本发明属于生物技术领域，具体涉及一种在黄曲霉未萌发孢子中转化外源ssRNA的方法。
背景技术：
分子生物学的中心法则是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。现代基因工程中，常常使用宿主来表达外源蛋白，常用的做法就是构建质粒载体，把外源蛋白的编码DNA序列放在一个强启动子后面，导入宿主细胞后，编码DNA序列被转录成mRNA序列(单链RNA)，mRNA序列又被细胞内的翻译机器表达成蛋白质分子，完成外源蛋白表达的全过程。
DNA不论是作为游离于宿主基因组之外的质粒，还是插入到宿主基因组之中，都可以稳定地复制自身，并传递给子代。也就是说，DNA的信息可以遗传。同时，DNA可以源源不断地转录出新生RNA，并翻译成蛋白质。
RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)、U(尿嘧啶)。RNA作为单链分子，与双链结构的DNA相比，RNA很不稳定，半衰期很短，而且在自然界，RNA酶广泛存在，RNA非常容易被降解。RNA具有以下众所周知的特征：游离在细胞质的RNA不会遗传；RNA半衰期很短，不能长期存在；RNA不会插入到宿主的基因组DNA中。
由于半衰期短，因此，一个RNA分子存在于细胞内的时长，也很短暂，该RNA只能在这个短暂的时间内，与核糖体相互作用，表达蛋白质分子。而被表达出来的蛋白质分子，也是有寿命的，一个蛋白质分子在细胞内存在多久，也可以用半衰期指标来衡量。
在传统的基因工程技术中，如果要在一个宿主细胞内部表达外源的蛋白质，常用的做法是把蛋白质的编码基因构建在DNA载体上，把DNA载体转入宿主细胞内部，DNA载体源源不断地转录出编码蛋白质的RNA，RNA不断翻译出目的蛋白，实现了在细胞内的蛋白表达。
如果不借助DNA载体，在体外制备编码蛋白的单链RNA分子，仅仅把编码蛋白质的外源单链RNA导入到宿主细胞内部，只要细胞内没有对应的DNA源源不断地转录出新的该RNA，那么，这个RNA与其所表达出的蛋白质分子，只能在特定的时间窗口存在。换言之,这个RNA与其所表达出的蛋白质分子，只能在细胞生命周期中的某一个时间段存在。
因此，这个特性有个很重要的作用，可以在特定的时间周期窗口，瞬时表达某个蛋白或者RNA，可以实现表达蛋白质而不影响或者尽可能少影响细胞的正常生理周期和遗传信息。比如：可以在细胞生命活动的某个时间节点，转入外源RNA，表达某个细胞因子，调控细胞的生命周期；可以把TALENs、ZFNs和CRISPR/Cas9等Genome Editing的工具酶蛋白分子，用外源单链RNA在宿主细胞内做表达，避免使用质粒或其它DNA形式的载体时，将DNA序列引入细胞内部，并造成潜在的外源DNA与宿主染色体相互作用(例如同源重组)，影响细胞的遗传，等等。这个特性在基因工程领域，具有重要价值。
在哺乳动物细胞实验中，已经有先例，可以把外源单链RNA直接转入哺乳动物细胞中。主要方法包括：1，使用诸如Lipo等试剂的化学法，Lipo等化学试剂可以与哺乳动物细胞的细胞膜发生相互作用，把外源RNA导入细胞内部。2，传统的电转化法，比如方波电击，这是一种用电脉冲短暂作用于接触外源RNA的哺乳动物细胞，使外源RNA进入细胞。
黄曲霉，半知菌类，一种常见腐生真菌。多见于发霉的粮食、粮制品及其它霉腐的有机物上。它可用于产生淀粉酶、蛋白酶和磷酸二酯酶等，也是酿造工业中的常见菌种。对其进行基因改造，需要在其细胞内表达外源蛋白，但是在这种真菌未萌发孢子中表达蛋白质非常困难。
真菌孢子是真菌的主要繁殖器官，孢子呈休眠状态且可以生存很长时间。孢子在适宜的外界条件下，能够苏醒并萌发，形成菌丝而进行分裂繁殖。最为重要的是，很多类型真菌的孢子，是天然的单倍体，孢子是基因工程领域良好的起始生物材料。
