双gRNA、双gRNA文库、双gRNA载体文库及其制备方法和应用与流程

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种双grna、双grna文库、双grna载体文库及其制备方法和应用。

背景技术：

众所周知，蛋白质编码基因的转录只占全基因组转录的大约2％，其余的转录则均为非编码rna如microrna和lncrna的转录。其中，lncrna被定义为一组分子量大于200个核苷酸长度的非编码rnas，越来越多的研究表明，lncrna可能在各种机制中作为主要基因调控者，lncrna表达的紊乱通常与多种人类疾病，如癌症，密切相关。

到目前为止，已经有超过50,000的lncrna被发现，这比蛋白质编码基因的数量要多得多，这也为我们人类基因组的复杂性提供了进一步证据。lncrna是新型癌症生物标志物或治疗靶点的丰富来源，而且绝大部分lncrna的生物学功能还是未知，对lncrna进行功能性研究非常重要。

目前最常用的基因功能性研究平台是通过rna干扰(rnai)对细胞中的目标基因进行敲除，特异性剔除或关闭特定基因的表达，然后检测干扰结果，通过分析该干扰结果了解相关基因的功能。

遗憾的是，rnai主要在细胞质中发挥功能性作用，而risc复合物也位于细胞质中。然而许多lncrna都位于细胞核中，这大大增加了通过rna干扰敲除lncrna的难度。同时，rnai存在以下不足：(1)很难进行“回复实验”，因为外源性的配对物也受到rnai试剂的约束；(2)敲 除效率不高，极易出现高水平的假阴性表达，尤其在shrna载体中。因此寻找新的基因功能性研究方法具有十分重大的意义。

crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)是最新出现的一种由rna指导的cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。crispr/cas9是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制，在这一系统中，crrna(crispr-derivedrna)通过碱基配对与tracrrna(trans-activatingrna)结合形成双链rna，此tracrrna/crrna二元复合体指导cas9蛋白在crrna引导序列靶定位点切断双链dna。在基因组编辑过程中，tracrrna和crrna可以融合成为1条rna(singleguiderna，简称sgrna)表达，sgrna同样可以起到靶向剪切的作用。sgrna的序列中含有一段固定序列(即crrna支架序列)和一段目的dna识别序列，其中目的dna识别序列可与目的基因两条链中的其中一条进行碱基互补配对，而固定序列则用于招募cas9核酸酶。

鉴于crispr/cas9系统的高效性，针对蛋白质编码基因的敲除是比较容易的，因为一个微小的碱基缺失或插入就可以破坏开放阅读框，从而导致功能性基因产物的不表达。然而，非编码基因尤其是lncrna的情况则十分不同，一个小的碱基缺失或者插入不一定会导致lncrna功能缺失，如何对crispr/cas9基因编辑技术进行进一步改进、以实现对包括lncrna在内的所有基因或遗传元件的高效敲除是目前研究需要思考和解决的问题。

技术实现要素：

本发明提供了一种双grna，该双grna比sgrna分子具有更高的敲除效率。

一种双grna(dualgrna)，由第一启动子、grna-a、crrna支架序列、第二启动子和grna-b顺次连接而成。一个双grna分子靶向作用于相同的基因或遗传元件，其中，grna-a和grna-b分别由不同的启动子控制其独立表达，并分别与同一靶基因上的两个靶位点互补配对。从而该双grna能够招募cas9核酸酶在两个sgrna作用位点对靶基因进行剪切，大大提高了靶基因的敲除效率。

本发明还提供了一种双grna文库，该双grna文库包括针对靶基因的多个双grna，所述双grna的序列结构为：第一启动子-(grna-na)-crrna支架序列-第二启动子-(grna-nb)；

其中，n表示双grna的个数，n为≥1的整数。

同一双grna文库中的双grna可以是仅针对一个靶基因设计的，也可以是针对多个靶基因设计的若干个双grna集的组合，一个双grna集针对一个靶基因。

本发明中，所述第一启动子和第二启动子为互不相同的聚合酶iii启动子，如h1启动子或u6启动子。

本发明还提供了一种双grna载体文库，该载体文库由所述双grna文库与载体连接而成。本发明对载体无特殊要求，只要能够顺利转染细胞，使双grna能够在细胞内表达即可。

