本发明涉及医药化学领域，具体涉及一种抗肿瘤活性的高乌甲素靛红杂合体及其合成方法。
背景技术：
肿瘤已严重威胁到人类的健康，寻找有效安全、毒副作用小的抗肿瘤药物一直是肿瘤药物研发工作者孜孜以求的目标。随着药物化学的发展，寻找高效低毒的天然抗肿瘤化合物或进行结构改造合成其衍生物成为当前抗肿瘤药物研究中的一个重要趋势。
高乌甲素[(1α,14α,16β)-20-乙基-1,14,16-三甲氧乌头烷-4,8,9-三醇4-[2-(乙酰氨基)]苯甲酸酯](lappaconitine)又名拉巴乌头碱，是从毛茛科植物高乌头(Aconitum sinomontanum Nakai)根中提取的一种二萜类生物碱，其结构式如下。药理实验证明具有较强的中枢镇痛作用及解热、消肿和局部麻醉等作用。毒性实验表明，本品对各种组织均无损害，无致畸作用。
高乌甲素是单酯型生物碱，本身具有毒性，而产生毒性的一个主要原因是8位的羟基容易酯化。高乌甲素C-8、C-9位的邻二羟基能与靛红类化合物的羰基缩合生成螺环结构，根据相关报道，已经证实靛红螺环衍生物具有较好的抗肿瘤活性。
靛红，又名2,3-吲哚醌或吲哚满二酮，是存在于中药青黛、大青叶中的有效化学成分，也是哺乳动物和人体组织及体液中的内源性物质。靛红及其衍生物具有多种生物活性，在抗肿瘤、抗病毒、神经保护等方面的活性具有着重要意义。靛红及常见的衍生物如下式所示：
近年来，对于抗肿瘤活性的高乌甲素衍生物，药物化学家和生物学家进行了大量的研究，合成筛选出各种不同基团修饰的有抗肿瘤活性的高乌甲素衍生物，为进一步开发有效低毒的抗肿瘤药物打下了坚实基础。
临床上常使用的氢溴酸高乌甲素，为我国首创的非成瘾性镇痛药，因其镇痛作用强而无成瘾性、无蓄积现象和毒副作用轻而广泛应用于临床各种疼痛。但是，氢溴酸高乌甲素不溶于水，使得药物在人体内吸收受到影响，导致其镇痛起效慢，并且游离的溴离子在人体内具有一定的副作用。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种抗肿瘤活性的高乌甲素靛红杂合体及其合成方法，通过利用靛红类生物优良的生物活性来改善高乌甲素结构，以期合成得到低毒高效的衍生物。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种具有抗肿瘤活性的高乌甲素靛红杂合体，其结构式(I)如下所示：
其中，R1选自卤素、R2选自低级烷烃。
一种具有抗肿瘤活性的高乌甲素靛红杂合体的合成方法，以高乌甲素、靛红及其衍生物为原料，磷钨酸作催化剂，甲苯作为反应溶剂的条件下进行合成，合成路线如下所示：
详细步骤如下：
1)按靛红类化合物与原甲酸三甲酯摩尔比为1:1～1:5的比例投料，室温磁力搅拌，在酸性条件下进行反应，用薄层色谱判断是否有新的产物生成以及追踪反应进度；
2)反应完全后，加三乙胺中和反应液至中性，减压蒸去多余的原甲酸三甲酯；
3)按高乌甲素与靛红类化合物摩尔比为1:1～1:5的比例向反应器中投入高乌甲素，置于磁力搅拌器上搅拌，反应体系达到回流后，加入酸性催化剂，TCL追踪实验进度，反应完全后将反应液减压蒸出，浓缩物加水，有固体物质析出，抽滤，洗涤滤饼，得到目标产物粗品，重结晶即可得到目标产物纯品；
4)将得到的目标产物称重，计算产率。
进一步，步骤1)所述的的投料比，靛红类化合物与原甲酸三甲酯摩尔比为1:1～1:2。
进一步，步骤1)所述的反应催化剂和溶剂，为磷钨酸和甲苯，。
进一步，步骤3)所述的反应时间为6～8小时。
进一步，步骤3)所述的投料比，优选的高乌甲素与靛红类化合物摩尔比为1:1～1:3。
进一步，一种具有抗肿瘤活性的高乌甲素靛红杂合体在治疗人前列腺癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明的优点在于：采用“一锅煮”的方法制备高乌甲素靛红杂合体,减少了实验步骤,操作简单,转化率高。原料环保，生产成本低，操作安全性高，反应条件温和，可实现反应原料的充分利用，适用于工业化生产。将一个具有抗肿瘤活性的化合物进行缩合，对探究该类化合物的生物活性与总结构效关系具有重要的理论价值和应用价值。
具体实施例
以下结合实施例对本发明进一步叙述，但本发明不局限于以下实施例。
实施例1
高乌甲素与靛红的缩合产物
于100mL烧瓶中，投入高乌甲素50mg、靛红25.16mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和适量磷钨酸，室温磁力搅拌，用薄层色谱判断是否有新的产物生成以及追踪反应进度，反应完全后，加适量三乙胺中和反应液至中性，反应完全后将反应液减压蒸出，浓缩物加水，有固体物质析出，抽滤，洗涤滤饼，得到目标产物粗品，重结晶即可得到目标产物纯品。
