一种鲟鱼软骨提取物的提取方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鲟鱼软骨提取物的提取方法。

背景技术：

鲟鱼是世界上唯一生活在水中的活化石，是所有鱼类中营养价值最高的一种鱼类。中国是鲟鱼养殖最多、分布最广、产量最高的国家，鲟鱼全身遍布软骨，鲟鱼头、脊索及鳍中含有的软骨约占体重10%。软骨又称明骨、鱼脑，是软骨鱼类鲟鱼特有的组织，除供食用外，还具有独特的保健药用功效。本草拾遗记载：鲨鱼翅、鲟鱼骨，食之明目壮阳，延年益寿。软骨组织中含丰富的硫酸软骨素，是一种酸性粘多糖（糖胺多糖），鲟鱼软骨含量可达30%。经现代医学证明，它有降血脂、抗动脉硬化、消炎镇痛、恢复关节活动能力、增强人体软骨弹性，抗衰老、耐疲劳等功能，因此软骨提取物是一种很好的药用来源。

创面是正常皮肤（组织）在外界致伤因子如外科手术、外力、热、电流、化学物质、低温以及机体内在因素如局部血液供应障碍等作用下所导致的损害。常伴有皮肤完整性的破坏以及一定量正常组织的丢失，同时，皮肤的正常功能受损。每年全国受交通事故、意外跌落、动物咬伤、外科手术、战争等因素导致的创伤人群多达数百万人，创伤成为不可忽视的疾病，因此促进创面愈合就成为疾病防治的重要手段。目前用于创面愈合的药物主要有维生素类：维生素C注射液、维生素B12、维生素B2、维生素B6、泛酸等；微量元素类：锌制剂类；中药等有效成分：七叶皂苷钠、壳聚糖等。然而上述产品获得过程复杂，需要不断地提取和纯化，成本高，费用高，人员多。本研究转向从饲养史氏鲟鱼（主要产物鱼子酱）副产物软骨提取物具有消炎镇痛的功效角度出发，利用鲟鱼软骨提取物研究了其促创面愈合的功效，对于进一步开拓鲟鱼软骨素市场及进一步研究利用其生理功能具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种促创面愈合的鲟鱼软骨提取物的提取方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

鲟鱼软骨提取物提取方法：

a、将鲟鱼加水煮熟，剔除鲟鱼上的鱼肉等杂质，烘干，将软骨进行粉碎，粉碎后软骨粉末转至烧杯中，加入95%乙醇浸泡24h，去乙醇，软骨重复用95%乙醇浸泡一次；50℃鼓风干燥脱脂后的鲟鱼软骨，备用；

b、将上述鲟鱼软骨进行碱解，碱解温度为40℃，碱解时间为3h，碱解溶液用量为鲟鱼软骨重量的6倍，碱解后将溶液调pH至中性，冷却离心，获得碱解液；

c、接着对碱解液进行盐解，盐解时间20min，盐解温度90℃，盐解后将其冷却离心；

d、接着离心后的盐解液进行酶解，酶解pH8.5-8.9，酶解时间2.5h，酶解温度40±2℃，酶解后，将酶解温度调至80℃，加热15min，使酶失活，冷却离心，获得酶解溶液；

e、将酶解溶液加入95％乙醇，体积比为酶解溶液：95%乙醇=1:3，边加入边搅拌；然后静置沉淀1h，去除上清液，加入3wt.%NaCl至沉淀溶解，再按溶液：乙醇=1:3的体积比加入95％乙醇，边加边搅拌；然后静置沉淀1h，去除上清液，所得沉淀物置于50℃减压干燥箱干燥，粉碎，得到鲟鱼软骨提取物。

所述的步骤b、c、d中所用离心条件为3000rpm，10min。

所述的步骤b中所用碱种类为NaOH，碱浓度为5wt.％。

所述的步骤c中所用盐种类为NaCl，加入NaCl使溶液中的盐浓度为4 wt.％。

所述的步骤d中所用酶为胰蛋白酶，酶活力为200U，加入胰蛋白酶粉使溶液中的胰蛋白酶浓度为0.4 wt.%。

所述的方法制备获得的鲟鱼软骨提取物。

所述的鲟鱼软骨提取物在制备促创面愈合药物中的应用。

采用本发明后可达到以下的效果：本发明将碱解、盐解与酶解工艺结合，促进软骨组织中蛋白质分解，产品颜色为乳白色，粗产品得率为21％左右，其中葡萄糖醛酸的最高含量达34.28％。

