一种快速显色一步法检测猪细小病毒的LAMP试剂盒的制作方法

本发明涉及一种快速显色一步法检测猪细小病毒的LAMP试剂盒。

背景技术：

猪细小病毒porcine parvovirus (PPV)会导致母猪和育肥猪的繁殖障碍，是给猪场带来严重经济损失的最常见的猪繁殖障碍性病毒之一，目前仍然在我国猪场广泛流行。由于我国大部分猪场，尤其是大规模养殖场，广泛采用PPV型灭活疫苗接种猪只，使得采用ELISA等血清学方法基本无法区分感染和免疫。所以，普查或者诊断PPV的感染主要依赖于基于检测核酸存在的各种诊断方法。常见的PPV核酸诊断方法包括常规PCR、实时定量PCR和原位杂交，这些方法由于受特殊仪器和对操作人员高水平要求的限制，主要在各种实验室使用。目前，针对PPV感染的猪场现场诊断方法还在研制中，没有相应的商品化产品问世。

本申请人在2009年建立了针对PPV型的LAMP诊断方法（Chen et al,2009)，该方法针对VP2基因设计了4条特异性引物，扩增产物可以采用在琼脂糖凝胶电泳形成的典型梯形条带检测，也可以在反应结束后，打开反应管盖子加入SYBR Green或者含有钙黄素和锰离子的预混荧光染料，根据反应管颜色的变化，判断待检样品的PPV感染的有无。添加SYBR Green染料后阳性反应管可形成棕色颜色，能够肉眼观察识别，但是棕色不如加入钙黄素预混染料形成的明亮绿色易于观察。含钙黄素的荧光染料会在一定程度上抑制Bst聚合酶，所以，在反应管直接加入这些染料，会导致扩增产物量下降，在琼脂糖凝胶电泳上很难形成典型的梯形条带，也很难观察到反应管荧光的改变。在反应结束后再加入荧光染料进行观察判断的二步法，不仅操作繁琐，更主要的问题是在打开反应管盖子时，扩增产物被释放到空气中，形成了大量的气溶胶，再次进行LAMP检测时，假阳性率就会大大增加。为了简化操作步骤，最大可能性地降低假阳性率，满足猪场现场检测以及广大养殖业者能够自行诊断的需求，需要进一步进行改进。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种快速显色一步法检测猪细小病毒的LAMP试剂盒，该试剂盒包括提供用于检测猪细小病毒的特异性LAMP引物组，共六条引物。

本发明提供用于检测猪细小病毒的特异性LAMP引物组，所述引物组为以下六条引物：

F3：5'-gCACACgCATCAAgACTCATAC-3'，

B3：5'-TggTggTgAggTTgCTgATTC-3'，

FIP：5'-gCATCgTCTTgTACCATTTgTCCCTgCCAgAACACgAAACATACAA-3'，

BIP：5'-CCTTggTCACTAATAgATgCTAACgCAgTTTATTTCTgTCATgTTgTTggA-3'，

FLoop：5'-TAAATTCAgAATCAggggTggC-3'，

BLoop：5'-gCCAgTCCgCTggATTgAA-3'。

本发明还提供一种快速显色一步法检测猪细小病毒的LAMP试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。

作为优选，还包括含有钙黄素和锰离子的荧光染料。

作为优选，所述荧光染料的用量为在25μL检测体系中含有0.4-1.0μL。

作为优选，所述试剂盒构成LAMP检测体系；25μL检测体系的具体配置为：

PM预混引物:FIP/BIP (50UM) 0.4μL

FLOOP/BLOOP (50UM) 0.4μL

F3/B3 (10UM) 0.2μL

提取DNA 1.0-2.0μL

Bst酶 1.5μL

2×U-loadmix buffer 12.5μL

含有钙黄素和锰离子的荣研Loopamp 荧光染料 0.4-1.0μL

DEPC-treated ddH₂O 补充至25.0μL

作为优选，所述试剂盒的检测反应条件为：63-65℃，45-90分钟；终止反应。

作为优选，所述试剂盒的检测反应条件为：63℃，45-60分钟；终止反应。

本发明针对PPV VP2基因设计了6条特异性引物，在引入一对环引物之后，大大提高了扩增效率，产生了大量扩增产物，所以，将含钙黄素的预混染料直接加入反应管，在反应结束后，就可以直接观察对比颜色变化，判断样品感染的有无。通过引入环引物，摸索最佳扩增温度，本发明成功建立了PPV快速一步法LAMP检测方法，并应用该方法检测了大量的田间血清以及组织样品，达到了预期效果，有望开发为可以在广大猪场现场直接使用的快速诊断试剂盒。