作为优选，所述载体上带有报告基因或抗性基因。报告基因或抗性基因有利于挑取靶基因被敲除的阳性克隆。

由于人工合成只能一次性获得长度大约为200nt的混合寡核苷酸，而本发明的双grna[第一启动子-(grna-a)-crrna支架序列-第二启动子-(grna-b)]的总长度超过400nt，难以一次性合成获得。

因此，本发明还提供了一种所述双grna载体文库的构建方法，该构建方法包括：

(1)针对一个双grna作用位点，合成序列结构为“pcr扩增短序列i-(grna-a)-间隔序列-(grna-b)-pcr扩增短序列ii”的单链寡核苷酸，其中，间隔序列的两端均带有ii类限制性内切酶的酶切位点；

其中，所述酶切位点可以是bsmbi、sapi、bsai；

所述pcr扩增短序列i的碱基序列为(如seqidno.1所示)：

5’-gtatgagaccacttggatcc-3’；

所述pcr扩增短序列ii的碱基序列为(如seqidno.2所示)：

5’-ccttattttaacttgctatt-3’；

将针对同一靶基因合成的所有单链寡核苷酸等量混合，或者，将针对所有靶基因合成的单链寡核苷酸等量混合，获得混合单链寡核苷酸库；

上述混合单链寡核苷酸库可以由美国customarray公司通过“定制芯片”的方法合成；

(2)以步骤(1)中的混合单链寡核苷酸库为模板，利用相应的引物进行pcr扩增，获得混合双链寡核苷酸库；

上下游引物分别与单链寡核苷酸中的pcr扩增短序列i和pcr扩增短序列ii相结合，扩增获得混合双链寡核苷酸库；通过pcr扩增不仅可以获得双链寡核苷酸，以便后续连入载体中，而且能增加单链寡核苷酸的克隆数。

(3)取经ii类限制性内切酶线性化的载体，将步骤(2)中的混合双链寡核苷酸库连入该载体的第一启动子下游，获得前期文库；

本步骤中的ii类限制性内切酶可以与步骤(1)相同，也可以不同，只要该ii类限制性内切酶能够在步骤(1)所述的酶切位点进行剪切即可。

本发明对第一启动子、第二启动子的来源均无要求，第一启动子可以是载体自身带有的，也可以是重组到载体上的外源性第一启动子。

(4)合成序列结构为“pcr扩增短序列i-crrna支架序列-第二启动 子-pcr扩增短序列ii”的单链寡核苷酸库；

其中，所述crrna支架序列的碱基序列为(如seqidno.3所示)：

5’-gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtcc-

-gttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgct-3’；

本步骤中，pcr扩增短序列i和pcr扩增短序列ii的碱基序列与步骤(1)中相同；

(5)以步骤(4)中的单链寡核苷酸库为模板，利用相应的引物进行pcr扩增，获得双链寡核苷酸库；

(6)在ii类限制性内切酶存在下，通过gibson组装法将步骤(5)中的双链寡核苷酸库连入步骤(3)中的前期文库中，获得所述双grna载体文库。

本步骤中的ii类限制性内切酶可以与步骤(1)相同，也可以不同，只要该ii类限制性内切酶能够在步骤(1)所述的酶切位点进行剪切即可。

ii类限制性内切酶在前期文库中的间隔序列两端进行酶切，从而步骤(5)的双链寡核苷酸库能连入间隔序列所在位置，获得具有完整双grna序列结构的双grna载体文库。

鉴于本发明的双grna对靶基因优异的靶向敲除性能，本发明还提供了所述双grna载体文库在基因敲除中的应用。

并且，本发明的双grna载体文库尤其适用于lncrna的敲除。

对此，本发明提供了两种利用所述双grna载体文库敲除lncrna的策略：

①对于序列连贯的lncrna，针对该lncrna两端设计grna-a和grna-b，构建双grna载体文库，并利用该双grna载体文库转染或感染细胞，对细胞内的靶lncrna进行敲除；