(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-8-ethyl-3,13,17-trimethox y-13b,14-dimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydrospiro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]azocine-5,3'-in dolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate
暗红色无定型粉末31.08mg，收率48.99％，m.p.231～233℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.04(1H,s),10.58(1H,s),8.29(1H,d,J＝12.5Hz),7.85(1H,d,J＝10.4Hz),7.58(2H,m),7.50(1H,d,J＝6.8Hz),7.17(1H,dd,J＝15.3,1.1Hz),7.08(1H,d,J＝7.5Hz),6.92(1H,d,J＝7.8),3.37-3.42(9H,m),3.27(4H,d,J＝6.7Hz),3.14-3.21(8H,m),2.88(1H,s),2.68(2H,dd,J＝14.5,7.5Hz),2.24(2H,dd,J＝14.4,6.9Hz),2.11(3H,s),1.86-1.96(3H,m),1.39(2H, q),1.03(3H,t,J＝7.1Hz).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm):178.23,168.41,166.10,150.71,139.95,138.33,133.80,130.60,126.71,124.65,122.98,122.72,120.91,117.79,117.55,115.37,112.16,90.67,89.22,86.59,84.34,83.43,82.83,78.13,73.40,67.84,60.31,58.28,57.04,55.87,55.36,50.69,50.56,48.22,48.14,47.48,42.77,35.58,31.38,26.41,25.93,24.72,23.76,13.27.HRMS(ESI)calcd.forC40H47N3O9[M+H]+:713.3312,found:713.3379.
实施例2
高乌甲素与5-氟靛红的缩合产物
于100mL烧瓶中，投入高乌甲素50mg、5-氟靛红28.24mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和适量磷钨酸，室温磁力搅拌，用薄层色谱判断是否有新的产物生成以及追踪反应进度，反应完全后，加适量三乙胺中和反应液至中性，反应完全后将反应液减压蒸出，浓缩物加水，有固体物质析出，抽滤，洗涤滤饼，得到目标产物粗品，重结晶即可得到目标产物纯品。
(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-8-ethyl-5'-fluoro-3,13,17-trimethoxy-13b,14-dimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydrospiro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]azoc ine-5,3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate
暗红色无定型粉末28.77mg，收率44.28％，m.p.235～237℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.05(1H,s),10.55(1H,s),8.28(1H,d,J＝8.3Hz),7.85(1H,d,J＝9.4Hz),7.57(1H,t,J＝7.8Hz),7.44(2H,m),7.17(1H,t,J＝7.2Hz),6.92(1H,dd,J＝8.5,3.9Hz),3.39(6H,m),3.26(3H,s),3.18(8H,m),2.88(1H,s),2.68(2H,dd,J＝14.5,7.5Hz),2.35(1H,m),2.25(2H,m),2.07-2.10(6H,m),1.88-1.96(3H,m),1.39(2H,q),1.03(3H,t,J＝7.1Hz).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm):176.71,168.40,166.11,156.85,146.95,139.96,133.80,130.60, 124.58,124.34,122.98,120.71,118.41,117.47,113.47,111.48,89.22,84.35,83.44,82.83,78.13,73.40,60.31,57.04,56.81,55.87,55.19,50.70,48.14,47.49,42.71,35.59,31.40,26.35,25.82,24.73,23.73,13.27.