本发明的优点在于：

1、提供鲟鱼软骨提取物提取方法，将酶解、盐解与碱解工艺相结合，优化鲟鱼软骨提取物的提取工艺，提高鲟鱼软骨提取物的提取得率及质量，促进其经济效益的提升。

2、提供鲟鱼软骨提取物促创面愈合的研究，用鲟鱼软骨提取物水溶液涂抹的小鼠创口比用生理盐水涂抹愈合得早，生成的疤痕不明显，再生皮肤光滑如常，创口的皮肤有毛发新生。

3、提供一种养殖鲟鱼副产物—软骨新的利用可能性，对于进一步开拓鲟鱼软骨素市场及进一步研究利用其生理功能具有重要意义。

附图说明

图1. 鲟鱼软骨提取物，其中硫酸软骨素含量约为57%。

图2. 左侧创面：第5天涂抹红霉素眼膏+生理盐水。

图3. 右侧创面：第5天涂抹红霉素眼膏+软骨提取物。

图4. 左侧创面：第10天涂抹红霉素眼膏+生理盐水。

图5. 右侧创面：第10天涂抹红霉素眼膏+软骨提取物。

图6. 左侧创面：第15天涂抹红霉素眼膏+生理盐水。

图7. 右侧创面：第15天涂抹红霉素眼膏+软骨提取物。

图8. 左侧创面：第20天涂抹红霉素眼膏+生理盐水。

图9. 右侧创面：第20天涂抹红霉素眼膏+软骨提取物。

具体实施方式

实施例1

将清洗后的鲟鱼软骨进行碱解，碱种类为Na0H，碱浓度为5％，碱解时间3h，碱解温度40℃，碱液用量约为鲟鱼软骨重量的6倍；碱解后将溶液调pH至中性，冷却离心。将调至中性的碱解液用NaCl进行盐解，加入NaCl使溶液中的盐浓度为4％，盐解温度90℃，盐解时间20min，盐解后冷却离心。取上清液加入 胰蛋白酶进行酶解，酶活力为200U，加入胰蛋白酶粉使溶液中的胰蛋白酶浓度为0.4%，酶解温度40±2℃，酶解pH为8.5，酶解时间2.5h，酶解后，将酶解温度调至80℃，加热15min，使酶失活，冷却离心。将酶解后的溶液按1:3(v/v)加入95％乙醇，边加入边用玻棒搅拌；然后静置沉淀1h，去除上清液，加入3%NaCl至沉淀溶解，再按1:3的体积比加入95％乙醇，边加入边用玻棒搅拌；然后静置沉淀1h，去除上清液，所得沉淀物置于50℃减压干燥箱干燥，粉碎，得到白色鲟鱼软骨提取物粗品。粗产品得率为34.28％，其中氨基已糖的含量为34.28％。

实施例2

将清洗后的鲟鱼软骨进行碱解，碱种类为Na0H，碱浓度为6％，碱解时间4h，碱解温度40℃，碱液用量约为鲟鱼软骨重量的7倍；碱解后将溶液调pH至中性，冷却离心。将调至中性的碱解液用NaCl进行盐解，加入NaCl使溶液中的盐浓度为5％，盐解温度90℃，盐解时间20min，盐解后冷却离心。取上清液加入 胰蛋白酶进行酶解，酶活力为200U，加入胰蛋白酶粉使溶液中的胰蛋白酶浓度为0.5%，酶解温度50±2℃，酶解pH为8.9，酶解时间3h，酶解后，将酶解温度调至80℃，加热15min，使酶失活，冷却离心。将酶解后的溶液按1:4(v/v)加入95％乙醇，边加入边用玻棒搅拌；然后静置沉淀1h，去除上清液，加入4%NaCl至沉淀溶解，再按1:4的体积比加入95％乙醇，边加入边用玻棒搅拌；然后静置沉淀1h，去除上清液，所得沉淀物置于50℃减压干燥箱干燥，粉碎，得到白色鲟鱼软骨提取物粗品。粗产品得率为28.75％，其中氨基已糖的含量为24.83％。