②对于序列中插入有其他基因或遗传元件的lncrna，以该lncrna 中第一个外显子及其上游的启动子作为靶点，设计grna-a和grna-b，构建双grna载体文库，并利用该双grna载体文库转染或感染细胞，对细胞内的靶lncrna进行敲除。

本发明还提供了一种用于研究相应基因功能的基因敲除细胞文库，该基因敲除细胞文库是通过向稳定表达cas9核酸酶的细胞中转染或感染所述双grna载体文库获得的。

双grna载体文库转染或感染至稳定表达cas9核酸酶的细胞内后，能够招募cas9核酸酶将与双grna相对应的靶基因敲除，靶基因被敲除后的细胞表现型发生改变，从而可以用于确定靶基因功能。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)与grna相比，本发明的双grna中，grna-a和grna-b分别由不同的启动子控制其独立表达，并分别与靶基因上的两个靶位点互补配对，这使得该双grna能够招募cas9核酸酶在两个grna作用位点对靶基因进行剪切，对于蛋白编码基因敲除效率可达100％，而grna的敲除效率最高只能达到66.7％；

(2)与sirna、shrna相比，本发明的双grna可以回复实验，验证敲除基因的功能。

附图说明

图1为本发明双grna载体文库的构建流程图；

其中，h1、u6分别表示h1、u6启动子，lenti-hygro表示lenti-hygro载体，cutwithbsmbi表示用限制性内切酶bsmbi对lenti-hygro载体进行剪切，hygro表示潮霉素抗性基因，scaffold表示支架，firststepcloning表示第一步克隆，spacer表示间隔序列，grna1、grna2分别表示一条sgrna，secondstepcloning表示第二步克隆，lenti-dual grna-hygro-prelibrary表示前期文库，lenti-dualgrna-hygro-library表示双grnas载体文库；下同；

图2为双grna对lncrna的敲除机制示意图；

其中，lncrna表示长片段非编码rna，grna-1、grna-2分别表示一条sgrna，flanking表示侧翼(序列或区域)，1^stexon表示第一个外显子，lastexon表示最后一个外显子，myc表示myc基因，hcas9表示人类密码子优化的cas9核酸酶基因，nls表示核定位信号，deleted表示原lncrna已被双grna敲除；下同；

图3为sgrna和双grna的基因敲除效率比较结果；

其中，singlegrna表示单条sgrna，dualgrna表示两条sgrna即双grna，ef1表示启动子，e1、e2、e3分别表示uca1基因的三个外显子，marker表示dna分子量标准，vector表示载体，uca1ko(2、4、14、16、19)表示uca1基因被singlegrna敲除的克隆(克隆编号为2、4、14、16、19)，uca1ko(3、5、12、17)表示uca1基因被dualgrna敲除的克隆(克隆编号为3、5、12、17)，genomicpcr表示基因组dna的pcr结果；下同；

图4为不同敲除策略下双grna对长lncrna的敲除效率比较结果；

其中，chr8表示8号染色体，1～8表示ptv1基因上的八个外显子、且第3～5个外显子分别是mir-1205,1206,1207，exon1、exon8表示第1、8个外显子，e1ko表示ptv1基因第1个外显子被敲除的克隆，e1+pko表示ptv1基因第1个外显子及其上游启动子区域被敲除的克隆，relativepvt1level(％)表示ptv1基因的相对表达水平(％)；

图5为双grna对ak023948基因的敲除效果图；

其中，ak023948ko(#13、#28、#32)表示ak023948基因被敲除的克隆(克隆编号为#13、#28、#32)，relativeak0level(％)表示ak023948 基因的相对表达水平(％)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细说明。

实施例1双grna载体文库的构建

在非编码数据库(www.http://noncode.org/)中列出的lncrna超过50000，原则上本发明双grna载体文库的构建没有数量上限，但考虑到当前美国customarray公司通过“定制芯片”的方法合成单链寡核苷酸的数量上限，我们从中筛选除了大约45000条可以适用于sgrna标记的lncrna，为每个lncrna设计了两个双grna，以构成总数为9000的双grnako文库。此外，还设置了100个非人类基因阴性对照双grna。