实施例3
高乌甲素与5-氯靛红的缩合产物
于100mL烧瓶中，投入高乌甲素50mg、5-氯靛红31.05mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和适量磷钨酸，室温磁力搅拌，用薄层色谱判断是否有新的产物生成以及追踪反应进度，反应完全后，加适量三乙胺中和反应液至中性，反应完全后将反应液减压蒸出，浓缩物加水，有固体物质析出，抽滤，洗涤滤饼，得到目标产物粗品，重结晶即可得到目标产物纯品。
(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-5'-chloro-8-ethyl-3,13,17-trimethoxy-13b,14-dimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydrospiro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]azoc ine-5,3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate
黄色无定型粉末29.89mg，收率45.02％，m.p.240～242℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.15(1H,s),10.55(1H,s),8.28(1H,s),7.83(1H,s),7.67(3H,m),7.17(1H,s),6.92(1H,s),3.36(9H,d,J＝7.9Hz),3.28(3H,s),3.20(7H,d,J＝5.0Hz),2.89(1H,d,J＝7.1Hz),2.70(2H,m),2.29(4H,m),2.13(3H,s),1.94(3H,m),1.40(2H,q),1.04(3H,t).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm):175.48,168.41,166.17,149.44,139.95,137.21,133.64,130.42,126.62,126.35,124.10,122.90,119.13,113.80,89.06,84.34,83.43,82.70,78.13,73.40,60.31,57.04,55.87,55.36,50.69,50.56,48.14,42.77,35.59,26.34,24.73,23.81,13.27.
实施例4
高乌甲素与N-甲基-5-氟靛红的缩合产物
于100mL烧瓶中，投入高乌甲素50mg、N-甲基-5-氟靛红30.64mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和适量磷钨酸，室温磁力搅拌，用薄层色谱判断是否有新的产物生成以及追踪反应进度，反应完全后，加适量三乙胺中和反应液至中性，反应完全后将反应液减压蒸出，浓缩物加水，有固体物质析出，抽滤，洗涤滤饼，得到目标产物粗品，重结晶即可得到目标产物纯品。
(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-8-ethyl-5'-fluoro-3,13,17-trimethoxy-1',13b,14-trimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydrospi ro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]az ocine-5,3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate
淡黄色无定型粉末25.99mg，收率39.27％，m.p.236～238℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.55(1H,s),8.27(1H,d,J＝8.3Hz),7.85(1H,d,J＝6.4Hz),7.56(2H,s),7.46(2H,d,J＝4.4Hz),7.18(1H,d,J＝3.0Hz),3.41(1H,d,J＝11.2Hz),3.34(6H,s),3.26(3H,s),3.20(3H,s),3.14(9H,m),2.89(1H,s),2.69(2H,dd,J＝14.6,7.8Hz),2.35(1H,d,J＝11.0Hz),2.26(3H,m),2.12(3H,s),1.94(3H,m),1.39(2H,q),1.03(3H,t,J＝7.5Hz).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm):175.05,168.10,166.17,157.95,150.38,147.50,139.94,133.92,130.41,124.07,123.83,111.93,111.85,111.39,111.14,89.02,82.65,77.65,73.48,60.20,57.04,55.82,55.48,50.11,48.23,47.55,42.46,29.23,26.09,24.17,13.35.
