一种溶解活化血小板栓块的基因工程重组蛋白AD18C及制备方法和应用与流程

本发明涉及基因工程领域，具体是用基因工程方法生产一种能够快速溶解活化血小板栓块的基因工程重组蛋白AD18C。

背景技术：

动脉血栓形成是心血管、脑血管和外周动脉疾病共同的病理生理机制。它对人类健康危害极大，可引起相应器官，尤其是心脑等重要脏器出现缺血、缺氧性坏死，危及生命。目前的治疗手段主要是针对血栓团块中的纤维蛋白进行溶栓治疗，效果有限。因此，挖掘血栓形成和发展过程中的新机制及发现新的药物作用靶点将具有重要临床意义和社会价值。

血小板在动脉血栓形成过程中起着关键性作用。动脉粥样硬化斑块损伤或破裂后可诱发血小板粘附、活化及聚集形成血栓。前期研究中，发现一类特殊的抗血小板整合素β3(GPIIIa)的抗体。它与血小板膜GPIIIa49-66表位结合后，可激活血小板内ROS氧化通路，氧化破碎血小板。人工合成的含I型血小板反应模体的解整合素金属蛋白酶18(ADAMTS18)C末端(837-1221)氨基酸片段(命名为AD18C)可以激活血小板内ROS氧化途径,解聚血小板栓块，缩小卒中大鼠脑梗死面积。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种溶解活化血小板栓块的基因工程重组蛋白AD18C及其制备方法，其基因工程重组蛋白AD18C能够用于动脉血栓性疾病的治疗，其制备方法：具有快速、稳定，且适合工业化生产。

实现本发明目的的具体技术方案是：

一种溶解活化血小板栓块的基因工程重组蛋白AD18C(编码ADAMTS18第870-1221位的氨基酸序列)，所述基因工程重组蛋白AD18C的脱氧核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种溶解活化血小板栓块的基因工程重组蛋白AD18C的制备方法，该方法包括以下步骤：

a)将特异性识别血小板整合素GPIIIa49-66表位的ADAMTS18蛋白C末端片段基因(命名为AD18C)用Noc I和Not I双酶切后插入到pGEX-4T2质粒中，构建成重组质粒pGEX-4T2-AD18C；将所述重组质粒pGEX-4T2-AD18C转化菌BL21(DE3)pLysS，得到基因工程菌pGEX-4T2-AD18C/BL21(DE3)pLysS；

b)将所述基因工程菌pGEX-4T2-AD18C/BL21(DE3)pLysS涂板，挑取单克隆菌至2YT培养基中，37℃培养过夜，按1:100比例转接后继续培养至OD_600nm≈0.4，加1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导4个小时；离心收集菌体，超声破菌，获得包涵体后洗涤、溶解，取上清过GST亲和柱，纯化产物进行复性处理，获得的溶解活化血小板栓块的基因工程重组蛋白AD18C。

所述步骤b)中2YT培养基的成分为胰蛋白胨0.35-0.6mol，酵母提取物0.4-0.75mol和氯化钠0.01-0.0125mol溶于1L蒸馏水中。

所述步骤b)中离心收集菌体，超声破菌，获得包涵体是：将经离心获得含重组蛋白AD18C的菌体先重悬于pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐中，随后与0.1-0.2mM溶菌酶混合，于30℃裂解30分钟，于4℃进行超声破菌，经12000r/min离心15min获得包涵体。

所述步骤b)中洗涤、溶解是：洗涤液成分为：含1-2mol/L尿素的4 0-80mmol/L pH8.0Tris-HCl，0.5-0.8mol/L氯化钠及1-2％TritonX-100(v/v)，溶解：采用的裂解液成分为：含6-8mol/L尿素的100-150mmol/L pH 8.0 Tris-HCl，0.5-0.7mol/L氯化钠，3-5mmol/Lβ-巯基乙醇及4-6mmol/L咪唑。

所述步骤b)中复性处理过程为：将5-10mg经Ni-NTA亲和柱纯化得到的变性基因工程重组蛋白AD18C逐滴加入到100mL复性液中，4℃过夜后，用透析缓冲液及PBS于4℃分别透析12小时，获得有活性的重组蛋白AD18C；其中，所述复性液成分为：含1-2mol/L尿素的80-100mmol/L pH 8.0 Tris-HCl及0.3-0.5mol/L L-精氨酸，所述透析缓冲液成分：含20-40nmol/L氯化钠的80-100mmol/L pH 8.0 Tris-HCl及0.3-0.6mol/L尿素。