本实施例双grnako文库的构建方法(构建流程如图1所示)包括：

(1)制备混合单链寡核苷酸库

委托美国customarray公司(http://www.customarrayinc.com/)通过“定制芯片”的方法合成相应的单链寡核苷酸，获得混合单链寡核苷酸库；

(2)制备混合双链寡核苷酸库

以混合单链寡核苷酸库为模板，利用引物进行pcr扩增：

在1ml管中依次加入：5×pcr反应缓冲液80μl、dntp混合物(10mm)8μl，phusion聚合酶(2u/μl)2μl，h1-5.1引物(10μm)10μl，scaffold-adaptor引物(10μm)10μl，模板(80ng/μl)2μl，加去离子水至总体积为400μl。

其中，h1-5.1引物(如seqidno.4所示)即结合在前文所述“pcr扩增短序列i”位置处，scaffold-adaptor引物(如seqidno.5所示)即 结合在前文所述“pcr扩增短序列ii”位置处。两者的碱基序列分别为：

h1-5.1引物：5’-gtatgagaccacttggatcc-3’；

scaffold-adaptor引物：5’-ccttattttaacttgctatt-3’。

将pcr反应体系混匀后稍离心，分装至8个pcr管中(50μl/tube)，在pcr仪中进行扩增反应，反应参数为：98℃1min，1个循环，98℃0.5min，42℃1min，72℃0.5min，循环33个，72℃4min，1个循环，4℃保存。

采用美国zymoresearch公司纯化试剂盒对pcr产物进行纯化：

对于每200μlpcr溶液，加入1ml连接缓冲液，转移到纯化柱中，离心机(eppendoff)15,000rpm离心0.5min。丢弃离心液，加200μlwashbuffer,15,000rpm离心0.5min；加200μlwashbuffer,15,000rpm离心1min，将离心柱转移至一个新管中，加40μl水至柱中，15,000rpm离心1min，保存洗脱液(即为混合双链寡核苷酸库)，用于后续第一步克隆。

(3)载体的制备

用bsmbi(美国neb公司)消化lenti-hygro载体。消化体系为：buffer3.110μl，lenti-hygro载体2μg，bsmbi(10units/μl)2μl，加水至100μl，55℃消化3小时。

1％琼脂糖凝胶，80恒定电流30min，分离消化后的dna(用美国zymoresearch公司dna割胶回收试剂盒)，切割线性dna条带，在1.5ml管中，加入溶胶液(zymoresearch)，每100μg胶加300μl溶胶液，55℃约5min、或者直至胶全部溶解。转移至纯化柱，离心机(eppendoff)15,000rpm离心0.5min，加200μlwashbuffer,15,000rpm离心0.5min；加200μlwashbuffer,15,000rpm离心1min；将离心柱转移至一个新管中，加40μl水至柱中，15,000rpm离心1min，保存洗脱液，用于第一步克隆。

(4)第一步克隆(制备前期文库)

在管中加入4μlpcr产物(即混合双链寡核苷酸库)，4μllenti-hygro载体/bsmb1，2μlcoldfusion(sbi)，室温下静置混合5min，转移到冰上静置10min后加入50μl感受态细胞(10g购自美国lucigen公司)，在冰上放30min，42℃水浴1min，再转移到冰上静置2～5min，加500μllb培养基，于37℃、250rpm下震荡培养60min，取250μl平铺在氨苄青霉素(100μg/ml)lb平板上，在37℃下孵育过夜，第二天计克隆数。

