基于CD4+T细胞免疫的幽门螺杆菌优势抗原组合及筛选方法与流程

本发明属于医药生物技术领域，涉及一种幽门螺杆菌优势抗原组合，具体涉及一种基于CD4+T细胞免疫的幽门螺杆菌优势抗原组合及筛选方法。

背景技术：

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)定植于胃粘膜，是胃癌发生的Ⅰ类致病因子，是慢性胃炎、胃十二指肠溃疡、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤等胃肠疾病发生的主要致病因素。全球感染率超过50％，因此迫切需要一种有效的幽门螺杆菌疫苗。

候选抗原的筛选是疫苗研制的核心。不同于具有有限抗原数的病毒，细菌由于含有成百上千的大量抗原，很难对其进行系统性筛选，从而确定其免疫优势的保护性抗原。这一直阻碍着抗细菌疫苗的研发。

研究证明，胃黏膜局部th1和th17细胞在抗H.pylori感染中发挥了重要作用。利用CD4+T细胞优势表位H.pyloriaA(88-100)，证明在HLA-DRB1*1501限制性人群中，H.pyloriaA(88-100)表位特异性的CD4+T应答与胃病严重程度密切相关。Hitzler,I.对H.pylori免疫的小鼠B细胞和CD4+T细胞应答进行了分析，数据显示th1和th17细胞在其中起到了主要的保护作用，而非B细胞介导的体液免疫。同样的，DeLyria,E.S.的研究也支持了th17在H.pylori免疫中的保护作用。

但是，th1和th17的免疫优势抗原还从未被系统筛选过，基于此的新型幽门螺杆菌疫苗也没有被开发。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于CD4+T细胞免疫的幽门螺杆菌优势抗原组合。

本发明还提供了上述优势抗原组合的筛选方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

基于CD4+T细胞免疫的幽门螺杆菌优势抗原组合，包括以下三种及其同源蛋白：次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(inosine 5'-monophosphate dehydrogenase，IMPDH)、Ⅱ型柠檬酸合酶(type Ⅱ citrate synthase，CS Ⅱ)和尿素酶B亚单位(urease subunit beta，UreB)；其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

优选的，三种抗原的质量比为1：1：1，疫苗总抗原含量为100μg。

上述优势抗原组合在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗中的应用。

优选的，所述疫苗为蛋白或核酸疫苗。

优选的，所述疫苗还包含医学上可接受的免疫佐剂。

进一步优选的，所述免疫佐剂为弗氏佐剂、铝佐剂、CPG ODN 1826或AddaVax中的任一种或几种。

上述优势抗原组合的筛选方法，包括以下步骤：

1)裂解幽门螺杆菌菌体，得到幽门螺杆菌全抗原裂解液，然后根据各蛋白分子量的大小用分子筛分成30个组分；

2)利用步骤1)的30个组分分别刺激来自于幽门螺杆菌感染和免疫小鼠的脾CD4+T细胞，用³H-TdR掺入法检测CD4+T细胞增殖情况，并用增殖指数作图，得到刺激CD4+T细胞增殖能力最强的优势组分PC05和亚优势组分PC17；

3)利用步骤2)筛选出的优势组分PC05和亚优势组分PC17分别免疫小鼠进行攻毒保护实验，以H.pylori全菌免疫和PBS做对照，确定优势组分PC05具有更强的免疫清除能力，同时造成更轻的炎症损伤；

4)用高效液相色谱-质谱联用LC-MS/MS的方法将步骤3)所得的优势组分PC05中所含有的蛋白组分进行明确，确定PC05含有11种蛋白；

5)利用基因工程的方法合成步骤4)确定的11种蛋白；

6)用步骤5)合成的11种蛋白分别刺激PC05特异性CD4+T细胞，筛选鉴定出Th1和Th17应答最强的H.pylori抗原，共三种。

优选的，步骤1)中使用8M尿素裂解幽门螺杆菌菌体。

本发明的有益效果在于：

H.pylori感染胃粘膜后，H.pylori抗原会被树突状细胞(dendritic cells，DC)巨噬细胞等抗原递呈细胞(antigen-presenting cells，APC)所识别和加工递呈。APC继而激活原始CD4+T细胞诱导分泌IFN-γ的Th1细胞应答和分泌IL-17A的Th17细胞应答。IL-17会促使表达IL-17受体的胃粘膜上皮细胞、间质细胞、内皮细胞、粘膜固有层单核细胞等分泌IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等细胞因子，并募集中性粒细胞清除H.pylori。