所述溶解活化血小板栓块的基因工程重组蛋白AD18C在制备治疗动脉血栓性疾病的药物中的应用。

本发明有益效果：

本发明的基因工程重组蛋白AD18C，可裂解血小板栓块，用于动脉血栓性疾病治疗。其制备方法具有快速、人源化，且适合工业化生产。

附图说明

图1为本发明的基因工程重组蛋白AD18C的诱导表达图；

图2为本发明的基因工程重组蛋白AD18C的纯化图；

图3为本发明的基因工程重组蛋白AD18C诱导血小板氧化破碎检测结果图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

本发明溶解活化血小板栓块的基因工程重组蛋白AD18C的制备方法，包括以下具体步骤：

a)人源性基因工程重组蛋白AD18C的基因工程菌pGEX-4T2-AD18C/BL21(DE3)pLysS的构建。将人源性ADAMTS18基因C端片段用限制性内切酶Noc I和Not I双酶切后插入到表达质粒pGEX-4T2中，构建成重组质粒pGEX-4T2-AD18C；将重组后的表达质粒pGEX-4T2-AD18C转化宿主菌BL21(DE3)pLysS，获得能稳定分泌AD18C的基因工程菌pGEX-4T2-AD18C/BL21(DE3)pLysS；

b)溶解活化血小板栓块的基因工程重组蛋白AD18C的制备

ⅰ)将步骤a)中的基因工程菌pGEX-4T2-AD18C/BL21(DE3)pLysS于2YT培养基(胰蛋白胨0.35-0.6mol，酵母提取物0.4-0.75mol g，氯化钠0.01-0.0125mol溶于1L蒸馏水中灭菌)中37℃培养过夜，按1:100比例转接后继续培养至光密度值OD_600nm≈0.4，加1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导4个小时进行诱导表达，经离心获得含目的重组蛋白AD18C的菌体。菌体先重悬于三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl，pH 8.0)中，随后与溶菌酶(0.1-0.2mM)混合，30℃裂解30分钟，于4℃进行超声破菌，12000r/min离心15min获得包涵体。

ⅱ)将步骤ⅰ)中的包涵体进行复性处理：取包涵体悬浮在9倍体积的洗涤缓冲液中，洗涤2次，随后离心(步骤同上)。其中，洗涤液成分为4 0-80mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)含2mol/L尿素(Urea)，0.5-0.8mol/L氯化钠(NaCl)，1-2％TritonX-100(v/v)。获得的包涵体溶于裂解液中4℃过夜，随后12000r/min离心15min，上清经0.22μm滤器过滤进一步去除菌体碎片，上清中变性的基因工程抗体3C1浓度通过BCA蛋白法测定。其中，裂解液成分为：100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)含6-8mol/L尿素(Urea)，0.3-0.5mol/L氯化钠(NaCl)，3-5mmol/Lβ-巯基乙醇(β-ME)，3-5mmol/L咪唑。

ⅲ)将步骤ⅱ)的包涵体变性产物上清液通过GST亲和柱进行纯化，获得变性的AD18C基因工程重组蛋白。随后，将5-10mg纯化的变性基因工程重组蛋白AD18C逐滴加入到100mL复性液中，4℃过夜后，用透析缓冲液及PBS于4℃分别透析12小时，获得有活性的AD18C。其中，复性液成分：80-100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)含1-2mol/L尿素(Urea)，0.3-0.5mol/LL-精氨酸(L-Arg)；透析液成分：80-100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)含20-40nmol/L氯化钠(NaCl)，0.3-0.6mol/L尿素(Urea)。

实施例1

重组表达质粒pGEX-4T2-AD18C的构建

将ADAMTS18蛋白C端基因和pET22b质粒用Nco I和Not I分别进行双酶切。经1％琼脂糖电泳后，回收目的基因片段和pGEX-4T2的酶切大片段。用T4DNA连接酶将目的基因片段与载体片段于16℃连接过夜。将连接产物pGEX-4T2-AD18C转化DH5a感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB平板上培养。挑取单菌落，用Nco I/Not I双酶切鉴定筛选阳性克隆。抽提阳性克隆的质粒DNA，目的基因经测序确证。用正确基因序列的pGEX-4T2-AD18C质粒转化BL21(DE3)pLysS表达菌。如图1所示本发明基因工程重组蛋白AD18C的诱导表达结果，图中1为未经IPTG诱导的总菌体蛋白、2-5为经IPTG诱导1h,2h，3h,4h的总菌体蛋白、M为蛋白质分子量Marker。从图1可见，经IPTG诱导65Kda处有明显的外源性重组蛋白表达。参阅图1，表明基因工程重组蛋白AD18C从大肠杆菌中被纯化。

