本发明涉及植物抗病毒基因工程领域，具体地，本发明涉及抗烟草脉带花叶病毒和马铃薯Y病毒新靶标PsbO1的筛选及其在抗病毒侵染中的应用。
背景技术：
：：病毒病是作物上的重要病害，给农业生产造成巨大损失。种植抗病品种是防治作物病毒病最经济有效的方法。近年的研究发现，植物也有“阿克琉斯的脚踝”。有些植物蛋白在病毒侵染中起关键作用，如果将编码这些蛋白的基因敲除，植物就会获得对病毒的抗性。马铃薯Y病毒属(Potyvirus)是植物病毒中最大的属，约占已知植物病毒种类的30％，寄主范围广泛，危害严重。马铃薯Y病毒属病毒与其他属多种病毒间存在协生作用，一旦复合侵染会引起更为严重的症状，造成更大损失。该属许多病毒的VPg可以和植物的真核生物翻译起始因子eIF4E互作；如果eIF4E发生突变或者编码基因被敲除，植株就可以产生对马铃薯Y病毒属病毒的抗性。烟草脉带花叶病毒(Tobaccoveinbandingmosaicvirus,TVBMV)和马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)都属于马铃薯Y病毒属，主要侵染马铃薯、烟草、番茄和辣椒等茄科作物。本发明通过免疫沉淀和质谱技术，获得了1个能与烟草脉带花叶病毒6K2互作的光系统Ⅱ放氧复合体蛋白PsbO1；降低PsbO1基因的表达可使植物产生对TVBMV和PVY的抗性。因此，PsbO1是一种新的抗病毒靶标。技术实现要素：本发明提供了一种植物抗马铃薯Y病毒属病毒的新靶标。首先，利用免疫沉淀技术和质谱技术鉴定到可能与TVBMV蛋白互作的寄主蛋白PsbO1；然后通过免疫共沉淀和双分子荧光互补试验证明PsbO1和TVBMV6K2互作；最后，利用病毒诱导的基因沉默技术将PsbO1基因沉默后，植株能抵抗TVBMV和PVY的侵染。本发明实施的具体技术方案是：A.与TVBMV蛋白潜在互作寄主蛋白的筛选。TVBMV的侵染性克隆中连入6K1GFP基因。通过农杆菌浸润法将该克隆接种到寄主植物本氏烟，7天后提取植物总蛋白。利用GFP抗体偶联的琼脂糖珠进行免疫沉淀，纯化6K1寄主互作蛋白复合体，SDS-PAGE分离蛋白，切取特异性蛋白条带。经质谱鉴定发现6K1互作蛋白复合体中含有PsbO1。b.PsbO1基因的获得：根据PsbO1序列设计特异性引物。提取植物总RNA,利用反转录PCR扩增PsbO1基因并测序验证。c.PsbO1和TVBMV6K1、6K2互作的验证：将PsbO1基因克隆到免疫共沉淀和双分子荧光互补载体,利用免疫共沉淀和双分子荧光互补验证其互作。d.PsbO1基因沉默对马铃薯Y病毒属病毒作用测定：将特定的PsbO1基因片段连接到TRV基因沉默载体，PsbO1沉默后再接种TVBMV或PVY。采用本发明所述的技术方案，可以获得如下的技术效果：1)获得了一种抗病毒靶标PsbO1；2)降低PsbO1基因表达可使植株抗马铃薯Y病毒属病毒的侵染。附图说明图1PsbO1和TVBMV6K1、6K2互作的验证a：CO-IP实验证明PsbO1可以和TVBMV6K2直接互作，但不能与TVBMV6K1直接互作，PsbO1通过6K2与6K1间接互作；b：BiFC实验证明PsbO1可以和TVBMV6K2直接互作。图2PsbO1基因沉默后接种TVBMV第6天的症状、荧光分布和病毒积累水平a：PsbO1基因沉默后可抑制TVBMV侵染；b：本氏烟PsbO1基因沉默后，植株阻碍了病毒的系统移动和复制；c：PsbO1基因沉默效果；d：PsbO1基因沉默对TVBMV复制水平的影响；e：PsbO1基因沉默TVBMV病毒粒子积累的影响。图3PsbO1基因沉默后接种PVY第10天的症状、荧光分布和病毒积累水平a：本氏烟PsbO1基因沉默后，植株阻碍了PVY的系统移动和复制；b：PsbO1基因沉默效果；c：PsbO1基因沉默对PVY复制水平的影响；d：PsbO1基因沉默PVY病毒粒子积累的影响。具体实施方式以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如下表：F代表正向引物，R代表反向引物。利用表中引物可以分别扩增PsbO1编码区全长和用于病毒诱导基因沉默的片段。实施例1：免疫沉淀取TVBMV-GFP或TVBMV-6K1GFP侵染7天后的本氏烟叶片，在研钵中加入液氮充分研磨至粉末状，加入ExtractionBuffer提取植物总蛋白。ExtractionBuffer组成成分如下：50mMTris-Cl,pH7.5,150mMNaCl,10％[v/v]glycerol,0.5％[v/v]NonidetP-40,1tabletproteaseinhibitorcocktail4℃,20000g离心10min，取上清液加入GFP抗体偶联的琼脂糖珠，4℃孵育3小时，用不含NonidetP-40的ExtractionBuffer洗5次，加入2×SDS上样缓冲液，沸水中煮10分钟，SDS-PAGE电泳分离各蛋白条带。将蛋白条带切下送上海基云生物技术公司进行质谱鉴定。结果表明，有4个肽段和PsbO1同源，说明通过免疫沉淀筛选到的6K1GFP蛋白复合体中存在PsBO1。实施例2：基因扩增以植物总RNA为模板，利用反转录PCR扩增PsbO1基因。所用反转录酶为M-MLV,DNA聚合酶为Phusion高保真聚合酶。