故申请人尝试从H.pylori全菌中系统性筛选出Th1和Th17的免疫优势抗原，并基于此开发新型幽门螺杆菌疫苗。在此过程中，H.pylori全菌的每一个抗原均被纳入同步评测，直到免疫优势抗原被筛选出来。同时，在小鼠模型中验证各抗原的免疫保护率和炎症评分等指标。结果，成功筛选出Th1和Th17的三个优势抗原：IMPDH、CS Ⅱ和UreB。免疫保护实验证明其有更强的H.pylori清除能力并造成更轻的免疫病理损伤。这为未来新型幽门螺杆菌疫苗的设计开发提供了新的候选抗原。

结果显示所筛选的CD4+T细胞免疫优势抗原组合具有明显免疫保护作用，其保护效果优于H.pylori全蛋白抗原，具有更强的幽门螺杆菌清除能力，同时造成更轻的病理损伤。本发明所提供的三种免疫优势抗原均可诱导机体针对抗原产生强烈的免疫应答反应。因此通过诱导机体针对免疫保护性优势抗原产生应答，或直接用保护性抗原免疫机体将对幽门螺杆菌感染起到有效免疫保护作用，可用于进一步的幽门螺杆菌预防性和治疗性多价疫苗的研究。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1A～1D为H.pylori全抗原具有免疫保护作用，并在胃粘膜激发IFN-γ和IL-17A应答，其中，图1A为细菌定植量，图1B-1和图1B-2为胃单细胞悬液流式细胞术检测，图1C为CD3+T、CD4+T细胞数量，图1D为小鼠胃粘膜IFN-γ和IL-17A mRNA表达水平。

图2为用分子筛层析法将H.pylori全抗原依据分子量大小分成30个组分。

图3A和图3B为优势组分筛选，其中图3A为各组分刺激免疫/感染组CD4+T淋巴细胞增殖情况，图3B为各组分刺激免疫/未感染组CD4+T淋巴细胞增殖情况。

图4A～4C为H.pylori全抗原、PC05、PC17免疫保护评价，其中图4A为胃粘膜细菌定植量，图4B为胃组织病理评分，图4C为胃组织病理切片。

图5A～5C为优势组分PC05激发了更强的Th1和Th17应答，其中图5A为H.pylori全抗原、PC05、PC17免疫攻毒后，小鼠胃粘膜IFN-γ和IL-17AmRNA表达水平，图5B为抗原特异性CD4+T细胞流式细胞术检测，图5C为PC05激发特异性Th1和Th17应答水平强于PC17和H.pylori全菌抗原。

图6A～6D为P5(IMPDH)、P10(CS Ⅱ)和P11(UreB)激发了更强的特异性Th1和Th17应答。

图7为免疫优势抗原IMPDH、CS Ⅱ和UreB具有更好的免疫保护功能。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明涉及的幽门螺杆菌菌株B0是在BALB/c小鼠体内驯化得到。

材料与方法

(一)菌种和小鼠

幽门螺杆菌菌株B0：此菌株为幽门螺杆菌在BALB/c小鼠体内驯化得到的驯化株，其特点是更易于在BALB/c小鼠胃部定植，并导致病理反应。从幽门螺杆菌携带者胃组织分离培养幽门螺杆菌菌株，通过“三线法”接种于含10％(体积比)兔血的脑心浸液琼脂培养基。挑取单一菌落进行培养，并通过基因测序鉴定为幽门螺杆菌，命名为幽门螺杆菌菌株M。而后用幽门螺杆菌菌株M感染BALB/c小鼠。继而重复上述分离纯化方案，从BALB/c小鼠胃组织分离幽门螺杆菌。由此获得的更易于定植于BALB/c小鼠的幽门螺杆菌菌株，命名为幽门螺杆菌菌株B0。