但是，由于孢子一般处于休眠状态，其细胞壁非常厚实，休眠孢子的细胞壁、细胞膜的状态，与萌发孢子、与菌丝体是不同的。且休眠孢子细胞内的生命活动也处于最不旺盛的状态，因此，本领域公知，休眠孢子的细胞通透性不如萌发孢子和菌丝，休眠孢子几乎不与外界交流物质，闭关锁国，一般处于睡眠状态。而萌发孢子或菌丝体，需要从外界吸收各种营养分子供给生命活动，因此细胞壁和细胞膜的通透性大于休眠孢子。所以，非常难以将外源RNA分子直接导入到睡眠孢子的内部。目前也尚未有任何方法可以做到直接把外源RNA分子在无介质介导的情况下，导入休眠的(未萌发)真菌孢子内部。这也是本行业内一直没有攻克的技术难题。
目前尚未有把外源单链RNA导入黄曲霉细胞内部的报道，更没有把外源RNA导入黄曲霉孢子(无论是萌发孢子，还是未萌发孢子)的报道。目前用基因工程技术在黄曲霉细胞内表达目的蛋白质的方法，仍然需要借助DNA载体，且一般需要使用黄曲霉成熟菌丝体的原生质体作为宿主细胞，或者借助农杆菌作为介质，用DNA载体运载基因信息进入宿主细胞。
此外，编码蛋白质的外源RNA导入未萌发孢子内部后，还需要与孢子内部的蛋白翻译因子等各种细胞因子、酶系相互作用，才能翻译出蛋白质分子。但是，众所周知，睡眠孢子的生命活动处于最不旺盛的状态，细胞内各种蛋白翻译因子和酶系的活力是很低的，各种因子和酶系分子的数量也是很少的，即便外源RNA进入了未萌发孢子内部，也需要比较长的相互作用时间，才能翻译出目的蛋白。而时间长，就意味着外源RNA在细胞内，被细胞内源性RNA酶降解的概率加大，因此，就要求要有足够多数量的外源RNA，可以进入未萌发孢子内部。
如何让真菌的孢子萌发，本领域已经有现成的技术方案，但是无论哪种萌发方法，都需要消耗时间、精力、人工操作、以及化学试剂。业内已经有用萌发的真菌孢子，导入外源DNA的案例，因此，按照本领域的基础理论，一般认为，用细胞通透性更强的萌发孢子导入外源分子(例如外源的RNA)的成功率更大，因为萌发的孢子已经苏醒，细胞内各种因子和酶系已经充分调动和活跃起来了，细胞要吸收养分，细胞内外物质交流活跃。可惜的是，目前为止，尚未有用孢子(无论是萌发还是未萌发)导入外源编码RNA的先例。但是，显而易见，用未萌发的孢子来作为导入外源分子的起始材料，非常简便，因为可以省去做孢子萌发这一复杂的步骤，更重要的是，萌发的孢子，可能已经产生了多倍体，而未萌发的孢子，可以保证是单倍体，很多基因工程的应用，要求宿主细胞必须是单倍体，才能达到预想的结果或者效率。因此本发明尝试绕过真菌孢子萌发这个步骤，直接用休眠的孢子，来导入外源RNA。
另外，众所周知真菌能产生大量的RNA酶，并且能够大量外分泌这些RNA酶，真菌是自然界RNA酶的主要来源之一。真菌孢子采集自菌体，采集真菌孢子时，孢子会携带有菌体分泌的大量的外源性RNA酶，而且很难在不杀灭孢子的情况下，把RNA酶彻底清洗干净(如果使用DEPC等化合物来做彻底清洗，势必会杀灭真菌孢子)。而且孢子自身也会产生和外分泌一些RNA酶。因此，使用外源单链RNA来转化真菌细胞，非常困难，无异于鸡蛋碰石头，单链RNA还未接触到真菌细胞就会被RNA酶降解了。
综上所述，将编码蛋白质的RNA分子，直接导入真菌(无论是菌丝体还是孢子，无论是萌发的孢子还是未萌发的孢子)内部，是本行业内一直没有攻克的技术难题。
电击转化(Electroporation)是一种用电脉冲短暂作用于接触了外源核酸的细胞，使外源核酸进入细胞的方法。电击转化法又根据各自特点，有许多细分。已经有文献报道了用电击法，递送DNA进入某些种类真菌的细胞。但是，DNA与编码蛋白的单链RNA相比，在结构上、在生物化学和分子生物学属性上，均完全不同，它们与细胞壁、细胞膜的相互作用方式也是不同的，因此让它们通过真菌的细胞壁、细胞膜并进入细胞内部的机制，也是不同的。DNA分子与单链RNA相比，DNA半衰期长，不容易被降解，非常稳定。用于递送DNA的方法，不能直接用于递送单链RNA，目前也没有相关报道。
2013年面世的HDEN电击转化技术，是一种专门针对哺乳动物细胞的特性，而开发的电转化技术，其开发目的是为了提高向哺乳动物细胞内传送外源DNA和药物的效率。该技术包含3大部分内容，一是施加于细胞样品的电波形式，二是细胞样品在电击时的溶液环境，三是细胞样品的培养方法和电击前预处理方法。由于该技术是专门针对哺乳动物细胞开发的，因此，上述3大部分内容，都是针对哺乳动物细胞的特性而设计。