实施例2

基因工程重组蛋白AD18C的制备

从培养平板上挑取单菌落于2YT培养基(3C1为氨苄抗性)中，37℃，220rpm振荡培养过夜，按1:100比例转接后继续培养至OD_600nm≈0.4，加1mM IPTG诱导4个小时。离心(6,000rpm，15分钟)收集菌体。菌体先重悬于三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl，pH 8.0)中，随后与溶菌酶混合，30℃裂解30分钟，于4℃进行超声破菌，12000r/min离心15min获得包涵体。取包涵体悬浮在9倍体积的洗涤缓冲液中，洗涤2次，随后离心(步骤同上)。

获得的包涵体溶于裂解液中4℃过夜，随后12000r/min离心15min，上清经0.22μm滤器过滤进一步去除菌体碎片，上清中变性的基因工程重组蛋白AD18C浓度通过BCA蛋白发测定。

将5-10mg纯化的变性基因工程重组蛋白AD18C逐滴加入100mL复性液中，4℃过夜后，用透析缓冲液及PBS于4℃分别透析12小时，获得有活性的基因工程重组蛋白AD18C。

参阅图2，表明基因工程重组蛋白AD18C在大肠杆菌中被成功纯化。

实施例3

基因工程重组蛋白AD18C诱导血小板栓块的解聚

体外分离血小板，将1μg/mL胶原加到血小板悬液中于37℃共孵育1小时，离心，加入0.5μMAD18C和对照蛋白，在不同时间点于显微镜下计数每1000个血小板能形成的血小板栓块数目。

如图3所示，图中分别显示了Ctrl(对照蛋白)及rAD351(基因工程重组蛋白AD18C)在不同时间点对血小板栓块的解聚程度。从图3可见，基因工程重组蛋白AD18C可有效降低血小板栓块的聚集程度。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

序列表

<110> 华东师范大学

<120>一种溶解活化血小板栓块的基因工程重组蛋白AD18C

<160> 2

<210> 1

<211> 2022

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AD18C（编码ADAMTS18 第870-1221位）基因序列。

<400>

Acaaaaagacctgcctatacctggagtatcgtgcagtcagagtgctccgtctcctgtggtggaggttacataaatgtaaaggccatttgcttgcgagatcaaaatactcaagtcaattcctcattctgcagtgcaaaaaccaagccagtaactgagcccaaaatctgcaacgctttctcctgcccggcttactggatgccaggtgaatggagtacatgcagcaaggcctgtgctggaggccagcagagccgaaagatccagtgtgtgcaaaagaagcccttccaaaaggaggaagcagtgttgcattctctctgtccagtgagcacacccactcaggtccaagcctgcaacagccatgcctgccctccacaatggagccttggaccctggtctcagtgttccaagacctgtggacgaggggtgaggaagcgtgaactcctctgcaagggctctgccgcagaaaccctccccgagagccagtgtaccagtctccccagacctgagctgcaggagggctgtgtgcttggacgatgccccaagaacagccggctacagtgggtcgcttcttcgtggagcgagtgttctgcaacctgtggtttgggtgtgaggaagagggagatgaagtgcagcgagaagggcttccagggaaagctgataactttcccagagcgaagatgccgtaatattaagaaaccaaatctggacttggaagagacctgcaaccgacgggcttgcccagcccatccagtgtacaacatggtagctggatggtattcattgccgtggcagcagtgcacagtcacctgtgggggaggggtccagacccggtcagtccactgtgttcagcaaggccggccttcctcaagttgtctgctccatcagaaacctccggtgctacgagcctgtaatacaaacttctgtccagctcctgaaaagagagaggatccatcctgcgtagatttcttcaactggtgtcacctagttcctcagcatggtgtctgcaaccacaagttttacggaaaacaatgctgcaagtcatgcacaaggaagatctga

<210> 2

<211> 2084

<212> 氨基酸

<213> 人工序列

<220>

<223> AD18C（编码ADAMTS18 第870-1221位）氨基酸序列。

<400>

atkrpaytwsivqsecsvscgggyinvkaiclrdqntqvnssfcsaktkpvtepkicnafscpaywmpgewstcskacaggqqsrkiqcvqkkpfqkeeavlhslcpvstptqvqacnshacppqwslgpwsqcsktcgrgvrkrellckgsaaetlpesqctslprpelqegcvlgrcpknsrlqwvasswsecsatcglgvrkremkcsekgfqgklitfperrcrnikkpnldleetcnrracpahpvynmvagwyslpwqqctvtcgggvqtrsvhcvqqgrpssscllhqkppvlracntnfcpapekredpscvdffnwchlvpqhgvcnhkfygkqccksctrki