幽门螺杆菌菌株B0在含10％(体积比)兔血的脑心浸液琼脂培养基中，37℃微需氧条件下培养。两天后，将幽门螺杆菌菌株从平板转移到10％(体积比)胎牛血清(FBS)布氏肉汤培养基扩大培养。取指数生长期的幽门螺杆菌用于感染和体外实验。六至八周龄的无特定病原(SPF)雌性BALB/c小鼠，购于第三军医大学实验动物中心。

(二)主要试剂及来源

具体见表1。

表1.本发明的主要试剂及来源

本发明的优势抗原组合的筛选方法，包括以下步骤：

1)使用8M尿素裂解幽门螺杆菌菌体，得到幽门螺杆菌全抗原尿素裂解液，然后根据各蛋白分子量的大小用分子筛分成30个组分；

2)利用步骤1)的30个组分分别刺激来自于幽门螺杆菌感染和免疫小鼠的脾CD4+T细胞，用³H-TdR掺入法检测CD4+T细胞增殖情况，并用增殖指数作图，得到刺激CD4+T细胞增殖能力最强的优势组分PC05和亚优势组分PC17；

3)利用步骤2)筛选出的优势组分PC05和亚优势组分PC17分别免疫小鼠进行攻毒保护实验，以H.pylori全菌免疫和PBS做对照，确定优势组分PC05具有更强的免疫清除能力，同时造成更轻的炎症损伤；

4)用高效液相色谱-质谱联用LC-MS/MS的方法将步骤3)所得的优势组分PC05中所含有的蛋白组分进行明确，确定PC05含有11种蛋白；

5)利用基因工程的方法合成步骤4)确定的11种蛋白；

6)用步骤5)合成的11种蛋白分别刺激PC05特异性CD4+T细胞，筛选鉴定出Th1和Th17应答最强的H.pylori抗原，共三种；

7)利用步骤6)筛选出的Th1和Th17细胞免疫优势抗原分别免疫小鼠进行攻毒保护实验，以PC05和PBS免疫做对照。确定三种免疫优势抗原均具有明显的免疫清除能力，同时造成更轻的炎症损伤。

实施例1：

H.pylori全菌免疫小鼠激发CD4+T细胞应答评价

1.动物免疫及攻毒实验方案

实验动物：BALB/c小鼠雌性6～8周龄。

抗原：

(1)免疫/攻毒组(I/C)：H.pylori灭活全菌。100μg/只。

(2)未免疫/攻毒组(U/C)：磷酸盐缓冲液(PBS)。

佐剂：弗氏佐剂。100μl/只。

免疫方式：皮下注射。

免疫体积：200μl/只。

免疫方案：皮下免疫3次(第0,2,4周)。第一次用完全弗氏佐剂，第二次用不完全弗氏佐剂，第三次不加佐剂。

末次免疫后一周，1.0×10⁹CFU幽门螺杆菌灌胃，每天一次，连续4天。攻毒后第4周处死小鼠，检测小鼠胃组织中幽门螺杆菌定值量、CD4+T细胞应答，分析其免疫保护效果。