实施例3

将清洗后的鲟鱼软骨进行碱解，碱种类为Na0H，碱浓度为7％，碱解时间5h，碱解温度40℃，碱液用量约为鲟鱼软骨重量的6倍；碱解后将溶液调pH至中性，冷却离心。将调至中性的碱解液用NaCl进行盐解，加入NaCl使溶液中的盐浓度为6％，盐解温度90℃，盐解时间20min，盐解后冷却离心。取上清液加入 胰蛋白酶进行酶解，酶活力为200U，加入胰蛋白酶粉使溶液中的胰蛋白酶浓度为0.6%，酶解温度60±2℃，酶解pH为8.6，酶解时间3.5h，酶解后，将酶解温度调至80℃，加热15min，使酶失活，冷却离心。将酶解后的溶液按1:5(v/v)加入95％乙醇，边加入边用玻棒搅拌；然后静置沉淀1h，去除上清液，加入5%NaCl至沉淀溶解，再按1:5的体积比加入95％乙醇，边加入边用玻棒搅拌；然后静置沉淀1h，去除上清液，所得沉淀物置于50℃减压干燥箱干燥，粉碎，得到白色鲟鱼软骨提取物粗品。粗产品得率为24.51％，其中氨基已糖的含量为19.56％。

实施例4

1.鲟鱼软骨提取物促创面愈合：

a、实验药物 鲟鱼软骨提取物（自制），用双蒸馏水溶解，分别配制成40mg/ml、80mg/ml、120mg/m的水溶液。空白对照组选择生理盐水。

b、实验动物 昆明小鼠，SPF级，10只，雄雌各半，体重（20±2）g。将小鼠随机分为3组，鲟鱼软骨提取物低剂量组（3只），鲟鱼软骨提取物中剂量组（3只），鲟鱼软骨提取物高中剂量组（3只）。

c、创伤模型实验 各组小鼠用1％戊巴比妥钠以80mg/kg（0.16ml）的剂量腹腔麻醉，剪毛处理，碘伏消毒，在小鼠颈背部中央制造4个纵行长lcm皮肤全层切口，左侧2个创口，右侧2个创口，单只分笼饲养。

d、创面处理 损伤模型建立后，用无菌纱布清理创口血污，然后各组小鼠右侧创口分别用鲟鱼软骨提取物溶液(高中低溶液)，按0.1ml/只的剂量涂抹于相应组小鼠的创口（外延至2-3mm，厚度约0.5mm)，左侧创口涂药，然后均匀涂抹红霉素软膏。一天涂两次，共给药21d。

e、常规观察 术后第1、2、3 周观察记录创口的出血量及局部情况，创口愈合时间及愈合创面的特征。

在小鼠背部皮肤缺损修复处取材，所取皮肤包含2 mm 宽的正常皮肤边缘。所取材料用10%中性福尔马林固定，常规染色，石蜡脱片，切5μm厚切片，常规HE染色，显微镜下观察新生肉芽组织中成纤维细胞的分布、胶原纤维的形态和排列疏密以及再上皮化状况。给药21天后，用鲟鱼软骨提取物水溶液涂抹的小鼠创口比用生理盐水涂抹愈合得早，生成的疤痕不明显，再生皮肤光滑如常，给药21天后创口的皮肤有毛发新生。给予生理盐水涂抹的创口愈合较晚，再生皮肤较粗糙，无毛发生长。

实验药物为步骤a的鲟鱼软骨提取物水溶液，而不是含鲟鱼软骨提取物的复方膜剂。

本实验采用自身对照法，小鼠左右两侧的创口分别涂抹药物和生理盐水。

采用本发明后可达到以下的效果：用鲟鱼软骨提取物水溶液涂抹的小鼠创口比用生理盐水涂抹愈合得早，生成的疤痕不明显，再生皮肤光滑如常，给药21天后创口的皮肤有毛发新生。给予生理盐水涂抹的创口愈合较晚，再生皮肤较粗糙，无毛发生长。

小鼠创面愈合情况观察（创面长度：mm)

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。