本发明的试剂盒在不延长原有1小时反应时间的条件下，实现了将荧光染料直接加入反应管的一步操作，不仅简化了操作程序，解决了含有钙黄素的预混染料对Bst DNA扩增酶的抑制而导致在反应管直接加入荧光染料不显色的根本问题，还有效避免了由于反应结束后二次开盖导致的释放产物形成气溶胶的污染发生。应用本发明的试剂盒进行检测，能够肉眼直接直观判断，具有良好的特异性、敏感性和稳定性。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为60-65℃不同温度条件下，PPV一步法快速显色LAMP图谱；

图2为以10倍系列稀释的AV30毒株细胞毒DNA或者含有VP2编码基因的质粒为模板，进行PPV一步法快速显色LAMP检测结果；

图3为以10倍系列稀释的DNA为模板，进行常规PCR（P16/P17引物对) 检测结果；

图4为PPV一步法快速显色LAMP分析特异性检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

毒株

建立LAMP检测方法采用的两株PPV毒株分别为AV30株（CVCCAV30）和AV31株（CVCCAV31），均来自中国兽医药品监察所。用于分析特异性检测实验的其它与猪殖障碍性疫病有关的病毒毒株包括猪圆环病毒1型PCV1（CAU0672）、猪圆环病毒2型PCV2（CAU0673)、猪伪狂犬病毒RRV（CVCC AV250）和古典猪瘟病毒CSF（CVCCAV65，猪瘟弱毒株）均来自中国兽医药品监察所，在PK-15细胞传代后保存的细胞毒，HP-PRRSV（QH08毒株，由实验室从田间分离保存的Marc-145细胞毒，全基因组测序Genebank登录号：KU201579）和非高致病性PRRSV(CH-1R毒株，源自海利疫苗公司生产的蓝耳净猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，由实验室在Marc-145细胞传代的细胞毒）。

临床样品

用于临床检测的田间样品共有505份，其中猪血清101份，组织样品404份。这些田间样品经过ELISA、PK-15细胞接毒后间接免疫荧光IFA以及PCR检测和测序分析等综合方法确定是否为PPV感染。101份猪血清中41份为阳性，60份为阴性。组织样品包括肺脏组织71份（34份阳性，37份阴性），肝脏组织67份（32份阳性，35份阴性），心脏组织60份（阴、阳性各30份），肾脏组织70份（阳性33份，阴性37份），脾脏组织63份（31份阳性，32份阴性），淋巴结73份（37份阳性，36份阴性），提取核酸后，分别进行PPV一步法快速显色LAMP和常规PCR检测，用于检测新建立方法的临床特异性和敏感性。

3.核酸扩增和提取相关试剂盒

用于建立PPV LAMP方法的扩增试剂盒为北京美莱博医学科技有限公司的LAMP试剂盒以及日本荣研公司Loopamp 荧光目视检测试剂盒（含有钙黄素和锰离子）。核酸提取采用Takara宝生物工程（大连）有限公司生产的TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0。用于常规PCR扩增的试剂盒源自Takara宝生物工程（大连）有限公司Premix Taq Version 2.0 plus dye。

实施例1 本发明的试剂盒的制备

一、样品DNA的提取

采用Takara宝生物工程（大连）有限公司生产的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit提取细胞毒、血清和研磨后的组织样品中核酸。

二、采用不同的方法对样品中的PPV进行测定

1、常规PCR反应实验测定PPV

PPV常规PCR扩增引物序列

表1 PPV 1型常规PCR扩增引物序列

P16-F和P17-R作为引物对合用，用于常规PCR鉴定PPV猪细小病毒，针对衣壳蛋白VP2基因的461-905bp片段区域，预计扩增产物大小445bp。

PCR扩增反应体系（20μl）

PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase 0.4μL

dNTP Mixture 1.6μL

5×PrimeSTAR GXL Buffer 4μL

上游引物 （20μM) 0.5μL

下游引物 （20μM) 0.5μL

模板 (浓度在5-15ng/μL) 1μL

DEPC水 加至20μL。

PCR扩增反应

扩增程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃50S，36个循环；72℃ 10min。

2、PPV一步法快速显色LAMP建立

（1）PPV一步法快速显色LAMP扩增引物序列

PPV一步法快速显色LAMP共有6条引物（见表2），针对VP2基因8个不同的靶序列，除了常规的一对外引物（F3和B3）和一对内引物（FIP和BIP）之外，还有一对环引物，即FLooP和BLooP。引入环引物的目的旨在进一步提高扩增效率，提高产物量，利于快速显色。内引物FIP和BIP各由两段序列组成，故此，6条引物由8段序列组成。

