猪流行性腹泻病毒强毒株和疫苗株多重RT‑PCR检测试剂盒及其引物组的制作方法

本发明属于RT-PCR检测技术领域，尤其涉及一种猪流行性腹泻病毒强毒株和疫苗株多重RT-PCR检测试剂盒及其引物组。

背景技术：

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起猪特别是仔猪的一种急性、高度传播性的肠道疾病，以急性肠炎、水样腹泻、呕吐和严重脱水为主要特征，其发病率和死亡率都很高，哺乳仔猪发病率可达100％、死亡率可达80％-100％，给养猪业造成巨大损失。

由于临床上PEDV野毒经典株、变异株的同时存在，加上弱毒活疫苗的大量使用，给临床监测和诊断带来很大的困难。建立PEDV野毒株、疫苗株的鉴别检测方法是检测和诊断该病的重要前提。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、敏感性高、重复性好的猪流行性腹泻病毒强毒株和疫苗株多重RT-PCR检测试剂盒及其引物组，用于PEDV野毒经典株、变异株和疫苗株的快速鉴别检测。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：猪流行性腹泻病毒强毒株和疫苗株多重RT-PCR检测引物组，包括三对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4、引物5和6，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。

引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩尔比为1∶1∶1∶1∶1∶1。

猪流行性腹泻病毒强毒株和疫苗株多重RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有以下试剂：反转录RT反应液、PCR反应液、灭菌双蒸水，PCR反应液包括三对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4、引物5和6，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。

反转录RT反应液每管15μL，包括：5×Prime Scrip II buffer 4.0μL，dNTP 1.0μL含各dNTP 10mM，随机引物6聚体50pmol/μL、1.5μL，RNA酶抑制剂40U/μL、0.5μL，RNase H-型反转录酶200U/μL、1.0μL，灭菌双蒸水7μL；PCR反应液每管45μL，包括：2×Taq PCR MasterMix 25μL，引物1和2 25pmol/μL各1μL，引物3和4 25pmol/μL各0.75μL，引物5和6 25pmol/μL各1.25μL，灭菌双蒸水14μL。

针对目前猪流行性腹泻病毒检测存在的问题，根据PEDV野毒株和疫苗株的基因序列特点，在ORF3缺失区域两端设计引物，用以区分野毒株与疫苗株(野毒经典株和变异株在此区域序列相同)；在S基因缺失和插入区域设计引物，用以区分野毒变异株、经典株及疫苗株(经典株和疫苗株在此区域序列相同)，由此，发明人设计了猪流行性腹泻病毒强毒株和疫苗株多重RT-PCR检测引物组，包括三对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4、引物5和6，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。据此，发明人还制备检测试剂盒，并建立了相应的多重RT-PCR检测方法，该法可以特异检测PEDV，而与猪的其他重要病原猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRoV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)无交叉反应；对重组质粒标准品的检出下限为2.62×10³拷贝；重复试验获得均匀一致的结果。临床检测结果表明，本发明具有特异性强、敏感性高、重复性好等特点，可同时检测并区分PEDV野毒经典株、变异株以及疫苗株，为临床快速鉴别检测及流行病学调查提供了有效的技术平台。

附图说明

图1是多重PCR特异性试验结果图，图中：M：DNA分子质量标准，1四种重组质粒混合物，2p-PEDV-SJ/Y，3p-PEDV-SB，4p-PEDV-ORF3J/B，5p-PEDV-ORF3Y，6FMDV，7CSFV，8PRRSV，9TGEV，10PRoV，11PCV2，12PRV，13阴性对照。

图2是多重PCR敏感性试验结果图，图中：M DNA分子质量标准；1-9质粒浓度分别为2.62×10⁹拷贝/μL-2.62×10¹拷贝/μL；10阴性对照。

图3是多重PCR重复性试验结果图，图中：M DNA分子质量标准；1-5相同条件下的5次重复反应；6阴性对照。

具体实施方式

以下实施例中，PEDV疫苗CV777株、野毒经典株、变异株，TGEV疫苗弱毒华毒株、PRoV疫苗G5型NX株、PRRSV疫苗TJM-F92株、FMDV疫苗O/MYA/BY/2010株、CSFV疫苗C株、PCV2疫苗毒LG株、PRV疫苗Bartha-K61株，均由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心提供。

1、引物的设计

参照GenBank中发表的PEDV经典株CV777株(AF353511)、变异株CHGD-01株(JX261936)和疫苗株CV777株(GU372744)，设计3对特异性引物(表1)。