2.小鼠胃粘膜幽门螺杆菌定值量检测。

实时定量PCR检测胃内幽门螺杆菌定植量。用细菌基因组提取试剂盒提取细菌DNA，依据幽门螺杆菌16SrDNA检测其定植量。结果见图1A。

幽门螺杆菌16SrDNA的序列如下：

上游引物：5’-TTTGTTAGAGAAGATAATGACGGTATCTAAC-3’，如SEQ ID NO.4所示；

下游引物：5’-CATAGGATTTCACACCTGACTGACTATC-3’，如SEQ ID NO.5所示。

荧光探针的序列如下：

FAM-CGTGCCAGCAGCCGCGGT-TAMRA，如SEQ ID NO.6所示。

3.小鼠胃粘膜CD4+T细胞应答检测

沿胃大弯和胃小弯解剖小鼠胃组织，用无菌PBS轻柔洗涤2次，以去除食物残渣。而后放入10ml Hank's平衡盐溶液(HBSS，不含Ca，My)中，含1mM二硫苏糖醇(DTT)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，和2％胎牛血清(FCS)，37℃孵育45min。然后，将所得混合物通过无菌钢网以除去未消化的组织得到单细胞悬液。消化后的单细胞悬液用无菌PBS洗两次。而后用免疫荧光标记的抗体(FITC-CD3，APC-CD4)染色并用流式细胞仪检测。参考图1B-1、图1B-2和图1C。

实时定量PCR检测小鼠胃粘膜局部mRNA水平CD4+T细胞免疫应答。Trizol法提取胃粘膜总RNA，反转录成cDNA，并用SYBR Green掺入法通过实时定量PCR检测IFN-γ和IL-17A的表达。结果见图1D。

IFN-γ的序列如下：

上游引物：5’-GATCCTTTGGACCCTCTGACTT-3’，如SEQ ID NO.7所示；

下游引物：5’-TGACTGTGCCGTGGCAGTAA-3’，如SEQ ID NO.8所示。

IL-17A的序列如下：

上游引物：5’-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3’，如SEQ ID NO.9所示；

下游引物：5’-GGGTCTTCATTGCGGTGG-3’，如SEQ ID NO.10所示。

实施例2：

分子筛层析将H.pylori全菌抗原依分子量大小分成不同组分

首先，幽门螺杆菌菌株B0溶解于8mol/L尿素，含10mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)1g/6ml，4℃条件下轻轻搅拌18小时。其次，12000g离心，收集上清液，用0.2μM滤器过滤。再次，通过分子筛层析，不同分子量的蛋白质被分为30组，混合蛋白组分命名为PC01～PC30(图2)。分子筛选用10/300GL Superdex 200层析柱，上样量为1ml，流量设定为0.5mL/min，收集1ml/管。所得蛋白组分用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析，并用二辛可宁酸(BCA)检测试剂盒测定各蛋白组分浓度。结果见图2。

实施例3：

³H-TdR掺入法检测不同组分刺激CD4+T细胞增殖程度

取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞的作为抗原递呈细胞(APC)。在96孔圆底板中每孔加入1×10⁵APC和200μL完全RPMI1640培养基。将其与H.pylori菌株B0全抗原或各蛋白组分PC01～PC30在37℃5％CO₂孵箱中共培养，各抗原的最终浓度为50μg/mL，每组设3个复孔。10小时后，分别从H.pylori免疫/感染和H.pylori免疫/未感染后4周的小鼠中，用磁珠分选脾脏CD4+T淋巴细胞。1×10⁵脾CD4+T淋巴细胞与上述APC共培养96小时。在最后的18小时加入³H-TdR 1μCi/孔。之后，用液体闪烁计数器检测每孔CPM值，并以刺激指数(SI)表示，SI定义为实验组CPM/阴性对照CPM。结果见图3A和图3B。

实施例4：

H.pylori全菌、PC05、PC17免疫保护功能评价

1.动物免疫及攻毒实验方案

实验动物：BALB/c小鼠雌性6～8周龄。

抗原：H.pylori灭活全菌、PC05、PC17，100μg/只。等量PBS对照。

佐剂：弗氏佐剂。100μl/只。

免疫方式：皮下注射。

免疫体积：200μl/只。

免疫方案：皮下免疫3次(第0,2,4周)。第一次用完全弗氏佐剂，第二次用不完全弗氏佐剂，第三次不加佐剂。

末次免疫后一周，1.0×10⁹CFU幽门螺杆菌灌胃，每天一次，连续4天。攻毒后第4周处死小鼠，检测小鼠胃组织中幽门螺杆菌定值量、病理损伤、CD4+T细胞应答，分析其免疫保护效果。