表2. PPV一步法快速显色LAMP引物

（2）LAMP扩增反应体系（25μl）

PM预混引物:FIP/BIP (50UM) 0.4μL

FLOOP/BLOOP (50UM) 0.4μL

F3/B3 (10UM) 0.2μL

提取DNA 1.0-2.0μL

Bst酶 1.5μL

2×U-loadmix buffer 12.5μL

荣研Loopamp 荧光染料(含有钙黄素和锰离子) 0.4-1.0μL

DEPC-treated ddH₂O 补充至25.0μL

总体积 25.0μL。

（3）LAMP扩增反应流程

扩增程序：63℃反应45-90分钟。一般情况60分钟就可以。

（4）LAMP扩增产物电泳检测

A、琼脂糖凝胶电泳检测法

RT-LAMP扩增产物可以采用常规琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶浓度为2-2.5%，电泳缓冲液为1×TAE，电泳速度为5-6伏特/厘米（即电压降）。电泳结束后凝胶放入含有EB的染色中染色30分钟，然后在紫外灯下观察，电脑拍照。

B、荧光目测法

快速显色一步法RT-LAMP由于在反应管内加入了含有钙黄素和锰离子的染料，所以，在反应结束后，阳性样品管就会出现明亮的绿色荧光，而对照管和阴性样品管仅是有微弱的本底荧光。这样通过与系统设置的阴性和阳性对照的比较，在自然光下，通过肉眼观察即可以做出判断。再有，阳性样品由于扩增产生了大量产物，所以，与阴性对照相比较，阳性管溶液更为浑浊。在实验室，还可以通过在紫外灯下观察颜色变化，较自然光观察，更为明显。

实施例2 本发明的试剂盒的性能实验

一、PPV一步法快速显色LAMP分析敏感性实验

AV30株（CVCCAV30）与经典毒株NADL-2具有高度同源性，所以，本实验参考NADL-2株基因组序列计算提取核酸的拷贝数。

拷贝数计算公式:

(6.02×10²³拷贝数/摩尔)×(浓度g/ml)/(MW g/mol)=拷贝数/ml

或者 (6.02×10²³拷贝数/摩尔)×(浓度ng/μl)x10^-6/(MW g/mol)=拷贝数/ml

【平均分子量(MW g/mol)：dsDNA=(碱基数)×(660 道尔顿/碱基)；ssDNA=(碱基数)×(330 道尔顿/碱基)；ssRNA=(碱基数)×(340 道尔顿/碱基)】。

PPV属于单链DNA，NADL-2参考毒株基因组全长为5075bp，所以，其平均分子量MW=330×5075=1674750道尔顿。

AV30毒株DNA拷贝数为/ml=(6.02×10²³拷贝数/摩尔)×(浓度g/ml)/1674750=拷贝数/ml

若是AV30毒株DNA的浓度为1ng/μl，那么每微升含有3.6×10⁸ 拷贝数的PPV单链DNA，计算如下：

(6.02×10²³拷贝数/摩尔)×(浓度1ng/μl) ×10^-6/1674750=3.6×10¹¹ 拷贝数/mL=3.6×10⁸ 拷贝数/μl。

从AV30株（CVCCAV30）PK-15细胞毒中提取DNA，采用紫外分光光度计测定核酸浓度，然后根据上述公式计算出提取DNA样品的每微升核酸拷贝数。将DNA样品用无菌和无核酸酶的ddH₂O系列稀释成1×10^8- 1×10^0拷贝数/μL，然后按上述方法进行LAMP实验，每个反应管加入1μL上述系列稀释的DNA样品作为模板。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳和荧光检测。同时将上述倍比稀释的DNA样品进行常规PCR扩增(P16/P17引物对)，比较两种方法的分析敏感性。此外，还以实验室保存的含有PPV VP2基因的质粒为模板，按着1-10^8的进行10倍系列稀释，比较上述两种方法的分析敏感性。