实施例5
高乌甲素与N-乙基-5-氟靛红的缩合产物
于100mL烧瓶中，投入高乌甲素50mg、N-乙基-5-氟靛红33.04mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和适量磷钨酸，室温磁力搅拌，用薄层色谱判断是否有新的产物生成以及追踪反应进度，反应完全后，加适量三乙胺中和反应液至中性，反应完全后将反应液减压蒸出，浓缩物加水，有固体物质析出，抽滤，洗涤滤饼，得到目标产物粗品，重结晶即可得到目标产物纯品。
(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-1',8-diethyl-5'-fluoro-3,13,17-trimethoxy-13b,14-dimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydro spiro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]azocine-5,3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate
灰色无定型粉末27.61mg，收率40.98％，m.p.233～235℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.54(1H,s),8.25(1H,d,J＝7.4Hz),7.84(1H,d,J＝6.5Hz),7.51-7.60(2H,m),7.46(1H,d,J＝9.8Hz),7.15-7.24(2H,m),3.71(2H,q,J＝7.2Hz),3.42(1H,d,J＝9.4Hz),3.35(6H,s),3.26(3H,s),3.21(8H,m),2.90(1H,s),2.69(2H,q),2.26(4H,m),2.12(3H,s),1.95(4H,m),1.40(2H,q,J＝12.7Hz),1.17(3H,t,J＝7.2Hz),1.04(3H,t,J＝6.3Hz).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm):179.48,168.10,165.90,157.39,155.45,146.92,133.62,130.42,128.29,126.05,124.13,123.47,122.85,120.63,118.42,111.75,111.47,89.03,87.09,84.21,82.66,75.43,73.21,57.06,55.76,55.38,50.13,48.19,46.98,42.45,35.24,34.31,33.02,25.73,24.43,13.36,12.14.
实施例6
高乌甲素与N-甲基-7-氟靛红的缩合产物
于100mL烧瓶中，投入高乌甲素50mg、N-甲基-7-氟靛红30.64mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和适量磷钨酸，室温磁力搅拌，用薄层色谱判断是否有新的产物生成以及追踪反应进度，反应完全后，加适量三乙胺中和反应液至中性，反应完全后将反应液减压蒸出，浓缩物加水，有固体物质析出，抽滤，洗涤滤饼，得到目标产物粗品，重结晶即可得到目标产物纯品。
(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-8-ethyl-7'-fluoro-3,13,17-trimethoxy-1',13b,14-trimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydrospi ro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]az ocine-5,3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate
灰色无定型粉末35.44mg，收率53.55％，m.p.234～236℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.54(1H,s),8.25(1H,s),7.84(1H,d,J＝9.4Hz),7.56(2H,m),7.41(1H,d,J＝8.6Hz),7.14(2H,m),3.43(1H,m),3.33(9H,s),3.30(4H,m),3.21(8H,m),2.90(1H,s),2.71(2H,m),2.26(4H,m),2.12(3H,s),1.95(3H,m),1.41(2H,m),1.04(3H,t).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm):176.32,168.40,165.90,157.95,148.81,146.31,137.07,133.64,130.42,128.84,125.86,125.66,124.20,121.91,120.58,111.18,101.68,96.31,89.02,85.51,83.29,82.66,73.50,60.20,56.76,55.49,55.12,50.39,47.89,47.25,44.40,34.89,28.62,24.16,14.35.
实施例7
高乌甲素与N-乙基靛红的缩合产物
于100mL烧瓶中，投入高乌甲素50mg、N-乙基靛红29.96mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和适量磷钨酸，室温磁力搅拌，用薄层色谱判断是否有新的产物生成以及追踪反应进度，反应完全后，加适量三乙胺中和反应液至中性，反应完全后将反应液减压蒸出，浓缩物加水，有固体物质析出，抽滤，洗涤滤饼，得到目标产物粗品，重结晶即可得到目标产物纯品。
(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-1',8-diethyl-3,13,17-trime thoxy-13b,14-dimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydrospiro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]azocine-5, 3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate
棕色无定型粉末39.01mg，收率59.25％，m.p.228～230℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.55(1H,s),8.27(1H,d,J＝8.1Hz),7.84(1H,d,J＝8.0Hz),7.67(2H,m),7.56(2H,m),7.11-7.21(2H,m),3.70(2H,q),3.41(1H,d,J＝11.3Hz),3.34(6H,s),3.26(3H,s),3.20(8H,m),2.88(1H,s),2.68(2H,d,J＝14.6,7.8Hz),2.35(1H,d,J＝10.6Hz),2.26(3H,m),2.12(3H,s),1.94(4H,m),1.38(2H,q),1.17(3H,t,J＝7.1Hz),1.03(3H,t,J＝7.1Hz).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm):170.05,168.59,165.90,150.35,147.52,139.75,138.14,133.46,130.55,124.46,123.04,117.47,110.57,102.59,89.13,84.30,83.31,78.02,73.40,60.31,56.94,55.96,55.25,50.64,48.18,47.46,42.87,35.16,34.24,31.49,24.49,13.27,12.24.