现有文献报道了HDEN技术在HEK-293A，Hela，Neuro-2A，MCF-7，C2C12，3T3-L1，CHO，MDCK，HL-60，HUVEC，A375，U251等哺乳动物细胞中，递送DNA进入细胞的应用案例。目前尚未有该技术在哺乳动物细胞以外的物种中应用的案例报道。因此，HDEN电转化技术能不能应用于哺乳动物细胞以外的物种，也是一个未知数。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对背景技术现状，提供一种在黄曲霉未萌发孢子中转化外源ssRNA的方法，该方法绕过真菌孢子萌发这个步骤，采用HDEN电转化技术，将体外的单链编码蛋白RNA递送穿过细胞壁和细胞膜，在黄曲霉休眠孢子内表达蛋白质。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种在黄曲霉未萌发孢子中转化外源ssRNA的方法，包括以下步骤：
1)黄曲霉培养和孢子收集
在固体琼脂培养基表面接种黄曲霉，培养至培养基表面长满黄曲霉孢子，洗下培养基表面的黄曲霉孢子，吸出孢子悬液并过滤去除菌丝，收集含有孢子的滤液，将滤液离心，收集沉淀的休眠孢子；
2)黄曲霉孢子预处理
用电击缓冲液重悬孢子，离心并收集孢子沉淀，重复上述重悬和离心步骤3-4次后，将最后收集的孢子沉淀重悬于电击缓冲液中，得到孢子浓度为104—1011个/ml的黄曲霉孢子悬液；
所述电击缓冲液由终浓度为0.01-100mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和终浓度为0.5-5000mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为3.0-9.5；
3)使用HDEN法电击黄曲霉孢子
在细胞培养板的孔中加入上述步骤得到的黄曲霉孢子悬液以及待转化RNA，混匀，得到孢子与RNA混合物，将细胞培养板置于冰上冰浴10-15min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1电转仪进行HDEN法电击，将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与RNA混合物内部，通电，使得孢子与RNA混合物内部产生电场，电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴10-15min，然后将孢子和RNA混合物吸出，得到导入外源ssRNA的休眠的黄曲霉孢子；
所述黄曲霉悬液与待转化RNA的比例为：0.6-60000μl的黄曲霉孢子悬液：0.1-10000μg的待转化RNA；
所述电击参数如下：电压1—6000V，脉宽2-2000000ms，重复1-100次，每次间隔5-50000ms。
进一步，所述步骤1)的培养基为PDA培养基、YPD培养基或察氏培养基，优选为PDA培养基的效果最好，产孢子最快最多。
所述步骤1，)黄曲霉的培养条件为：温度16-40℃，湿度15-85％，培养3-15日。
优选的，所述步骤1)，黄曲霉的培养条件为：温度25℃，湿度50-60％，培养7日。
进一步，所述步骤2)，电击缓冲液由终浓度为1-10mmol/L的HEPES和终浓度为50-100mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为5.0-7.0；
优选的，所述步骤2)，电击缓冲液由终浓度为1mmol/L的HEPES和终浓度为50mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为7.0。
所述步骤2)的黄曲霉孢子悬液在电击前，于显微镜下观察，确认孢子悬液中无菌丝体混杂污染并且孢子均未萌发，然后再进行电击。
进一步，所述步骤3)，待转化RNA为外源单链编码蛋白质的RNA，可以是绿色荧光蛋白的编码RNA、红色荧光蛋白的编码RNA或黄色荧光蛋白的编码RNA等等。