根据文库的大小，我们需要5～10倍的覆盖范围，即10000个双grna库，我们需要50,000到100,000的克隆。

用美国的zymoresearch公司的质粒提取试剂盒分离含有双grna表达载体的转化细菌中的质粒，提取步骤为：

前期文库dna2μg，10xbuffer3.1(美国neb公司)10μl，bsmbi(10units/μl)2μl,加水至100μl，55℃消化3小时。

1％琼脂糖凝胶，80恒定电流30min，分离消化后的dna(用美国zymoresearch公司dna割胶回收试剂盒)，切割线性dna条带，在1.5ml管中，加入溶胶液((zymoresearch)，每100μg胶加300μl溶胶液，55℃约5mins或者至胶全部溶解。转移至纯化柱，离心机(eppendoff)15,000rpm离心0.5min，加200μlwashbuffer,15,000rpm离心0.5min；加200μlwashbuffer,15,000rpm离心1min；将离心柱转移至一个新管中，加40μl水至柱中，15,000rpm离心1min，保存洗脱液(质粒dna，即前期文库)用于第二步克隆。

(5)scaffold-u6片段的制备

在管中依次加入5×pcr反应缓冲液80μl，支架-u6的上游引物(scaffold-u6-5.1：5’-gttttagagctagaaat-3’)(如seqidno.6所示)和下游引物(scaffold-u6-3.1：5’-acggtgtttcgtcctttc-3’) (如seqidno.7所示)各10μl(10μm)，dntp混合物(10mm)8μl，带有scaffold-u6的质粒(100ng/μl)1μl(委托美国genscript公司合成)，phusion聚合酶(2u/μl)2μl，加去离子水至总体积为400μl。混匀后稍离心分装分装至8个pcr管中，每个管50μl，在pcr仪中进行扩增反应，pcr反应参数为：98℃1min，1个循环，98℃0.5min，42℃1min，72℃0.5min，循环33个，72℃4min，1个循环，4℃保存，备用。

(6)第二步克隆

在管中加入4μlpcr产物(scaffold-u6片段)，4μl用bsmbi酶切的前期文库，2μlcoldfusion(sbi)，室温下静置5min后转移到冰上静置10min；加入50μl感受态细胞(10g购置美国lucigen公司)，在冰上放30min后42℃下水浴1min，再转移到冰上静置2～5min，加入500μllb培养液，于37℃、250rpm下震荡培养60min，取250μl培养液平铺在氨苄青霉素(100μg/ml)lb平板上，在37℃孵育过夜，第二天数克隆数。

根据文库的大小，我们需要5～10倍的覆盖范围，即10000个双grna库，我们需要50,000到100,000的克隆。

用美国的zymoresearch公司的质粒提取试剂盒分离含有双grna表达载体的转化细菌中的质粒(即双grna载体文库)，纯化保存，用于后续包病毒用。

双grna载体文库可以用于筛选在基因调控与疾病进程中发挥显著作用的必需基因，也可以用于鉴定必不可少的编码基因或者其他遗传元件的功能。

双grna对lncrna的敲除机制如图2所示。

实施例3singlegrna和双grna的基因敲除效率比较

本实施例以带有3个外显子的uca1基因为例，比较sgrna和双 grna的基因敲除效率(如图3)。

(1)双grna的基因敲除效率

以uca1基因作为靶基因，在靶基因上选择靶位点(如图3中d部分所示)，设计uca1-dualgrna，uca1-dualgrna中两条grna的正义链的碱基序列分别为：

uca1-grna1(seqidno.8)：5’-gtgcatggtggagagatgat-3’；

uca1-grna2(seqidno.9)：5’-ttctggaatggtgaacccaa-3’；

委托美国genscript公司构建含有hcas9和uca1-dualgrna的表达载体(每个dna含量均为0.5μg)，并利用该表达载体对293t细胞进行转染敲除，敲除步骤如下：

1)传代293t细胞，并保持细胞密度大约30％，37℃过夜；

2)含hcas9和uca1-dualgrna的表达载体(如图3中b部分所示)在6孔板中用转染试剂如dnafectin(美国abm公司)或者lipofectin(美国thermofisher公司)转染细胞；