实施例8
高乌甲素与N-甲基-6-氯靛红的缩合产物
于100mL烧瓶中，投入高乌甲素50mg、N-甲基-6-氯靛红33.45mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和适量磷钨酸，室温磁力搅拌，用薄层色谱判断是否有新的产物生成以及追踪反应进度，反应完全后，加适量三乙胺中和反应液至中性，反应完全后将反应液减压蒸出，浓缩物加水，有固体物质析出，抽滤，洗涤滤饼，得到目标产物粗品，重结晶即可得到目标产物纯品。
(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-6'-chloro-8-ethyl-3,13,17-trimethoxy-1',13b,14-trimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydrospi ro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]az ocine-5,3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate
橙黄色无定型粉末28.11mg，收率41.59％，m.p.245～247℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.54(1H,s),8.26(1H,d,J＝8.8Hz),7.84(1H,d,J＝6.9Hz),7.55(2H,m),7.35(1H,d,J＝1.7Hz),7.18(2H,m),3.42(1H,d,J＝9.4Hz),3.35(9H,s),3.27(4H,m),3.21(6H,m),3.14(3H,s),2.90(1H,s),2.70(2H,dd,J＝13.8,7.5Hz),2.30(3H,m),2.12(3H,s),1.95(3H,m),1.40(2H,q),1.04(3H,t,J＝9.6Hz).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm):170.61,168.11,166.19,152.57,142.49,133.93,125.62,122.89,120.33,115.88,111.10,103.53,100.11,89.31,83.29,82.66,73.20,68.43,57.05,55.77,55.13,50.40,47.90,35.26,33.32,26.24,24.44,13.70.HRMS(ESI)calcd.for C41H48ClN3O9[M+H]+:761.3079,found:761.3023.
实施例9
高乌甲素与N-乙基-6-氯靛红的缩合产物
于100mL烧瓶中，投入高乌甲素50mg、N-乙基-6-氯靛红35.85mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和适量磷钨酸，室温磁力搅拌，用薄层色谱判断是否有新的产物生成以及追踪反应进度，反应完全后，加适量三乙胺中和反应液至中性，反应完全后将反应液减压蒸出，浓缩物加水，有固体物质析出，抽滤，洗涤滤饼，得到目标产物粗品，重结晶即可得到目标产物纯品。
(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-6'-chloro-1',8-diethyl-3,13,17-trimethoxy-13b,14-dimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydro spiro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]azocine-5,3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate
黄色无定型粉末30.02mg，收率43.64％，m.p.231～233℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.55(1H,s),8.27(1H,d,J＝8.3Hz),7.84(1H,d,J＝8.0Hz),7.56(2H,d,J＝8.0Hz),7.41(1H,s),7.15-9.19(2H,m),3.70(2H,q,J＝7.1Hz),3.41(1H,d,J＝11.3Hz),3.35(9H,s),3.26(3H,s),3.20(7H,m),2.89(1H,s),2.68(2H,q,J＝14.6Hz),2.35(1H,m),2.26(2H,m),2.12(3H,s),1.95(3H,m),1.39(2H,q J＝14.4Hz),1.17(3H,t,J＝8.2Hz),1.03(3H,t,J＝7.1Hz).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm):178.27,168.40,165.90,151.36,142.46,139.94,125.85,122.83,120.63,116.20,110.99,103.89,83.02,82.38,77.94,73.50,57.04,55.76,55.20,55.12,50.69,50.57,48.20,42.46,35.54,34.47,31.35,26.02,24.44,23.80,13.07,12.20.