本发明扩增绿色荧光蛋白基因或黄色荧光蛋白基因的PCR引物如下：
F：5'AGATGACGTCGCTAGCATGGTGAGCAAGGGC 3'；(SEQ ID NO.1)
R：5'ACGCGTCGACTTACTTGTACAGCTCGT3'；(SEQ ID NO.2)
其中，引物F中靠近5’端的GCTAGC序列，用于促进该DNA转录成RNA后，翻译起始因子与RNA结合，该序列与所表达的目的基因的起始密码子ATG紧邻。
本发明扩增红色荧光蛋白基因用的PCR引物如下：
上游引物：RFP-F:5'CGGAATTCGCCACCATGGCCTCCTCCGAGGACGT 3'；(SEQ ID NO.3)
下游引物：RFP-R:5'TCGAGCTCGTTAGGCGCCGGTGGAGTGG 3'；(SEQ ID NO.4)
其中，引物RFP-F中靠近5’端的GCCACC序列，用于促进该DNA转录成RNA后，翻译起始因子与RNA结合，该序列与所表达的目的基因的起始密码子ATG紧邻。
优选的，所述步骤3)，黄曲霉悬液与待转化RNA的比例为：60μl的黄曲霉孢子悬液：10μg的待转化RNA。
进一步，所述步骤3)，电压300-1000V，脉宽1500-20000ms，重复1-50次，每次间隔500-5000ms；优选为：电压400V，脉宽2000ms，重复5次，每次间隔400ms。
本发明所述电击采用Etta Biotech X-Porator H1电转仪，购买自苏州壹达生物公司。
本发明收集未萌发的孢子，以及后续的电转实验过程，若无特殊说明，实验操作均在不高于23摄氏度的恒温实验室中操作，离心步骤均为4℃冷冻离心，接触未萌发孢子的各种液体均事先在冰上预冷。未萌发孢子严禁接触到任何含有可促使其萌发的因素和物质(比如以YEPD等为代表的萌发培养基)，以保证孢子的休眠状态。
本发明黄曲霉培养过程，当黄曲霉表面长满孢子后，向培养基表面倒入无菌水，洗下培养基表面的黄曲霉孢子，用移液器吸出孢子悬液，使用灭菌过的擦镜纸(或者砂芯漏斗、滤纸等)过滤，去除菌丝，保留孢子，如果没有过滤步骤，那么孢子悬液中会混杂有菌丝，后续步骤得到的转化子，无法判断究竟是由孢子转化DNA后形成的阳性克隆，还是菌丝转化DNA后形成的假阳性。得到的孢子还要用染色体染色法对其染色体染色，并观察和确认孢子内的染色体是单倍体状态。
本发明制备固体琼脂培养基的水应该是MillQ级别的分子生物学用高纯水或双蒸水，水的电阻率不低于18.2MΩ-cm。
使用HDEN法电击黄曲霉孢子时，在细胞培养板的孔中加入适当比例的黄曲霉孢子悬液以及待转化RNA，混合匀匀，将容器置于冰上进行冰浴。例如在96孔细胞培养板的孔中(NUNC公司的Nunclon Surface 96孔细胞培养板，货号Cat.No.167008)，加入60μl的黄曲霉孢子悬液，以及不少于10μg的RNA。所述细胞培养板也可以是384孔板、24孔板、6孔板、或者其它更大、更小的容器，然后按照容器体积大小比例，放大或缩小孢子和RNA混合物体系。
本发明采用以上技术方案，用未萌发的孢子来作为导入外源分子的起始材料，非常简便，因为可以省去做孢子萌发这一复杂的步骤，更重要的是，萌发的孢子，可能已经产生了多倍体，而未萌发的孢子，可以保证是单倍体，很多基因工程的应用，要求宿主细胞必须是单倍体，才能达到预想的结果或者效率。同时，本发明应用HDEN电转化技术将外源RNA导入黄曲霉休眠孢子。HDEN电转化技术采用了高密度矩阵式电极，它能产生高度均匀且强度足够的电场，电场内每个细胞接受电击的条件几乎完全一致，操作时，只要把细胞放在通用容器中，比如细胞培养板，再把带有矩阵式电极的电击头插入容器中，通电即可。而传统的电转技术一般是使用专用电击杯，在两块平行放置的金属板之间放置细胞，并对金属板加电，形成电场电击。因此，二者的放电方式完全不同，前者的电极插入细胞悬液内部，在内部产生电场，而后者是在细胞悬液整体的外部产生电场；前者的电极头由许多金属针组成，在针与针之间产生电压，而后者只有两块金属板，一块正极，一块负极，在二者之间产生电压。HDEN技术还基本消除了传统电击技术的阴极效应，避免产生大量氢氧根离子，避免杀伤细胞，提高电击后的细胞存活率。而传统电击技术很难消除阴极效应。本发明的HDEN法，电击多次，可以叠加多次电击的效果，并且不会大幅增加细胞死亡率，而传统的电击方法一般只电击1次，因为传统电击方法如果电击多次，会导致细胞死亡率大幅度增加。