反转录反应体系如下：PCR反应体系如下：得到的PsbO1基因长999bp，其序列如SeqIDNo.7所示，编码的氨基酸序列SeqIDNo.8所示。实施例3：PsbO1和TVBMV6K1、6K2互作的验证6K1和6K2可以相互作用。6K1GFP复合体中存在的PsbO1可能与6K1直接互作，也可能与6K2直接互作，通过6K2与6K1间接互作。将PsbO1、TVBMV6K1和6K2基因分别克隆到免疫共沉淀载体pCam35S:HA和pCam35S:GFP,双分子荧光互补载体pYN和pYC。将重组的免疫共沉淀载体转化农杆菌后，浸润本氏烟叶片。3天后提取植物总蛋白，加入GFP抗体偶联的琼脂糖珠进行免疫沉淀。利用HA抗体通过Westernblot检测蛋白互作。PsbO1与6K2发生免疫共沉淀反应，而与6K1发生免疫共沉淀反应(图1，a)，说明PsbO1与6K2能直接互作，而与6K1无直接互作。将重组的双分子荧光互补载体转化农杆菌后，浸润本氏烟叶片。2天后取叶片表皮层在激光扫描共聚焦显微镜下观察荧光。用波长为514nm的氩离子激光激发，在530-600nm波长处检测YFP荧光。结果表明，PsbO1只与6K2共同表达发出黄色荧光(图1，b)，证明PsbO1在体内也可以与6K2相互作用。实施例4：PsbO1基因沉默对TVBMV和PVY侵染的影响将PsbO1基因克隆到病毒沉默载体TRV的RNA2后接种本氏烟，然后将病毒载体TRV1,TRV2和TRV2-PsbO1分别转化农杆菌GV3101。经菌落PCR验证后，挑单斑接种于含有卡那霉素(50μg/mL)、利福霉素(50μg/mL)、四环素(50μg/mL)的液体LB培养基中。取500μL菌液加至5mL含10mmol/L2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES)和20μmol/L乙酰丁香酮(AS)及上述三种抗生素的LB培养基中，28℃振荡培养至对数生长期。离心收集菌体并重新悬浮于10mmol/LMgCl2，10mmol/LMES，150μmol/LAS中，调整浓度使其OD600为1.0左右，室温静置3小时。取1mL一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液。将携带TRV1和TRV2，或TRV1和TRV2-PsbO1的农杆菌按照1∶1的比例浸润本氏烟。每株浸润2片叶。浸润的植株置于23℃光照培养箱中培养(16小时光照/8小时黑暗交替)。每个处理接种10棵本氏烟，重复3次。14天后，摩擦接种TVBMV-GFP或PVY-GFP。TVBMV-GFP在对照本氏烟植株(烟草脆裂病毒空载体TRV1和TRV2侵染)系统叶上引起明显的花叶症状，而在PsbO1沉默的本氏烟植株(TRV1和TRV2-PsbO1侵染)系统叶几乎不表现症状(图2，a和b)。紫外灯下，TVBMV-GFP在对照本氏烟系统叶上有强烈的绿色荧光，而在在PsbO1沉默的本氏烟上只有点状荧光(图2，a和b)。荧光定量PCR结果表明，在PsbO1基因沉默的本氏烟上(图2，c；图3，b)，TVBMV基因组RNA的积累水平叶显著下降(图2，d)。免疫印迹实验结果表明，TVBMV外壳蛋白(coatprotein，CP)表达量显著降低(图2，e)。PVY-GFP在对照本氏烟植株(烟草脆裂病毒空载体TRV1和TRV2侵染)系统叶上引起明显的花叶症状，而在PsbO1沉默的本氏烟上无明显症状(图3，a和b)。紫外灯下，PVY-GFP在对照本氏烟系统叶上有强烈的绿色荧光，而在在PsbO1沉默的本氏烟上只有点状荧光(图3，a和b)。荧光定量PCR结果表明，在PsbO1基因沉默的本氏烟上，PVY的基因组RNA的积累水平叶显著下降(图3，c)。免疫印迹实验结果表明，PVYCP表达量也显著降低(图3，d)。以上结果表明，降低PsbO1基因的表达量可使植物抵抗烟草脉带花叶病毒和马铃薯Y病毒的侵染。<110>山东农业大学<120>一种植物抗病毒基因的筛选与应用<160>15<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1ATGGCTGTCTCTTTACAAGCAG22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2TCATTCAAGTTGGGCATACCAG22<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>3GCTCTAGACCCCAGATTTCCAGAAAACTAAG32<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>4CGGGATCCCACATCCTTGGGGACCTTTG28<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>5GCTCTAGAATGGCTGTCTCTTTACAAGCAG30<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>6CGGGATCCTTCAAGTTGGGCATACCAG27<210>7<211>999<212>