二、PPV一步法快速显色LAMP分析特异性实验

在进行PPV病毒一步法快速显色LAMP的分析特异性检测时，分别检测其与PCV1、PCV2、PRV、CSF、HP-PRRSV和Non-HP-PRRSV病毒的交叉反应性分析。提取PCV1（CAU0672）、PCV2（CAU0673)、PRV（CVCC AV250）、CSF（CVCCAV65）、HP-PRRSV（QH08毒株）和非高致病性PRRSV(CH-1R毒株）细胞毒核酸，放入-70℃保存待用。采用本发明建立的PPV一步法快速显色LAMP检测这些核酸样品，评估该方法与这些病毒的交叉反应性。

三、PPV一步法快速显色LAMP临床敏感性实验

用于PPV快速显示一步法LAMP临床灵敏度分析的PPV阳性样品以流产胎儿组织为主，共有238份。组织样品包括肺脏组织34份，肝脏组织32份，心脏组织30份，肾脏组织33份，脾脏组织31份；淋巴结37份，感染猪血清41份。采用Takara试剂盒重新提取这些经过鉴定为PPV阳性的组织样品核酸后，分别进行PPV快速显示一步法LAMP和常规PCR检测。

四、PPV一步法快速显色LAMP临床特异性实验

用于PPV一步法快速显色LAMP临床特异性分析的PPV阴性样品来自健康猪场，这些猪场在最近几年内没有发生过猪繁殖障碍性疫病，共有267份样品，其中血清60份，组织样品207份。组织样品中肺脏组织37份，肝脏组织35份，心脏组织30份，肾脏组织37份，脾脏组织32份；淋巴结36份。提取这些样品核酸后，分别进行PPV一步法快速显色LAMP和常规PCR检测，评估新建立的PPV一步法快速显色LAMP临床特异性。

【结果】

1. PPV一步法快速显色LAMP建立

以AV30毒株的细胞毒DNA为模板建立PPV一步法快速显色LAMP，结果表明，在63℃、64℃和65℃都能够有效扩增出典型的梯形条带，在凝胶成像仪紫外灯光紫外模式下反应管的绿色荧光都非常明亮。在60℃反应条件下没有条带形成，基本看不到荧光出现。在61℃和62℃时能看到条带形成，反应管开始出现荧光。在自然光情况下，肉眼可见绿色荧光随着温度变化而变化，但是拍照效果不是很明显。图1结果可见，PPV一步法快速显色LAMP的适宜扩增温度为63-65℃，其中以63℃反应效果最佳。

图1为60-65℃不同温度条件下，PPV一步法快速显色LAMP图谱；其中，

A图：LAMP扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；

B图：LAMP扩增产物对应反应管在凝胶成像仪紫外光的紫外模式下拍照图谱；

C图：LAMP扩增产物对应反应管在凝胶成像仪紫外光的黑白模式下拍照图谱；

D图：LAMP扩增产物对应反应管在自然光条件下拍照图谱；

M：DL2000 Marker（2000,1000,750,500,250,100bp)；

1，2，3，4，5，6分别代表在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和65℃下的LAMP等温扩增。

2. PPV一步法快速显色LAMP的分析敏感性

以1×10^8-1×10^0拷贝数/μL系列稀释DNA作为模板，进行PPV一步法快速显色LAMP（63℃等温扩增）和常规PCR检测，并比较两种的敏感性。结果表明，不管以AV30毒株的细胞毒DNA为扩增模板还是以含有VP2基因的质粒为模板，PPV一步法快速显色LAMP的检出限都是10个拷贝数/μL（图2）。而常规PCR方法（P16/P17引物对）在以AV30细胞毒DNA为模板的检出限为1x10^5个拷贝数/μL左右，以含有VP2基因的质粒为模板的检出限为1x10^2个拷贝数/μL左右（见图3），这表明，PPV一步法快速显色LAMP不仅要比常规PCR灵敏高，可以提高10-10000倍左右，而且反应的敏感性不受核酸来源的限制。

图2为以10倍系列稀释的AV30毒株细胞毒DNA或者含有VP2编码基因的质粒为模板，进行PPV一步法快速显色LAMP检测结果；其中，

A图：LAMP扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；

B图：LAMP扩增产物对应反应管在凝胶成像仪紫外光的紫外模式下拍照图谱；

C图：LAMP扩增产物对应反应管在凝胶成像仪紫外光的黑白模式下拍照图谱；

M：DL2000 Marker（2000,1000,750,500,250,100bp); 对应的模板拷贝数（拷贝数/μL）分别为1(0)；2 (1×10^0)；3 (1×10^1)；4(1×10^2)；5(1×10^3)；6(1×10^4)；7(1×10^5)；8(1×10^6)。