HDEN电转化技术是一种专门针对哺乳动物细胞的特性而开发的电转化技术，其开发目的是为了提高向哺乳动物细胞内传送外源DNA和药物的效率。而在本领域内众所周知，微生物细胞的特性和培养方法，与哺乳动物细胞相比，千差万别。哺乳动物细胞和微生物细胞的结构不同，哺乳动物细胞没有细胞壁，微生物细胞(比如绝大部分真菌、包括黄曲霉)有细胞壁。哺乳动物细胞的细胞膜和微生物的细胞膜也不一样。即便是同一种生物，它的不同组织、不同器官或不同的细胞类型，各自的细胞膜、细胞壁的结构、状态、化学成分，也都不一样。哪怕是同一种生物的同样的组织、同样的器官、同样的细胞类型，在不同的生长发育阶段，或者在不同的外界环境中，各自的细胞膜、细胞壁的结构、状态、化学成分，也都不一样。而细胞壁和细胞膜，是阻挡外源分子进入细胞的屏障，屏障不同(结构不同，化学成分不同)，决定了突破屏障的方法也是不同的。此外，不同的外源分子，因为具有不同的结构、分子量、体积和化学成分，面对相同的屏障时，不同外源分子突破屏障的方法也是不一样的。如果面对不同的屏障，那么不同外源分子突破不同屏障的方法和机制，更是千差万别了。
因此，任何应用于哺乳动物细胞的技术，都很难直接应用于微生物细胞。目前尚未有HDEN技术在哺乳动物细胞以外的物种中应用的案例报道。本发明针对黄曲霉细胞的特性，采用HDEN技术将体外的单链编码蛋白RNA导入黄曲霉休眠孢子，该方法确定了细胞样品的培养方法和电击前预处理方法，细胞样品在电击时的溶液环境，以及施加于细胞样品的电波形式。
此外，RNA翻译成蛋白质，需要有调控序列与与翻译起始因子结合并介导蛋白翻译的起始。什么样的调控序列可以在真菌(例如本发明的黄曲霉)细胞内使用，是一个未知数，没有任何文献报道过。本发明还披露了可以在黄曲霉细胞内使用的2种调控序列，见本发明实施例部分。
采用本发明方法，实现了历史上首次将编码蛋白质的RNA直接导入黄曲霉休眠孢子并表达蛋白质，且步骤非常简便快速，另外，效果极佳，可以得到至少90％的转化率。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1为实施例1转录出的RNA产物的电泳检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。
实验过程的所有操作均要遵循微生物实验的无菌操作原则，器皿、耗材、试剂均要灭菌处理。
本发明所用的所有内切酶均为Fermentas公司fastdigest系列限制性内切酶产品，以下实施例用到的T4DNA ligase为Fermentas公司产品，酶切和连接及胶回收和DNA纯化操作，均按照产品说明书操作。
实施例1
在黄曲霉细胞中表达绿色荧光蛋白(GFP)：
一、质粒构建
使用GFP基因编码序列，GFP基因如SEQ ID NO.5所示，
上述GFP基因的蛋白序列如SEQ ID NO.6所示，
扩增GFP基因用的PCR引物：
F：AGATGACGTCGCTAGCATGGTGAGCAAGGGC 波浪线是Aat II酶切位点
R：ACGCGTCGACTTACTTGTACAGCTCGT 波浪线是Sal I酶切位点
引物F中带下划线的GCTAGC序列，用于促进该DNA转录成RNA后，翻译起始因子与RNA结合，该序列与所表达的目的基因的起始密码子ATG紧邻。用上述这对引物做PCR后，可以让GFP基因上游带上GCTAGC，上下游均带上酶切位点。
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物无误后，使用Thermo GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit回收纯化PCR产物。