2.小鼠胃粘膜幽门螺杆菌定值量检测。

实时定量PCR检测胃内幽门螺杆菌定植量。用细菌基因组提取试剂盒提取细菌DNA，依据幽门螺杆菌16SrDNA检测其定植量。结果见图4A。

幽门螺杆菌16SrDNA的序列如下：

上游引物：5’-TTTGTTAGAGAAGATAATGACGGTATCTAAC-3’，如SEQ ID NO.4所示；

下游引物：5’-CATAGGATTTCACACCTGACTGACTATC-3’，如SEQ ID NO.5所示。

荧光探针的序列如下：

FAM-CGTGCCAGCAGCCGCGGT-TAMRA，如SEQ ID NO.6所示。

3.小鼠胃粘膜炎症评分

沿胃大弯纵向取少量胃组织，用福尔马林固定，石蜡包埋，5μm切片，并用苏木精-伊红染色。然后显微镜下进行组织病理学评分。结果见图4B和图4C。

评分标准为：0、无显著性病变；0.5、有轻微的异常，如小的炎性浸润灶或广泛的无炎症的粘膜化生；1.0、一种轻度的炎性细胞浸润，通常侵及腺体基底部；1.5、轻度浸润，再加上轻微的上皮增生或广泛的粘液细胞化生；2.0、炎症细胞侵及腺体和/或粘膜下层；2.5、炎性细胞侵及腺体，同时粘膜下层有粘液细胞化生和/或轻度上皮细胞增生；3.0、大片炎症侵及腺体和黏膜下层，常伴有中度粘液细胞化生和轻度至中度上皮增生；3.5、3.0以上的炎症伴明显上皮细胞增生；4.0、侵及粘膜层的强烈的炎症浸润，腺体正常结构破坏，并通常伴有明显的上皮增生和广泛的粘液细胞化生；4.5、严重的炎症伴有粘膜局灶性溃疡；5.0、广泛侵及黏膜和黏膜下的炎症，伴有腺体结构破坏和溃疡。

4.小鼠胃粘膜CD4+T细胞应答检测

沿胃大弯和胃小弯解剖小鼠胃组织，用无菌PBS轻柔洗涤2次，以去除食物残渣。而后放入10ml Hank's平衡盐溶液(HBSS，不含Ca，My)中，含1mM二硫苏糖醇(DTT)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，和2％胎牛血清(FCS)，37℃孵育45min。然后，将所得混合物通过无菌钢网以除去未消化的组织得到单细胞悬液。消化后的单细胞悬液用无菌PBS洗两次。而后用Trizol法提取其总RNA，反转录成cDNA，并用SYBR Green掺入法通过实时定量PCR检测IFN-γ和IL-17A的表达。结果见图5A。

IFN-γ的序列如下：

上游引物：5’-GATCCTTTGGACCCTCTGACTT-3’，如SEQ ID NO.7所示；

下游引物：5’-TGACTGTGCCGTGGCAGTAA-3’，如SEQ ID NO.8所示。

IL-17A的序列如下：

上游引物：5’-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3’，如SEQ ID NO.9所示；

下游引物：5’-GGGTCTTCATTGCGGTGG-3’，如SEQ ID NO.10所示。

5.小鼠脾细胞抗原特异性CD4+T细胞应答检测。

研磨法分离H.pylori感染小鼠脾淋巴细胞。然后1×10⁷淋巴细胞与100μg H.pylori菌株B0全抗原共培养，加5U/ml重组小鼠白细胞介素-2(rmIL-2)，3ml/孔完全RPMI1640培养基，12孔板。37℃，5％CO₂孵箱培养5天后，采用Ficoll梯度离心去除死细胞。将活细胞传代，加20U/ml rmIL-2，完全RPMI1640培养，至第十二天得H.pylori全菌特异性淋巴细胞。在这期间，需要时进行半量换液。将制备的特异性淋巴细胞1×10⁵与递呈了相应抗原的APC细胞1×10⁵在96孔圆底板中共培养5小时，每孔加200μL含BD golgistop完全RPMI1640培养基。然后用荧光标记抗体FITC-CD3、APC-CD4、PE-IFN-γ、PerCP-Cy5.5-IL-17A进行染色并用流式细胞仪分析。结果见图5B和图5C。