3)转染后6小时换血清培养基；

4)第二天，通过facs细胞分选仪分离单个细胞；

5)在96孔板中让单个细胞生长10日左右；

6)转移克隆到24孔板生长5天以上；

7)用美国viagenbiotech公司试剂盒分离uca1敲除克隆的基因组dna：

a)在10cm平板细胞加200-300μldirectpcr裂解试剂(cell)，同时加新鲜配制0.2～0.4mg/ml的蛋白酶k(sigma)；55℃水浴旋转管1小时，或观察直到无团块；85℃水浴裂解45分钟。离心10秒，-20℃保存；

b)取0.5μl裂解液作为模板，进行pcr反应，反应体系包含：10×pcr反应缓冲液1μl，上游引物(uca1-inside-5.3：5’-ccttaactaattaac- -ccacc-3’)(如seqidno.10所示)和下游引物(uca1-inside-3.3：5’-aagagagtcagcgaagggag-3’)(如seqidno.11所示)各0.5μl(10μm)，dntp混合物(10mm)0.2μl，dmso0.3μl，taq聚合酶(美国neb公司)(2u/μl)0.2μl，加去离子水6.8μl至总体积为10μl；

c)在pcr仪中进行dna扩增反应，pcr反应参数为：94℃1min，1个循环，94℃0.5min，55℃0.5min，72℃0.5min，循环33个，72℃10min，1个循环，4℃保存；

d)反应结束后取4μl反应液，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测uca1的缺失状况(如图3中f部分所示)。

(2)singlegrna的基因敲除效率

以uca1基因作为靶基因，在靶基因上选择靶位点(如图3中c部分所示)，设计uca1-grna，uca1-grna与上述uca1-grna1相同。

采用与本实施例第(1)部分相同的方法构建含hcas9和uca1-grna的表达载体(如图3中a部分所示)，利用该表达载体转染目标细胞，分离uca1敲除克隆的总rna进行rt-pcr，检测uca1的表达量(如图3中e部分所示)。

rt-pcr的步骤为：

a)rna的提取：用direcozoltmrnamin/prep试剂盒提取293t细胞中的rna，24孔每孔加500μl(trlreagent)(cat.r2050-100)样品需放冰上；

b)冰冻样品需用枪头混合，加入等量的95％乙醇混匀；

c)将混合液移入专用(zymo-spin)iic柱子，13500rpm离心1min，将离心柱换到新的收集管；

d)加400μldirecozoltmrnaprewash到(zymo-spin)iic柱子，.13500rpm离心1min；

e)重复步骤d)；

f)加700μlrnawashbuffer到(zymo-spin)iic柱子，13500rpm离心1min。丢去离心液，13500rpm空离心2min；

g)加25μldnease/rnaeasefreewater到(zymo-spin)iic离心柱，13500rpm空离心1min；

h)利用核酸仪nanodrop2000c测rna浓度(美国thermoscientific公司)；

i)逆转录：所用试剂均放冰上，逆转录体系：rna0.5μg，随机引物(randomprimermix#s1330s)0.5μl，depch2o加至7μl，pcr仪70℃10minutes后放冰上；

j)rt-每个样本加以下：thermoscicentiitic5xfirststandbuffer(lot00168122)2μl，dntp(signadeoxynuclrotidemix,lotsusf-45360us)0.5μl，rnaseinhibitor(munne#mo314l)(lot10081460)0.25μlrevertaidrt(revertaid.lt00205481)reversetanscrripatse#epo4410.25μl，混匀，反应参数设置为25℃10min，37℃1hour,70℃10min(eppendorforbio-radt100thermalcycler)，得到模板cdna；

k)qpcr：在新的0.2mlpcr反应管中依次加入10μlreal-timepcrmastermix，0.4μl50×roxreference，相应的pcr正向和反向引物(10μm)各0.4μl，2μl模板cdna(上面逆转录步骤所得)和6.8μl去离子水；混匀后进行pcr反应，反应条件为：95℃3min，循环条件为95℃10s和60℃0.5min，65℃0.05s，共39个循环，每个样本重复3次，通过该反应可得uca1基因敲除后的表达量。

由图3可见，在随机选取的uca1敲除克隆中，经uca1-grna敲除的uca1敲除克隆中还含有uca1基因，而经uca1-dualgrna敲除的uca1敲除克隆中则检测不到uca1基因，表明双grna比sgrna具有 更高的敲除效率。

