，在本实施例中的培养条件下培养15天，其植株体内的平均富集镉浓度达到451.2mg·kg-1，符合高富集镉植物的标准。实施例5以湖南某尾矿周围的镉污染土壤生长的白菜的种子为材料。种子表面灭菌后，用无菌吸水纸吸干种子表面的水分，接种于常规ms固体培养基培养基上，设置对照组和处理组，镉浓度分别为0、40mg·kg-1。在日夜长比为16/8h，日夜温为22/16℃，光照强度为200μmolm–2s–1的条件下培养15天，提取上述白菜根部和叶片的总rna，反转录后进行定量pcr实验，同时以actin基因为参照基因，重复3次，取平均数。定量pcr扩增的反应条件和结果分析按常规的方法进行。采用定量pcr对实施例1中的提供的引物进行基因表达的检测，结果如表4。表440mg·kg-1镉处理对白菜富镉基因表达量的影响根据表4的结果，当ms培养基中镉浓度为40mg·kg-1，所选择的白菜的根和叶中这6个富镉基因的表达量比对照的增加了2.00倍以上。通过原子吸收光谱仪测定，该材料镉的富集能力如下，在本实施例中的培养条件下培养15天，其植株体内的平均富集镉浓度达到328.6mg·kg-1，符合高富集镉植物的标准。实施例6取从菜地收集的甘蓝种子为材料。种子表面灭菌后，用无菌吸水纸吸干种子表面的水分，接种于常规ms固体培养基培养基上，设置对照组和处理组，镉浓度分别为0、10mg·kg-1。在日夜长比为16/8h，日夜温为22/16℃，光照强度为200μmolm–2s–1的条件下培养15天，提取上述甘蓝根部和叶片的总rna，反转录后进行定量pcr实验，同时以actin基因为参照基因，重复3次，取平均数。定量pcr扩增的反应条件和结果分析按常规的方法进行。用定量pcr对实施例1中的提供的引物进行基因表达的检测，结果如表5。表510mg·kg-1镉处理对甘蓝富镉基因表达量的影响根据表5的结果，当ms培养基中镉浓度为10mg·kg-1，所选择的甘蓝的根和叶中这6个富镉基因的表达量比对照的增加了2.00倍以上。通过原子吸收光谱仪测定，该材料镉的富集能力如下，在本实施例中的培养条件下培养15天，其植株体内的平均富集镉浓度达到125.2mg·kg-1，符合高富集镉植物的标准。序列表：<>湖南科技大学<>dna<>芥菜型油菜（brassicajuncea）<>agatgcctgatggacaagtga<>dna<>芥菜型油菜（brassicajuncea）<>ccaatcatagactgctggtaaag<>dna<>芥菜型油菜（brassicajuncea）<>tacggtacacgctttaggtta<>dna<>芥菜型油菜（brassicajuncea）<>taatgggtctattgagtggtg<>dna<>芥菜型油菜（brassicajuncea）<>acggagttgttgacggatgaa<>dna<>芥菜型油菜（brassicajuncea）<>atggaggttgtatttgtaagaagca<>dna<>芥菜型油菜（brassicajuncea）<>ttcgactacagaggaaatccacctt<>dna<>芥菜型油菜（brassicajuncea）<>taatgggtctattgagtggtg<>dna<>芥菜型油菜（brassicajuncea）<>caacagattcagaactgcgagat<>dna<>芥菜型油菜（brassicajuncea）<>ggagaaagcgtgagaaagagg<>dna<>芥菜型油菜（brassicajuncea）<>ttgctccttcacccacatttc<>dna<>芥菜型油菜（brassicajuncea）<>ttccactaagagcccaagaca<>dna<>芥菜型油菜（brassicajuncea）<>acgaccgctccaggtttgccttac<>dna<>芥菜型油菜（brassicajuncea）<>gcatccgcaccacgcttctca<110>湖南科技大学<120>一种快速筛选高富集镉的芸薹属植物的基因及方法<160>14<210>1<211>21<212>dna<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）<400>1agatgcctgatggacaagtga21<210>2<211>23<212>dna<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）<400>2ccaatcatagactgctggtaaag23<210>3<211>21<212>dna<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）<400>3tacggtacacgctttaggtta21<210>4<211>21<212>dna<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）<400>4taatgggtctattgagtggtg21<210>5<211>21<212>dna<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）<400>5acggagttgttgacggatgaa21<210>6<211>25<212>dna<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）<400>6atggaggttgtatttgtaagaagca25<210>7<211>25<212>dna<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）<400>7ttcgactacagaggaaatccacctt25<210>8<211>21<212>dna<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）<400>8taatgggtctattgagtggtg21<210>9<211>23<212>dna<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）<400>9caacagattcagaactgcgagat23<210>10<211>21<212>dna<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）<400>10ggagaaagcgtgagaaagagg21<210>11<211>21<212>dna<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）<400>11ttgctccttcacccacatttc21<210>12<211>21<212>dna<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）<400>12ttccactaagagcccaagaca21<210>13<211>24<212>dna<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）<400>13acgaccgctccaggtttgccttac24<210>14<211>21<212>dna<213>芥菜型油菜（brassicajuncea）<400>14gcatccgcaccacgcttctca21当前第1页12