将上述PCR产物用Aat II和Sal I双酶切，用T4DNA ligase将它连接在也经过Aat II和Sal I双酶切的Promega公司pGEM-T easy质粒上，转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，用质粒上的通用测序引物测序验证插入序列无误后，大量提取重组质粒。上述步骤正好可以让该GFP基因位于该质粒载体T7promoter的下游。
体外转录
用Fermentas公司的Fastdigest Nde1内切酶对上述提取的重组质粒做单酶切线性化。使用Thermo Scientific TranscriptAid T7High Yield Transcription Kit，对上述重组质粒做体外转录，均按照说明书操作。
转录出的RNA产物纯化
1)在20μl转录反应体系中加入115μl的DEPC-H2O和15μl的3M NaAc溶液(pH5.2)，混匀；
2)加入等体积的酚氯仿异戊醇混合物(酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)，混匀；
3)高速离心，使液体上下分层，取上层水相至另一个1.5ml离心管。
4)在水相中加入2倍体积无水乙醇，置于-20℃至少30min，高速离心，沉淀RNA，去上清。
5)加入1ml预冷的70％乙醇，轻轻颠倒后高速离心1min；
6)将沉淀重悬于合适体积的DEPC-H2O中，使RNA浓度不低于10μg/μL；
电泳检测结果如图1所示：
泳道1：RiboRuler RNA Ladder，high range，ready-to-use；
泳道2：positive control，2222nt；
泳道3：体外转录出的GFP的RNA，～750nt
二、使用上述绿色荧光蛋白的编码RNA在黄曲霉休眠孢子中表达绿色荧光蛋白，步骤如下：
1)黄曲霉培养和孢子收集
在15cm培养皿中，制备固体琼脂培养基(PDA培养基)，在固体琼脂培养基表面接种黄曲霉CICC 2049，温度25℃，湿度50-60％，培养7日，让培养基表面长满黄曲霉孢子。
向培养基表面倒入无菌水，洗下(震荡，或者用光滑的无菌玻璃涂布棒轻轻刮蹭)培养基表面的黄曲霉孢子，用移液器吸出孢子悬液，使用灭菌过的擦镜纸(或者砂芯漏斗、滤纸等)过滤，去除菌丝，保留孢子，滤过的液体装入离心管，离心后，收集沉淀的休眠孢子，去除上清液体。得到的孢子还要用染色体染色法对其染色体染色，并观察和确认孢子内的染色体是单倍体状态。
2)黄曲霉孢子预处理
用电击缓冲液重悬孢子沉淀(加入电击缓冲液的体积应能填充满离心管)，再离心，收集孢子沉淀，去除上清液体。重复上述步骤两次后，再次将孢子重悬于电击缓冲液中，显微镜观察，确认孢子悬液中无菌丝体混杂污染，以及确认孢子均未萌发。最后一次将孢子重悬于电击缓冲液时，应控制好电击缓冲液的体积，保持黄曲霉孢子悬液中孢子浓度为108个/ml。
所述电击缓冲液由终浓度为1mmol/L的HEPES和终浓度为50mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为7.0。
3)使用HDEN法电击黄曲霉孢子
在96孔细胞培养板的孔中加入60μl的黄曲霉孢子悬液，及10μg绿色荧光蛋白的编码RNA，混匀，得到孢子与RNA混合物，将容器置于冰上冰浴10min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1电转仪进行HDEN法电击，将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与RNA混合物内部，通电，使得孢子与RNA混合物内部产生电场，电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴10min，然后将孢子和RNA混合物吸出，得到导入外源ssRNA的休眠的黄曲霉孢子；
本实施例电击参数如下：电压400V，脉宽2000ms，重复5次，每次间隔400ms。
4)验证实验