实施例3双grna对长lncrna的敲除策略

当lncrna基因太长时，一些其他的基因如microrna将插入到其中。比如pvt1基因有8个外显子，而且其基因区间长度超过200kb(chr8:128,902,874-129,113,499)，三个micrornas(mir-1205～1207)都位于这段区域内(如图4中a部分)。如果采用与实施例3相同的敲除策略将这段超过200kb区域全部剪切掉，可能也会将这三个micrornas以及其他一些潜在的基因或者基因元件同时删减掉，这将导致我们无法明确地判断剪切后的表现型到底是跟pvt1有关还是跟其他因素有关。

因此，针对pvt1基因设计了两种敲除策略：

(1)采用与实施例3相同的方法设计用于剪切pvt1基因第一个外显子的双grna(如图4中b部分)；

(2)采用与实施例3相同的方法设计用于剪切pvt1基因第一个外显子以及第一个外显子转录上游1.1kb区域的双grna(如图4中c部分)；

采用与实施例3第(1)部分相同的方法，分别构建含hcas9和pvt1-dualgrna(grna1-grna2)的表达载体、含hcas9和pvt1-dualgrna(grna1p-grna2)的表达载体，并分别利用这两种表达载体转染目标细胞，分离ko克隆的基因组dna进行pcr，检测ko克隆中pvt1基因的缺失情况(如图4中c、d部分所示)。

由图4可见，第一种敲除策略虽然将pvt1基因的第一个外显子敲除了，但pvt1基因的其他外显子仍旧表达。而第二种敲除策略将pvt1基因的第一个外显子以及第一个外显子转录上游1.1kb区域敲除了之后，则没有检测到外显子1和外显子8的表达。

这是因为与蛋白质编码基因类似，绝大多数lncrna是通过rna聚 合酶ii转录的。虽然启动子可能包含一个非常大的区域，但是一些增强区域和基本转录元件都是位于转录上游500bp区间之内的。为了保险起见，我们设计了带有从1kb～转录上游的sgrna1p。例如，pvt1的grna1p在1.1kb区域而grna2位于第一个外显子底端，总共包含了长达1.5kb区域。从而含有grna1p-grna2的双grna能够完成对pvt1整个转录的敲除。

另外，含有grna1p-grna2的双grna对于mir-2015～mir-2017没有任何影响，显示了它们可能有相应的启动子。

实施例4双grnako文库的应用

虽然在各种生理和病理条件下已经越来越多地认识到长非编码rna(lncrna)的作用，但是大量lncrna在乳腺癌的潜在作用还鲜为人知。我们通过rt-pcr研究了lncrna的表达谱，确定了一组分别为相对于正常乳腺组织中的患者乳腺癌组织差异表达的lncrna。其中，ak023948在乳腺癌中上调，同时在乳腺癌细胞系(mcf-7和mda-mb-231)中相比于人乳腺上皮细胞(hmle)中也上调，这个结果我们也通过乳腺癌组织芯片原位杂交得到了进一步验证。

本实施例以ak023948作为靶基因，在靶基因上选择靶位点(如图5中a部分所示)，设计ak023948-dualgrna，ak023948-dualgrna中两条grna的正义链的碱基序列分别为：

ak023948-grna1(如seqidno.12所示)：

5’-gagttttagtcacctatcta-3’；

ak023948-grna2(如seqidno.13所示)：

5’-ggtgatccttgtgcacggcc-3’；

采用与实施例3第(1)部分相同的方法，分别构建含hcas9和 ak023948-dualgrna的表达载体，并利用该表达载体转染目标细胞，分离ko克隆的基因组dna进行pcr，检测ko克隆中ak023948基因的缺失情况(如图5中b部分所示)；同时采用与实施例3第(2)部分相同的方法，分离ko克隆的总rna，进行rt-pcr验证相应ko克隆中ak023948基因的缺失情况(如图5中c部分所示)。

由图5可见，采用本实施例双grna能够完全敲除ak023948基因。