一种优化的pBBR1MCS系列载体及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种广宿主的表达载体的构建。

背景技术：

pBBR1MCS系列载体包括pBBR1MCS、pBBR1MCS2-5等一系列广宿主载体，这类载体可以在多种宿主中复制，像Acetobacter xylinum，Alcaligenes eutrophus，Bartonella bacilliformis，Bordetella spp.，Brucella spp.，Caulobacter crescentus，Escherichia coli，Paracoccous denitrificans，Pseudomonas fluorescens，Rhizobium meliloti，Rhodobacter sphaeroides，Vibrio cholerae，Xanthomonas campestris等。这些载体的共同特征包括：(1)载体大小较小(﹤5.3kb)，可以插入的外源片段较大；(2)拥有一个扩展的多克隆位点(MCS)，(3)含有LacZα短肽编码基因，可以利用α互补直接筛选插入了外源片段的重组子，(4)可以与包括IncP,IncQ和IncW等在内的多种不兼容群的质粒兼容。

但是，Sonja等人(2013)的研究发现，若利用pBBR1MCS系列载体表达外源基因，因为表达的外源蛋白的N端同β-半乳糖苷酶α端的大约20个短肽融合表达，可能会影响目的蛋白的活性。因此，若要将此系列载体应用于外源基因的表达，需要对其表达元件进行改造。

技术实现要素：

本发明需要解决的问题是克服pBBR1MCS系列载体的缺陷，提供一种优化的pBBR1MCS系列载体，将该载体的LacZα短肽编码基因、lac启动子替换成来源于pGEX4T-1的tac启动子，使该载体更适用于基因的表达，目的基因可以用IPTG诱导表达且N端不含β-半乳糖苷酶α端的短肽，该载体的LacZα表达相关的终止序列可以被替换成pGEX4T-1的终止序列，也可以不用替换。

本发明提供的优化的表达载体构建流程如下：利用PCR技术分别扩增来源于pGEX4T-1的包括Ptac启动子和调控序列LacIq的片段Ptac、终止序列Ter和来自pBBR1MCS系列载体的多克隆位点MCS，其中，MCS位点在设计引物时引入了Bgl II酶切位点；利用融合PCR技术将Ptac、Ter和MCS序列融合，获得表达元件PMT，在设计PMT片段引物时两端分别引入Kpn I和Sac I酶切位点；利用PCR扩增得到pBBR1MCS系列载体上除lac启动子、LacZα编码序列、MCS及终止序列以外的骨架结构pMCS，设计引物时PMCS两端分别引入Kpn I和Sac I酶切位点；利用Kpn I和Sac I对表达元件PMT和骨架结构pMCS进行酶切后利用Takara公司的连接试剂盒进行连接，获得改造的表达载体pBBRtac。

同原有质粒相比，优化载体的多克隆位点引入了Bgl II的酶切位点，便于基因的克隆和功能鉴定。

本发明构建的表达载体为pBBRtac系列载体，即pBBRtac，pBBRtac2-5。

本发明构建的广宿主载体pBBRtac采用Ptac启动子，同Plac启动子相比，该启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，转录水平更高，更有利于目的蛋白的表达，同时，去除了N端融合的20个左右氨基酸的β-半乳糖苷酶α端的短肽将有利于外源蛋白的正确折叠，使其形成有活性的蛋白，这非常有利于目标基因在多种宿主中的高效表达。

本发明构建的广宿主载体已成功应用于大肠杆菌中。

附图说明

图1市售pBBR1MCS3质粒图谱

图2 pBBRtac3质粒图谱

图3 UgpG表达的SDS-PAGE分析

具体实施方式

实施例1pBBRtac3载体构建

本发明以广宿主载体pBBR1MCS3为改造模板，将该载体的LacZα编码基因、lac启动子替换成来源于pGEX4T-1的tac启动子，使其适用于外源基因的表达，该载体的LacZα表达相关的终止序列可以被替换成pGEX4G-1的终止序列，也可以不用替换，本实施例中将pBBR1MCS3终止序列替换成pGEX4T-1的终止序列。同时，对该载体的多克隆位点进行改造，引入了Bgl II的酶切位点，得到重组质粒pBBRtac3。

pBBRtac3的设计思路和技术路线如下：

1.PCR扩增包含tac启动子和调控序列lacIq的片段Ptac以及终止序列Ter

以质粒pGEX-4T-1(GenBank No.U13853)为模板，根据基因的序列，利用primer5.0设计引物并扩增包含tac启动子和lacIq调控序列的片段Ptac以及终止序列Ter。设计引物序列为:Ptac-F：GATAACCGTATTACCGCCTTTG(SEQ ID NO.1)