将上述吸出的孢子和RNA混合物，加入到100倍体积的YPD培养基中，30℃培养20小时后，用激光共聚焦显微镜观察。
在进行上述实验步骤的同时，需要制备对照组：将未电击的、相同的“孢子和RNA混合物”，加入到另一YPD培养基中，相同条件下培养，然后用激光共聚焦显微镜进行观察。
结果显示：对照组的细胞无荧光，样品组至少95％的细胞有绿色荧光，表明有成功的RNA转化。
实施例2
在黄曲霉细胞中表达红色荧光蛋白(RFP)：
一、质粒构建
RFP的核酸序列如SEQ ID NO.7所示，
RFP的蛋白序列如SEQ ID NO.8所示，
扩增RFP基因的引物如下：
上游引物：RFP-F:5'CGGAATTCGCCACCATGGCCTCCTCCGAGGACGT 3'
下游引物：RFP-R:5'TCGAGCTCGTTAGGCGCCGGTGGAGTGG 3'
上游引物5端带有EcoR I酶切位点，带下划线的GCCACC序列，用于促进该DNA转录成RNA后，翻译起始因子与RNA结合，该序列与所表达的目的基因的起始密码子ATG紧邻。
下游引物5端带有Sal I酶切位点。
按照实施例1的做法，把RFP基因通过PCR扩增，做分子克隆，连接到pGEM-T easy载体上，再做体外转录，并将所得RNA转化宿主孢子。
二、使用红色荧光蛋白的编码RNA在黄曲霉休眠孢子中表达红色荧光蛋白，步骤如下：
1)黄曲霉培养和孢子收集
在15cm培养皿中，制备固体琼脂培养基(YPD培养基)，在固体琼脂培养基表面接种黄曲霉CICC 2049，在温度16℃，湿度15-50％下，培养15日，让培养基表面长满黄曲霉孢子。
向培养基表面倒入无菌水，洗下(震荡，或者用光滑的无菌玻璃涂布棒轻轻刮蹭)培养基表面的黄曲霉孢子，用移液器吸出孢子悬液，使用灭菌过的擦镜纸(或者砂芯漏斗、滤纸等)过滤，去除菌丝，保留孢子，滤过的液体装入离心管，离心后，收集沉淀的休眠孢子，去除上清液体。得到的孢子还要用染色体染色法对其染色体染色，并观察和确认孢子内的染色体是单倍体状态。
2)黄曲霉孢子预处理
用电击缓冲液重悬孢子沉淀(加入电击缓冲液的体积应能填充满离心管)，再离心，收集孢子沉淀，去除上清液体。重复上述步骤两次后，再次将孢子重悬于电击缓冲液中，显微镜观察，确认孢子悬液中无菌丝体混杂污染，以及确认孢子均未萌发。最后一次将孢子重悬于电击缓冲液时，应控制好电击缓冲液的体积，保持黄曲霉孢子悬液中孢子浓度为1011个/ml。
所述电击缓冲液由终浓度为0.01mmol/L的HEPES和终浓度为0.5mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为3.0。
3)使用HDEN法电击黄曲霉孢子
在96孔细胞培养板的孔中加入0.6μl的黄曲霉孢子悬液，及0.1μg红色荧光蛋白的编码RNA，混匀，得到孢子与RNA混合物，将容器置于冰上冰浴15min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1电转仪进行HDEN法电击，将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与RNA混合物内部，通电，使得孢子与RNA混合物内部产生电场，电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴15min，然后将孢子和RNA混合物吸出，得到导入外源ssRNA的休眠的黄曲霉孢子；
本实施例电击参数如下：电压1V，脉宽2000000ms，重复100次，每次间隔5ms。
4)验证实验
将上述吸出的孢子和RNA混合物，加入到10倍体积的YPD培养基中，10℃培养25小时后，用激光共聚焦显微镜观察。
在进行上述实验步骤的同时，需要制备对照组：将未电击的、相同的“孢子和RNA混合物”，加入到另一YPD培养基中，相同条件下培养，然后用激光共聚焦显微镜进行观察。
结果显示：对照组的细胞无荧光，样品组至少90％以上的细胞有红色荧光，表明有成功的RNA转化。
实施例3
黄曲霉细胞中表达黄色荧光蛋白(YFP)：
一、质粒构建