表1引物信息

表1中，PEDV-ORF3引物为野毒株(经典株和变异株)及疫苗株通用引物，预期扩增ORF3基因片段在野毒株为198bp、在疫苗株为148bp；PEDV-SJ引物为经典株和疫苗株特异性引物，预期扩增S基因片段429bp；PEDV-SB引物为变异株特异性引物，预期扩增S基因片段274bp。因此，利用引物PEDV-ORF3/PEDV-SJ/PEDV-SB，同时扩增出198bp和429bp片段者为经典株、同时扩增出148bp和429bp片段者为疫苗株、同时扩增出198bp和274bp片段者为变异株。

2、样本制备

分别取PEDV疫苗CV777株、野毒经典株、变异株，按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，利用随机引物6聚体和Prime Script II RTase酶反转录获得cDNA。以cDNA为模板，分别应用3对特异性引物PEDV-ORF3、PEDV-SJ、PEDV-SB进行PCR扩增。应用胶回收试剂盒回收、纯化PCR产物，连接pMD18-T载体、转化CH5α感受态细胞，涂板，筛选阳性菌落增菌培养，使用质粒提取试剂盒提取质粒，并进行PCR鉴定、酶切鉴定、测序鉴定来证实成功构建了相应的重组质粒标准品。针对ORF3基因构建的质粒在疫苗株、野毒株分别命名为p-PEDV-ORF3Y、p-PEDV-ORF3J/B，针对S基因构建的质粒在经典株/疫苗株、变异株分别命名为p-PEDV-SJ/Y、p-PEDV-SB。

参照RNA/DNA提取试剂盒说明书，分别提取FMDV、CSFV、PRRSV、TGEV、PRoV的RNA和PCV2、PRV的DNA。

3、试剂盒配制

根据研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。试剂盒含有以下试剂：反转录RT反应液、PCR反应液、灭菌双蒸水，其中：

反转录RT反应液每管15μL，包括：5×Prime Scrip II buffer 4.0μL，dNTP(各10mM)1.0μL，随机引物6聚体(50pmol/μL，购自TaKaRa公司)，PrimeScriptTM II1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒1.5μL，RNA酶抑制剂(40U/μL)0.5μL，RNase H-型反转录酶(200U/μL)1.0μL，灭菌双蒸水7μL；

PCR反应液每管45μL，包括：2×Taq PCR MasterMix 25μL，PEDV-ORF3上、下游引物(25pmol/μL)各1μL，PEDV-SJ上、下游引物(25pmol/μL)各0.75μL，PEDV-SB上、下游引物(25pmol/μL)各1.25μL，灭菌双蒸水14μL。

4、多重RT-PCR程序及条件

经优化，确定多重RT-PCR的反应条件，包括反转录和PCR扩增两步程序。

20μL反转录体系为：5×Prime Scrip II buffer 4.0μL，dNTP(各10mM)1.0μL，随机引物6聚体(50pmol/μL)1.5μL，RNA酶抑制剂(40u/μL)0.5μL，RNase H-型反转录酶(200u/μL)1.0μL，模板总RNA 5.0μL，灭菌双蒸水7.0μL；反转录程序为：30℃10min，48℃45min，95℃5min。

50μL PCR反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 25μL，PEDV-ORF3上、下游引物(25pmol/μL)各1μL，PEDV-SJ上、下游引物(25pmol/μL)各0.75μL，PEDV-SB上、下游引物(25pmol/μL)各1.25μL，cDNA 5μL，灭菌双蒸水补至50μL；反应程序为：94℃2min；94℃30s，56.2℃30s，72℃45s，40个循环；72℃10min。

5.本发明实验应用

应用前述配制的试剂盒和确定的最佳反应条件，以4种质粒的不同组合，以及FMDV、CSFV、PRRSV、TGEV、PRoV的cDNA和PCV2、PRV的DNA作为模板，进行多重PCR，检测其特异性。如图1所示，只有质粒反应呈现阳性，而FMDV、CSFV、PRRSV、TGEV、PRoV、PCV2、PRV均为阴性，没有交叉反应。结果表明，利用本发明猪流行性腹泻病毒强毒株和疫苗株的多重RT-PCR检测试剂盒及其检测方法鉴别检测PEDV野毒经典株、变异株以及疫苗株具有较强的特异性。

将10倍系列稀释的4种重组质粒等体积混合后作为模板进行多重PCR，结果如图2，三对引物的检出下限均为2.62×10³拷贝/μL。表明利用本发明猪流行性腹泻病毒强毒株和疫苗株的多重RT-PCR检测试剂盒及其检测方法鉴别检测PEDV野毒经典株、变异株以及疫苗株具有较强的敏感性。

以终浓度为2.62×10⁶拷贝/μL的4种质粒混合物为模板进行多重PCR。结果如图3，5次重复试验均能扩增出均匀一致的目的片段，表明利用本发明猪流行性腹泻病毒强毒株和疫苗株的多重RT-PCR检测试剂盒及其检测方法鉴别检测PEDV野毒经典株、变异株以及疫苗株具有较好的重复性。