Ptac-R：TCGACCTCGAGGGGGGGCCCACCTAGTATAGGGGACATGAA(SEQ ID NO.2)

Ter-F：GCCACCGCGGTGAGATCTATCTGCCTCGCGCGTTTCGGT(SEQ ID NO.3)

Ter-R：CGCGTTATTGAAGCATTTATCAGGGT(SEQ ID NO.4)

使用的酶是Takara公司高保真的HS DNA Polymerase，PCR反应条件为：95℃5min；95℃45s；50℃/55℃45s；72℃2.5min/30s，30个循环；72℃10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳及测序验证。

2.PCR扩增pBBR1MCS-3的多克隆位点MCS片段

以pBBR1MCS-3为模板，以MCS-R和MCS-F为引物，利用购自Takara公司的 HS DNA Polymerase，采用常规PCR方法扩增多克隆位点MCS片段，序列如SEQID NO.7所示。在设计引物时去掉了原有的Kpn I和Sac I位点，引入了Bgl II的酶切位点(下划线部分)。测序结果表明，该多克隆位点既包含了原质粒上的的Xho I、Sma I、Spe I等酶切位点，同时也成功引入了酶切位点Bgl II。

SEQ ID NO.5：

CAATTTCACACAGGAAACAGTACATATGGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGAGATCTATCTGCCTCGCGCGTTT

设计引物如下：

MCS-F：CAATTTCACACAGGAAACAGTACATATGGGGCCCCCCCTCGAGGTCGAC(SEQ ID NO.6)

MCS-R：AAACGCGCGAGGCAGATAGATCTCACCGCGGTGGCGGCCG(SEQ ID NO.7)

PCR反应条件：95℃5min；95℃45s；55℃45s；72℃30s，30个循环；72℃10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳及测序验证。

3.融合PCR构建表达元件PMT

该过程通过两步来实现。第一步，融合PCR。在设计扩增Ptac、MCS和Ter片段的引物时，分别引入了同相邻片段重叠的序列，这些序列可以作为融合PCR的引物，并且，通过计算使PCR体系中各片段的摩尔浓度一致。PCR体系(25μL)为：2×GC Buffer 12.5μL，dNTP 2μL， HS DNA Polymerase 0.4μL，MCS 2.8μL，Ptac 5.6μL，Ter 1.7μL，PCR反应条件：95℃5min；95℃45s，65℃2.5min，72℃3.5min，25个循环；72℃10min。

第二步，巢氏PCR。以融合PCR产物为模板，以PMT-F和PMT-R为引物进行巢氏PCR扩增，条件如下：95℃5min；95℃45s；60℃45s；72℃2.5min，30个循环；72℃10min。

引物序列如下：

PMT-F:AGGGGTACCATTCCGACACCATCGAATGGTGCAAAAC(SEQ ID NO.8)

PMT-R:CGGCCGAGCTCGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTT(SEQ ID NO.9)

4.PCR扩增pBBR1MCS-3质粒的骨架pMCS-3

以pBBR1MCS-3(GenBank No.U25059)为模板，以pMCS3-F和pMCS3-R为引物，利用HS DNA Polymerase扩增pBBR1MCS-3质粒上除lac启动子、LacZα编码序列、MCS及终止序列的骨架结构片段pMCS-3，PCR反应条件：95℃5min；95℃45s；60℃45s；72℃5min，30个循环；72℃10min。

引物序列如下：

pMCS3-F:GCGGCGAGCTCTTGTAAGCGTTAATATTTTG(SEQ ID NO.10)

pMCS3-R:ACGGGTACCAATTGCGTTGCGCTCACTGC(SEQ ID NO.11)