YFP的核酸序列如SEQ ID NO.9所示，
YFP的蛋白序列如SEQ ID NO.10所示，
采用与实施例1中GFP相同的引物，并按照同样的实验步骤和方法把GFP基因通过PCR扩增，做分子克隆，连接到pGEM-T easy载体上，再做体外转录，并将所得RNA转化宿主孢子。
二、使用黄色荧光蛋白的编码RNA在黄曲霉休眠孢子中表达黄色荧光蛋白，步骤如下：
1)黄曲霉培养和孢子收集
在15cm培养皿中，制备固体琼脂培养基(PDA培养基)，在固体琼脂培养基表面接种黄曲霉CICC 2049，在温度40℃，湿度60-85％下，培养3日，让培养基表面长满黄曲霉孢子。
向培养基表面倒入无菌水，洗下(震荡，或者用光滑的无菌玻璃涂布棒轻轻刮蹭)培养基表面的黄曲霉孢子，用移液器吸出孢子悬液，使用灭菌过的擦镜纸(或者砂芯漏斗、滤纸等)过滤，去除菌丝，保留孢子，滤过的液体装入离心管，离心后，收集沉淀的休眠孢子，去除上清液体。得到的孢子还要用染色体染色法对其染色体染色，并观察和确认孢子内的染色体是单倍体状态。
2)黄曲霉孢子预处理
用电击缓冲液重悬孢子沉淀(加入电击缓冲液的体积应能填充满离心管)，再离心，收集孢子沉淀，去除上清液体。重复上述步骤两次后，再次将孢子重悬于电击缓冲液中，显微镜观察，确认孢子悬液中无菌丝体混杂污染，以及确认孢子均未萌发。最后一次将孢子重悬于电击缓冲液时，应控制好电击缓冲液的体积，保持黄曲霉孢子悬液中孢子浓度为104个/ml。
所述电击缓冲液由终浓度为100mmol/L的HEPES和终浓度为5000mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为7.0。
3)使用HDEN法电击黄曲霉孢子
在96孔细胞培养板的孔中加入60000μl的黄曲霉孢子悬液，及10000μg红色荧光蛋白的编码RNA，混匀，得到孢子与RNA混合物，将容器置于冰上冰浴10min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1电转仪进行HDEN法电击，将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与RNA混合物内部，通电，使得孢子与RNA混合物内部产生电场，电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴10min，然后将孢子和质粒混合物吸出，得到导入外源ssRNA的休眠的黄曲霉孢子；
本实施例电击参数如下：电压6000V，脉宽2ms，重复1次，间隔50000ms。
4)验证实验
将上述吸出的孢子和RNA混合物，加入到10倍体积的YPD培养基中，40℃培养24小时后，用激光共聚焦显微镜观察。
在进行上述实验步骤的同时，需要制备对照组：将未电击的、相同的“孢子和RNA混合物”，加入到另一YPD培养基中，相同条件下培养，然后用激光共聚焦显微镜进行观察。
结果显示：对照组的细胞无荧光，样品组至少90％以上的细胞有黄色荧光，表明有成功的RNA转化。
实施例4
本实施例电击参数为：电压30V，脉宽1000000ms，电击50次，间隔5000ms，其它同实施例1。
实施例5
本实施例电击参数为：电压3000V，脉宽100ms，电击5次，间隔25000ms，其它同实施例1。
本发明所述的将编码蛋白质的线性RNA导入细胞、在细胞内表达的蛋白质，可以是该细胞、该物种自身就能编码能表达的蛋白质，也可以是其它生物物种来源的蛋白质，或者是人工设计的蛋白质。
所有的外源单链编码蛋白质的RNA，都可以用本发明的方法做转化，不仅限于实施例所述绿色、红色或黄色荧光蛋白的编码RNA。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种在黄曲霉未萌发孢子中转化外源ssRNA的方法
<130> 1
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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