DNA<213>PsbO1基因序列<400>7ATGGCTGTCTCTTTACAAGCAGCTGCTACTCTTATGCAACCAACAAAGGTTGGTGTTGCC60CCAGCTAGAAACAACCTGCAGTTGAGGTCTGCTCAAAGTGTGTGCAAAGCATTTGGTGTT120GAACCAGCTGCAGCTAGGCTTACTTGCTCTTTGCAAACTGAACTCAAGGACTTGGCTCAA180AAGTGCACTGATGCTGCGAAGGTTGCTGGTTTTGCTCTGGCCACTTCCGCCCTTGTCGTC240TCAGGAGCAAATGCTGAAGGAGCTCCAAAACGTCTAACCTTCGACGAAATTCAAAGCAAG300ACATACATGGAAGTAAAGGGAACTGGAACTGCTAACCAGTGCCCTACCATAGAAGGAGGT360GTTGCCAGCTTTGCCTTCAAGCCAGGCAAATACAATGCCAAGAAATTCTGCTTAGAGCCC420ACATCATTCACGGTCAAGGCAGAGAGTGTGAACAAGAATGCACCCCCAGATTTCCAGAAA480ACTAAGCTCATGACACGCTTAACCTACACCCTTGATGAGATTGAGGGACCATTCGAAGTG540TCTTCTGATGGCACTGTTAAGTTTGAGGAGAAGGATGGAATTGATTATGCTGCTGTTACA600GTTCAGCTTCCTGGTGGTGAGCGTGTGCCCTTCCTCTTCACTATCAAACAGCTAGTGGCA660AGCGGCAAACCAGAAAGCTTTAGCGGTGAATTCCTTGTGCCATCATACAGAGGTTCATCC720TTCCTTGACCCAAAGGGACGGGGTGGATCTACTGGCTATGACAACGCTGTTGCACTGCCT780GCTGGAGGGAGAGGAGACGAGGAGGAGCTTGAGAAGGAGAACGTAAAGAATACTGCATCT840TCTACAGGAAAAATCACCCTGAGTGTTACCCAGAGCAAGCCAGAGACCGGTGAGGTCATT900GGAGTATTTGAGAGCATCCAGCCATCTGATACTGATCTCGGTGCAAAGGTCCCCAAGGAT960GTGAAAATCCAGGGTATCTGGTATGCCCAACTTGAATGA999<210>8<211>332<212>PRT<213>PsbO1蛋白序列<400>8METAlaValSerLeuGlnAlaAlaAlaThrLeuMETGlnProThr15LysValGlyValAlaProAlaArgAsnAsnLeuGlnLeuArgSer30AlaGlnSerValCysLysAlaPheGlyValGluProAlaAlaAla45ArgLeuThrCysSerLeuGlnThrGluLeuLysAspLeuAlaGln60LysCysThrAspAlaAlaLysValAlaGlyPheAlaLeuAlaThr75SerAlaLeuValValSerGlyAlaAsnAlaGluGlyAlaProLys90ArgLeuThrPheAspGluIleGlnSerLysThrTyrMETGluVal105LysGlyThrGlyThrAlaAsnGlnCysProThrIleGluGlyGly120ValAlaSerPheAlaPheLysProGlyLysTyrAsnAlaLysLys135PheCysLeuGluProThrSerPheThrValLysAlaGluSerVal150AsnLysAsnAlaProProAspPheGlnLysThrLysLeuMETThr160ArgLeuThrTyrThrLeuAspGluIleGluGlyProPheGluVal180SerSerAspGlyThrValLysPheGluGluLysAspGlyIleAsp195TyrAlaAlaValThrValGlnLeuProGlyGlyGluArgValPro210PheLeuPheThrIleLysGlnLeuValAlaSerGlyLysProGlu225SerPheSerGlyGluPheLeuValProSerTyrArgGlySerSer240PheLeuAspProLysGlyArgGlyGlySerThrGlyTyrAspAsn255AlaValAlaLeuProAlaGlyGlyArgGlyAspGluGluGluLeu270GluLysGluAsnValLysAsnThrAlaSerSerThrGlyLysIle285ThrLeuSerValThrGlnSerLysProGluThrGlyGluValIle300GlyValPheGluSerIleGlnProSerAspThrAspLeuGlyAla315LysValProLysAspValLysIleGlnGlyIleTrpTyrAlaGln330LeuGlu***当前第1页1 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