实施例10
高乌甲素与N-乙基-5-氟靛红的缩合产物
于100mL烧瓶中，投入高乌甲素50mg、N-乙基-5-氟靛红33.04mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和适量磷钨酸，室温磁力搅拌，用薄层色谱判断是否有新的产物生成以及追踪反应进度，反应完全后，加适量三乙胺中和反应液至中性，反应完全后将反应液减压蒸出，浓缩物加水，有固体物质析出，抽滤，洗涤滤饼，得到目标产物粗品，重结晶即可得到目标产物纯品。
(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-1',8-diethyl-7'-fluoro-3,13,17-trimethoxy-13b,14-dimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydrosp iro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]a zocine-5,3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate
暗红色无定型粉末38.13mg，收率56.59％，m.p.233～235℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.54(1H,s),8.25(1H,d,J＝7.4Hz),7.84(1H,d,J＝6.5Hz),7.51-7.60(2H,m),7.46(1H,d,J＝9.8Hz),7.15-7.24(2H,m),3.71(2H,q,J＝7.2Hz),3.42(1H,d,J＝9.4Hz),3.35(6H,s),3.26(3H,s),3.21(8H,m),2.90(1H,s),2.69(2H,q),2.26(4H,m),2.12(3H,s),1.95(4H,m),1.40(2H,q,J＝12.7Hz),1.17(3H,t,J＝7.2Hz),1.04(3H,t,J＝6.3Hz).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm):179.48,168.10,165.90,157.39,155.45,146.92,133.62,130.42,128.29,126.05,124.13,123.47,122.85,120.63,118.42,111.75,111.47,89.03,87.09,84.21,82.66,75.43,73.21,57.06,55.76,55.38,50.13,48.19,46.98,42.45,35.24,34.31,33.02,25.73,24.43,13.36,12.14.
实施例11
本发明化合物的抗肿瘤活性测试
对本发明的化合物进行了肿瘤细胞增殖抑制试验，试验方法采用常规的MTT法。
细胞株选用：人前列腺癌(PC-3)，人胃腺癌细胞(SGC-7901)，人肺癌细胞(A-549)，人乳腺癌细胞(MCF-7)，人肝癌细胞(HepG2)。培养液为DMEM+15％NBS+双抗。
样品液的配制：用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成的100μmol/L的溶液或者均匀的混悬液，然后用DMSO的PBS(-)稀释，最终浓度分别为0.1，1，10，20，40，60，80，100μmol/L。
将抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶(5-FU)以同样的条件配成对照品溶液。
细胞培养：贴壁生长肿瘤细胞细胞培养于含10％灭活新生牛血清和青霉素、链霉素(各100万U/L)的1640培养液中，置于37℃，5％CO2，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。细胞贴壁生长，每2～3天传代1次，传代时首先倒出培养液，PBS洗2次，胰酶消化后，加入新鲜的培养液吹打均匀，调整细胞至适当浓度移入新的培养瓶中，添加培养液至适量。取对数生长期细胞用于实验。
MTT法检测细胞活性及IC50的测定：
实验原理：活细胞线粒体中脱氢酶能将黄色的MTT还原成不溶于水的蓝紫色产物甲臜(MTT formazan)，并沉积在细胞中，生成的量与活细胞数目成正比，而死细胞没有这种功能。DMSO能溶解蓝紫色结晶物，颜色深浅与所含的量成正比，因此用酶标仪测定的光吸收值可反映细胞存活率。
实验方法：取对数生长期细胞，消化、计数，以3×105/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔100μl。培养24小时后，将待测化合物以0.1，1，10，20，40，60，80，100μmol/L浓度处理细胞。实验组每个浓度设5个复孔，以含0.4％DMSO的培养液作对照。药物作用48小时后，去上清，每孔加入100μl MTT(2-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-3，5-二苯基-2H-四唑氢溴酸盐)(1mg/mL)，继续培养4小时，弃上清，每孔加入100μl DMSO，振荡混匀，用酶标仪在570nm处测定吸光度值，采用IC50计算软件求出半数抑制浓度(IC50)。
试验结果详见表1，其中，样品是指相应实施例中制备的高乌甲素靛红杂合体，样品编号对应制备实施例中所得到的化合物的具体编号。
表1化合物对不同肿瘤细胞的半数抑制浓度IC50(单位：μmol/L)
化合物2在所测试的5种细胞株中均表现出了良好的抗肿瘤活性，化合物3次之，在不同的细胞株中也表现出了良好的抗肿瘤活性。以上实验结果表明，本发明的化合物具有良好的抗肿瘤活性，特别是高乌甲素与5-氟靛红的缩合产物，抗肿瘤活性明显。其他化合物的活性在特定细胞株中抗肿瘤活性与5-氟尿嘧啶相近，对不同肿瘤细胞株具有明显选择性。综上，本发明的高乌甲素靛红杂合体可作为抗肿瘤候选药物进一步进行临床前研究，也可以做为抗肿瘤先导化合物进一步研究。