5.pBBRtac3表达载体构建

将PMT片段和pMCS片段分别进行切胶回收，利用限制性内切酶Kpn I和Sac I对纯化后的片段进行双酶切，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测并回收，回收后的片段利用Takara的连接试剂盒进行连接，连接体系为：pMCS3片段3μL，PMT片段6μL，Solution I 9μL，16℃过夜连接。将连接产物加入氯化钙法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃水浴热激90s，快速置于冰上1-3min。加入新鲜LB培养基800μL，于37℃振荡培养45min。取200μL菌液涂布于含有终浓度为12.5μg/ml四环素的LB固体培养基上，37℃培养至有单菌落出现。挑取单菌落至含有四环素的LB液体培养基中，37℃振荡过夜培养，根据天根质粒提取试剂盒操作说明提取质粒。以质粒为模板，设计两对引物PMT-F-in、PMT-R-in和SacI-F、SacI-R分别进行PCR反应，同时，采用Kpn I和Sac I双酶切的办法对质粒加以鉴定。将鉴定正确的质粒送往上海生工生物公司测序，所得的质粒命名为pBBRtac3，序列如SEQ ID NO.12所示。其中，3019-5464位为PMT序列。

SEQ ID NO.12

CTCGGGCCGTCTCTTGGGCTTGATCGGCCTTCTTGCGCATCTCACGCGCTCCTGCGGCGGCCTGTAGGGCAGGCTCATACCCCTGCCGAACCGCTTTTGTCAGCCGGTCGGCCACGGCTTCCGGCGTCTCAACGCGCTTTGAGATTCCCAGCTTTTCGGCCAATCCCTGCGGTGCATAGGCGCGTGGCTCGACCGCTTGCGGGCTGATGGTGACGTGGCCCACTGGTGGCCGCTCCAGGGCCTCGTAGAACGCCTGAATGCGCGTGTGACGTGCCTTGCTGCCCTCGATGCCCCGTTGCAGCCCTAGATCGGCCACAGCGGCCGCAAACGTGGTCTGGTCGCGGGTCATCTGCGCTTTGTTGCCGATGAACTCCTTGGCCGACAGCCTGCCGTCCTGCGTCAGCGGCACCACGAACGCGGTCATGTGCGGGCTGGTTTCGTCACGGTGGATGCTGGCCGTCACGATGCGATCCGCCCCGTACTTGTCCGCCAGCCACTTGTGCGCCTTCTCGAAGAACGCCGCCTGCTGTTCTTGGCTGGCCGACTTCCACCATTCCGGGCTGGCCGTCATGACGTACTCGACCGCCAACACAGCGTCCTTGCGCCGCTTCTCTGGCAGCAACTCGCGCAGTCGGCCCATCGCTTCATCGGTGCTGCTGGCCGCCCAGTGCTCGTTCTCTGGCGTCCTGCTGGCGTCAGCGTTGGGCGTCTCGCGCTCGCGGTAGGCGTGCTTGAGACTGGCCGCCACGTTGCCCATTTTCGCCAGCTTCTTGCATCGCATGATCGCGTATGCCGCCATGCCTGCCCCTCCCTTTTGGTGTCCAACCGGCTCGACGGGGGCAGCGCAAGGCGGTGCCTCCGGCGGGCCACTCAATGCTTGAGTATA CTCACTAGACTTTGCTTCGCAAAGTCGTGACCGCCTACGGCGGCTGCGGCGCCCTACGGGCTTGCTCTCCGGGCTTCGCCCTGCGCGGTCGCTGCGCTCCCTTGCCAGCCCGTGGATATGTGGACGATGGCCGCGAGCGGCCACCGGCTGGCTCGCTTCGCTCGGCCCGTGGACAACCCTGCTGGACAAGCTGATGGACAGGCTGCGCCTGCCCACGAGCTTGACCACAGGGATTGCCCACCGGCTACCCAGCCTTCGACCACATACCCACCGGCTCCAACTGCGCGGCCTGCGGCCTTGCCCCATCAATTTTTTTAATTTTCTCTGGGGAAAAGCCTCCGGCCTGCGGCCTGCGCGCTTCGCTTGCCGGTTGGACACCAAGTGGAAGGCGGGTCAAGGCTCGCGCAGCGACCGCGCAGCGGCTTGGCCTTGACGCGCCTGGAACGACCCAAGCCTATGCGAGTGGGGGCAGTCGAAGGCGAAGCCCGCCCGCCTGCCCCCCGAGCCTCACGGCGGCGAGTGCGGGGGTTCCAAGGGGGCAGCGCCACCTTGGGCAAGGCCGAAGGCCGCGCAGTCGATCAACAAGCCCCGGAGGGGCCACTTTTTGCCGGAGGGGGAGCCGCGCCGAAGGCGTGGGGGAACCCCGCAGGGGTGCCCTTCTTTGGGCACCAAAGAACTAGATATAGGGCGAAATGCGAAAGACTTAAAAATCAACAACTTAAAAAAGGGGGGTACGCAACAGCTCATTGCGGCACCCCCCGCAATAGCTCATTGCGTAGGTTAAAGAAAATCTGTAATTGACTGCCACTTTTACGCAACGCATAATTGTTGTCGCGCTGCCGAAAAGTTGCAGCTGATTGCGCATGGTGCCGCAACCGTGCGGCACCCTACCGCATGGAGATAAGCATGGCCACGCAGTCCAGAGAAATCGGCATTCAAGCCAAGAACAAGCCCGGTCACTGGGTGCAAACGGAACGCAAAGCGCATGAGGCGTGGGCCGGGCTTATTGCGAGGAAACCCACGGCGGCAATGCTGCTGCATCACCTCGTGGCGCAGATGGGCCACCAGAACGCCGTGGTGGTCAGCCAGAAGACACTTTCCAAGCTCATCGGACGTTCTTTGCGGACGGTCCAATACGCAGTCAAGGACTTGGTGGCCGAGCGCTGGATCTCCGTCGTGAAGCTCAACGGCCCCGGCACCGTGTCGGCCTACGTGGTCAATGACCGCGTGGCGTGGGGCCAGCCCCGCGACCAGTTGCGCCTGTCGGTGTTCAGTGCCGCCGTGGTGGTTGATCACGACGACCAGGACGAATCGCTGTTGGGGCATGGCGACCTGCGCCGCATCCCGACCCTGTATCCGGGCGAGCAGCAACTACCGACCGGCCCCGGCGAGGAGCCGCCCAGCCAGCCCGGCATTCCGGGCATGGAACCAGACCTGCCAGCCTTGACCGAAACGGAGGAATGGGAACGGCGCGGGCAGCAGCGCCTGCCGATGCCCGATGAGCCGTGTTTTCTGGACGATGGCGAGCCGTTGGAGCCGCCGACACGGGTCACGCTGCCGCGCCGGTAGCACTTGGGTTGCGCAGCAACCCGTAAGTGCGCTGTTCCAGACTATCGGCTGTAGCCGCCTCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCGTTTTTATCAGGCTCTGGGAGGCAGAATAAATGATCATATCGTCAATTATTACCTCCACGGGGAGAGCCTGAGCAAACTGGC CTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAATAAACCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTGCCCTGAACCGACGACCGGGTCGAATTTGCTTTCGAATTTCTGCCATTCATCCGCTTATTATCACTTATTCAGGCGTAGCACCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAACTGCCTTAAAAAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAAGAGCTCGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGATAGATCTCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCACCTAGTATAGGGGACATGAATACTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAATATTTGCCAGAACCGTTATGATGTCGGCGCAAAAAACATTATCCAGAACGGGAGTGCGCCTTGAGCGACACGAATTATGCAGTGATTTACGACCTGCACAGCCATACCACAGCTTCCGATGGCTGCCTGACGCCAGAAGCATTGGTGCACCGTGCAGTCGATAACGTAATTCCAACGCCATCAAAAATAATTCGCGTCTGGCCTTCCTGTAGCCAGCTTTCATCAACATTAAATGTGAGCGAGTAACAACCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACGGCGGATTGACCGTAATGGGATAGGTTACGTTGGTGTAGATGGGCGCATCGTAACCGTGCATCTGCCAGTTTGAGGGGACGACGACAGTATCGGCCTCAGGAAGATCGCACTCCAGCCAGCTTTCCGGCACCGCTTCTGGTGCCGGAAACCAGGCAAAGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATCCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGT CTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCACCATTCGATGGTGTCGGAATGGTACCAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCATTTGCGCATTCACAGTTCTCCGCAAGAATTGATTGGCTCCAATTCTTGGAGTGGTGAATCCGTTAGCGAGGTGCCGCCGGCTTCCATTCAGGTCGAGGTGGCCCGGCTCCATGCACCGCGACGCAACGCGGGGAGGCAGACAAGGTATAGGGCGGCGCCTACAATCCATGCCAACCCGTTCCATGTGCTCGCCGAGGCGGCATAAATCGCCGTGACGATCAGCGGTCCAGTGATCGAAGTTAGGCTGGTAAGAGCCGCGAGCGATCCTTGAAGCTGTCCCTGATGGTCGTCATCTACCTGCCTGGACAGCATGGCCTGCAACGCGGGCATCCCGATGCCGCCGGAAGCGAGAAGAATCATAATGGGGAAGGCCATCCAGCCTCGCGTCGCGAACGCCAGCAAGACGTAGCCCAGCGCGTCGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATG CAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATCGCGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGACTGGGCGGCGGCCAAAGCGGTCGGACAGTGCTCCGAGAACGGGTGCGCATAGAAATTGCATCAACGCATATAGCGCTAGCAGCACGCCATAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTACCGGCATAACCAAGCCTATGCCTACAGCATCCAGGGTGACGGTGCCGAGGATGACGATGAGCGCATTGTTAGATTTCATACACGGTGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGCCCGCGTTCCTGCTGGCGCTGGGCCTGTTTCTGGCGCTGGACTTCCCGCTGTTCCGTCAGCAGCTTTTCGCCCACGGCCTTGATGATCGCGGCGGCCTTGGCCTGCATATCCCGATTCAACGGCCCCAGGGCGTCCAGAACGGGCTTCAGGCGCTCCCGAAGGT