实施例5：

高效液相色谱-质谱联用解析蛋白组分

用高效液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS Analysis)解析PC05蛋白组分。将PC05蛋白条带从SDS-PAGE凝胶中转移至EP管中并用蛋白酶裂解，裂解产物由Maxis 4G UHR Q-TOF质谱仪进行检测。所有记录的数据用Proteome Discoverer^TM1.4Software软件进行分析(赛默飞世尔科技、美国)并与ncbi.fasta数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/)进行比对，从而确定蛋白组PC05的具体蛋白组分。

PC05蛋白组分及氨基酸序列

PC05包括11个蛋白组分(表2)。

表2.PC05的11个蛋白组分

P5inosine 5'-monophosphate dehydrogenase(IMPDH)次黄嘌呤核苷酸脱氢酶

MRILQRALTFEDVLMVPRKSSVLPKDVSLKSRLTKNISLNIPFISAAMDTVTEHKTAIAMARLGGIGIVHKNMDIQTQVKEITKVKKSESGVINDPIFIHAHRTLADAKVITDNYKISGVPVVDDKGLLIGILTNRDVRFETDLSKKVGDVMTKMPLVTARVGISLEEARDLMHKHKIEKLPIVDKDNVLKGLITIKDIQKRIEYPEANKDDFGRLRVGAAIGVGQLDRAEMLVKAGVDALVLDSAHGHSANILHTLEEIKKSLVVDVIVGNVVTKEATSDLISAGADAIKVGIGPGSICTTRIVAGVGMPQVSAIDNCVEVASKFDIPVIADGGIRYSGDVAKALALGASSVMIGSLLAGTEESPGDFMIYQGRQYKSYRGMGSIGAMTKGSSDRYFQEGVASEKLVPEGIEGRVPYRGKVSDMIFQLVGGVRSSMGYQGAKNILELYQNAEFVEITSAGLKESHVHGVDITKEAPNYYG

P10type II citrate synthase(CS Ⅱ)Ⅱ型柠檬酸合酶

MSVTLVNNENNERYEFETIESTRGPKAVDFSKLFETTGFFSYDPGYSSTAGCQSKISYVNGKKGELYYRGHRIEDLVAKYKYVDVCKLLLTGELPKNQDESLEFELELRHRSFVHESLLNMFSAFPSNAHPMAKLSSGVSILSTLYSTHQNMHTEEDYQTMARRIVAKIPTLAAICYRNEVGAPIIYPDIARSYVENILFMLRGYPYSRLKHTTQGEVEITPLEVEAFDKILTLHADHSQNASSTTVRNVASTGVHPYAAISAGISALWGHLHGGANEKVLLQLEEIGDVKNVDKYIARVKDKNDNFKLMGFGHRVYKSYDPRAKILKGLKDELHQKGVKMDERLSEIAAKVEEIALKDEYFIERNLYPNVDFYSGTILRALKIPVRFFTPVFVIGRTVGWCAQLLEHVKSPQARITRPRQVYVGD

P11urease subunit beta(UreB)尿素酶B亚单位

MKKISRKEYASMYGPTTGDKVRLGDTDLIAEVEHDYTIYGEELKFGGGKTLREGMSQSNNPSKEELDLIITNALIVDYTGIYKADIGIKDGKIAGIGKGGNKDMQDGVKNNLSVGPATEALAGEGLIVTAGGIDTHIHFISPQQIPTAFASGVTTMIGGGTGPADGTNATTITPGRRNLKFMLRAAEEYSMNIGFLAKGNASNDASLADQIEAGAIGLKIHEDWGTTPSAINHALDVADKYDVQVAIHTDTLNEAGCVEDTMAAIAGRTMHTYHTEGAGGGHAPDIIKVAGEHNILPASTNPTIPFTVNTEAEHMDMLMVCHHLDKSIKEDVQFADSRIRPQTIAAEDTLHDMGIFSITSSDSQAMGRVGEVITRTWQTADKNKKEFGRLKEEKGDNDNFRIKRYLSKYTINPAIAHGISEYVGSVEVGKVADLVLWSPAFFGVKPNMIIKGGFIALSQMGDANASIPTPQPVYYREMFAHHGKAKYDANITFVSQAAYDKGIKEELGLERQVLPVKNCRNITKKDMQFNDTTAHIEVNSETYHVFVDGKEVTSKPANKVSLAQLFSIF