图3为以10倍系列稀释的DNA为模板，进行常规PCR（P16/P17) 检测结果；其中，

A图：以AV30毒株的细胞毒DNA为扩增模板；

B图：以含有PPV VP2编码基因的质粒为扩增模板；

M：DL2000 Marker（2000,1000,750,500,250,100bp)；对应的模板拷贝数（拷贝数/μL）分别为1(0)；2 (1×10^0)；3 (1×10^1)；4(1×10^2)；5(1×10^3)；6(1×10^4)；7(1×10^5)；8(1×10^6)；9(1×10^7)；10 (1×10^8)。

3. PPV一步法快速显色LAMP的分析特异性

PPV一步法快速显色LAMP不与PCV1、PCV2、PRV、CSF、HP-PRRSV和非高致病性PRRSV发生交叉反应，琼脂糖凝胶电泳不形成条带，肉眼和紫外灯下观察未产生明亮的颜色变化。与此同时，以AV30和AV31毒株为阳性对照实验，琼脂糖凝胶电泳形成了典型的梯形条带，肉眼或者白光灯模式下和紫外灯下观察反应管都发生了明显的颜色变化。以ddH₂O为阴性对照的反应管仍应呈阴性反应，试剂盒提供的阳性对照成立(见图4）。综上所述，新建立的PPV一步法快速显色LAMP分析特异性强，不与其它有关猪病病毒发生交叉反应。

图4为PPV一步法快速显色LAMP分析特异性检测结果；其中，

A图: LAMP等温扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；

B图: LAMP等温扩增产物对应反应管在凝胶成像仪紫外光的紫外模式下拍照图谱；

C图: LAMP等温扩增产物对应反应管在凝胶成像仪紫外光的黑白模式下拍照图谱；

M：DL2000 Marker（2000,1000,750,500,250,100bp)； 以不同病毒的核酸为模板，依次为：1.ddH₂O阴性对照；2. PPV1型AV30毒株；3. PPV1型AV31毒株；4. PCV1；5. PCV2；6.PRV；7. CSFV；8.HP-PRRSV；9.Non-HP-PRRSV；10.试剂盒提供的阳性对照模板。

4. PPV一步法快速显色LAMP的临床敏感性

采用发生了PPV感染猪场收集的流产胎儿组织样品和母猪以及种公猪的血清作为临床阳性样品评估PPV一步法快速显色LAMP的敏感性，并与常规PCR方法进行比较。这些阳性临床样品经过ELISA、PK-15细胞接毒后间接免疫荧光以及PCR检测和测序分析后确定。PPV一步法快速显色LAMP能够全部检出肺脏和脾脏中的PPV病毒核酸，总阳性检出率为97.5%。以P16/P17引物对扩增的常规PCR总检出率为91.2%。对组织样品的检出率在90-94%之间。LAMP方法对猪血清的检出率为97.3%,常规PCR方法的检出率为90.2%（结果见表3）。对比两种方法对上述PPV阳性样品的检出率，结果显示PPV一步法快速显色LAMP的临床敏感性明显高于常规PCR方法。

表3 238份PPV阳性临床样品的PPV一步法快速显色LAMP和常规PCR检出敏感性比较

5.PPV一步法快速显色LAMP的临床特研性

以从最近几年内没有发生过猪繁殖障碍性疫病的猪场采集的样品进行PPV一步法快速显色LAMP的临床特研性分析，并与以P16/P17为引物对的常规PCR进行比较。共检测267份样品，其中血清60份，组织样品207份。这些PPV阴性临床样品经过ELISA、PK-15细胞接毒后间接免疫荧光以及PCR检测和测序分析等综合诊断方法确定。两种方法的结果显示PPV一步法快速显色LAMP和常规PCR对267份阴性临床样品的检出率基本接近，分别为97.7%(261/267)和97.3% (260/267)，没有明显差别。这表明新建立的PPV一步法快速显色LAMP特异性强，适于在临床推广使用。

表4 267份阴性临床样品的PPV一步法快速显色LAMP和常规PCR方法的特异性比较

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。