引物序列：

PMT-F-in：ACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGC(SEQ ID NO.13)

PMT-R-in：GCGGATTGACCGTAATGGGATAGG(SEQ ID NO.14)

SacI-F：GGTGATGACGGTGAAAACCTCTG(SEQ ID NO.15)

SacI-R：CGGCACCTCGCTAACGGATTCACC(SEQ ID NO.16)

实施例2：载体pBBRtac3在大肠杆菌中表达检测

本实施例以鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.WG，保藏号为CCTCC No:M2013161)中UDP-葡萄糖焦磷酸化酶UgpG(GenBank No.KTF67651)基因在大肠杆菌中的表达为例，验证载体的有效性。所用引物序列如下：

UgpG-F:GCTCTAGAATGACGATCAAGCCGCTGCG(SEQ ID NO.17)

UgpG-R:GAAGATCTTCAACCGAGCGCACGC(SEQ ID NO.18)

1.重组表达载体及重组菌株的构建

以UgpG-F和UgpG-R为引物，以鞘氨醇单胞菌基因组为模板扩增UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因ugpG片段，分别利用Xba I和Bgl II对该片段和pBBRtac3进行双酶切，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测并回收，回收后的片段利用Takara的连接试剂盒进行连接，连接体系为：目的片段4μL，载体12μL，Solution I 16μL，16℃过夜连接。将连接产物转化氯化钙法制备 的大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃水浴热激90s，快速置于冰上1-3min。加入新鲜LB培养基800μL，于37℃振荡培养45min。取200μL菌液涂布于含有终浓度为12.5μg/ml四环素的LB固体培养基上，37℃培养至出现单菌落。挑取单菌落至含有四环素的LB液体培养基中，37℃振荡过夜培养，根据天根质粒提取试剂盒操作说明提取质粒。以提取的质粒为模板，以UgpG-F和UgpG-R为引物进行PCR反应，同时，采用XbaI和BglII双酶切的办法对质粒加以鉴定。将鉴定正确的质粒送往上海生工生物公司测序，表明UgpG片段已经连接至该载体，所得的重组质粒命名为pBBRtac-UgpG。

将该质粒采用相同的方法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取四环素平板上的单菌落，得到UgpG的表达菌株。

2.UgpG蛋白的诱导表达

将获得的表达菌株接种到10mL的LB培养基中活化后，转接至50mL新鲜的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入一定量的100mmol/L的IPTG使其终浓度为0.2mmol/L进行诱导，28℃诱导6h后停止培养。8,000rpm离心10min收集菌体，去离子水洗涤菌体两次，并将菌体重新悬浮于pH 7.2的PBS缓冲液中，进行超声破碎，超声破碎程序设定为超声2s、停5s，全程时间15min，功率＜400。将破碎后的样品8,000rpm离心25min，收集上清，进行SDS-PAGE分析。整个过程均以未转化质粒的大肠杆菌BL21(DE3)宿主作为对照。

3.蛋白表达的SDS-PAGE

在20μL待检测样品中加入5μL的5×Loading Buffer，混匀，在100℃水浴中煮沸5min后离心，取上清进行SDS-PAGE电泳，采用12％的分离胶和5％的堆积胶。附图2即SDS-PAGE分析结果，同对照相比，在37kDa处有显著的条带，大小与预期相符，应该为目的条带，证明UgpG为可溶性表达。