实施例6：

PC05组分中11种蛋白的克隆表达

用细菌基因组提取试剂盒提取H.pylori DNA。依据11种蛋白的基因序列设计上下游引物，PCR扩增得到目的基因。选用pGEX-6P-1作为载体质粒，在工程菌E.Coli中诱导表达。用GST标签蛋白纯化填料(Glutathione Sepharose 4Fast Flow)分离含有GST标签的目的蛋白。而后用Prescission Protease切除GST标签，得到目的蛋白。BCA法测定浓度待用。

实施例7：

PC05组分中CD4+T淋巴细胞优势抗原鉴定

研磨法分离PC05组分免疫小鼠脾淋巴细胞。然后1×10⁷淋巴细胞与100μg PC05组分抗原共培养，加5U/ml重组小鼠白细胞介素-2(rmIL-2)，3ml/孔完全RPMI1640培养基，12孔板。37℃，5％CO₂孵箱培养5天后，采用Ficoll梯度离心去除死细胞。将活细胞传代，加20U/ml rmIL-2，完全RPMI1640培养，至第十二天得H.pylori全菌特异性或单一蛋白抗原特异性淋巴细胞。在这期间，需要时进行半量换液。将制备的特异性淋巴细胞1×10⁵与分别递呈了PC05中11种抗原的APC细胞1×10⁵在96孔圆底板中共培养5小时，每孔加200μL含BD golgistop完全RPMI1640培养基。然后用荧光标记抗体FITC-CD3、APC-CD4、PE-IFN-γ、PerCP-Cy5.5-IL-17A进行染色并用流式细胞仪分析。结果见图6A和图6B。

实施例8：

优势抗原IMPDH、CS Ⅱ和UreB免疫保护功能评价

1.动物免疫及攻毒实验方案

实验动物：BALB/c小鼠雌性6～8周龄。

抗原：IMPDH、CS Ⅱ和UreB，100μg/只。等量PBS对照。

佐剂：弗氏佐剂。100μl/只。

免疫方式：皮下注射。

免疫体积：200μl/只。

免疫方案：皮下免疫3次(第0,2,4周)。第一次用完全弗氏佐剂，第二次用不完全弗氏佐剂，第三次不加佐剂。

末次免疫后一周，1.0×10⁹CFU幽门螺杆菌灌胃，每天一次，连续4天。攻毒后第4周处死小鼠，检测小鼠胃组织中幽门螺杆菌定值量、病理损伤、CD4+T细胞应答，分析其免疫保护效果。

2.小鼠胃粘膜幽门螺杆菌定值量检测。

实时定量PCR检测胃内幽门螺杆菌定植量。用细菌基因组提取试剂盒提取细菌DNA，依据幽门螺杆菌16SrDNA检测其定植量。结果见图6C。

幽门螺杆菌16SrDNA的序列如下：

上游引物：5’-TTTGTTAGAGAAGATAATGACGGTATCTAAC-3’，如SEQ ID NO.4所示；

下游引物：5’-CATAGGATTTCACACCTGACTGACTATC-3’，如SEQ ID NO.5所示。

荧光探针的序列如下：

FAM-CGTGCCAGCAGCCGCGGT-TAMRA，如SEQ ID NO.6所示。

3.小鼠胃粘膜炎症评分

沿胃大弯纵向取少量胃组织，用福尔马林固定，石蜡包埋，5μm切片，并用苏木精-伊红染色。然后显微镜下进行组织病理学评分。结果见图6D。

评分标准为：0、无显著性病变；0.5、有轻微的异常，如小的炎性浸润灶或广泛的无炎症的粘膜化生；1.0、一种轻度的炎性细胞浸润，通常侵及腺体基底部；1.5、轻度浸润，再加上轻微的上皮增生或广泛的粘液细胞化生；2.0、炎症细胞侵及腺体和/或粘膜下层；2.5、炎性细胞侵及腺体，同时粘膜下层有粘液细胞化生和/或轻度上皮细胞增生；3.0、大片炎症侵及腺体和黏膜下层，常伴有中度粘液细胞化生和轻度至中度上皮增生；3.5、3.0以上的炎症伴明显上皮细胞增生；4.0、侵及粘膜层的强烈的炎症浸润，腺体正常结构破坏，并通常伴有明显的上皮增生和广泛的粘液细胞化生；4.5、严重的炎症伴有粘膜局灶性溃疡；5.0、广泛侵及黏膜和黏膜下的炎症，伴有腺体结构破坏和溃疡。

4.小鼠胃粘膜CD4+T细胞应答检测

沿胃大弯和胃小弯解剖小鼠胃组织，用无菌PBS轻柔洗涤2次，以去除食物残渣。而后放入10ml Hank's平衡盐溶液(HBSS，不含Ca，My)中，含1mM二硫苏糖醇(DTT)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，和2％胎牛血清(FCS)，37℃孵育45min。然后，将所得混合物通过无菌钢网以除去未消化的组织得到单细胞悬液。消化后的单细胞悬液用无菌PBS洗两次。而后用Trizol法提取其总RNA，反转录成cDNA，并用SYBR Green掺入法实时定量PCR检测IFN-γ和IL-17A的表达。结果见图7。

IFN-γ的序列如下：

上游引物：5’-GATCCTTTGGACCCTCTGACTT-3’，如SEQ ID NO.7所示；

下游引物：5’-TGACTGTGCCGTGGCAGTAA-3’，如SEQ ID NO.8所示。

IL-17A的序列如下：

上游引物：5’-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3’，如SEQ ID NO.9所示；

下游引物：5’-GGGTCTTCATTGCGGTGG-3’，如SEQ ID NO.10所示。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军第三军医大学

<120> 基于CD4+T细胞免疫的幽门螺杆菌优势抗原组合及筛选方法

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 481

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 次黄嘌呤核苷酸脱氢酶

<400> 1

Met Arg Ile Leu Gln Arg Ala Leu Thr Phe Glu Asp Val Leu Met Val

1 5 10 15

Pro Arg Lys Ser Ser Val Leu Pro Lys Asp Val Ser Leu Lys Ser Arg

20 25 30

Leu Thr Lys Asn Ile Ser Leu Asn Ile Pro Phe Ile Ser Ala Ala Met

35 40 45

Asp Thr Val Thr Glu His Lys Thr Ala Ile Ala Met Ala Arg Leu Gly

50 55 60

Gly Ile Gly Ile Val His Lys Asn Met Asp Ile Gln Thr Gln Val Lys

65 70 75 80

Glu Ile Thr Lys Val Lys Lys Ser Glu Ser Gly Val Ile Asn Asp Pro

85 90 95

Ile Phe Ile His Ala His Arg Thr Leu Ala Asp Ala Lys Val Ile Thr

100 105 110

Asp Asn Tyr Lys Ile Ser Gly Val Pro Val Val Asp Asp Lys Gly Leu

115 120 125

Leu Ile Gly Ile Leu Thr Asn Arg Asp Val Arg Phe Glu Thr Asp Leu

130 135 140

Ser Lys Lys Val Gly Asp Val Met Thr Lys Met Pro Leu Val Thr Ala

145 150 155 160

Arg Val Gly Ile Ser Leu Glu Glu Ala Arg Asp Leu Met His Lys His

165 170 175

Lys Ile Glu Lys Leu Pro Ile Val Asp Lys Asp Asn Val Leu Lys Gly

180 185 190

Leu Ile Thr Ile Lys Asp Ile Gln Lys Arg Ile Glu Tyr Pro Glu Ala

195 200 205

Asn Lys Asp Asp Phe Gly Arg Leu Arg Val Gly Ala Ala Ile Gly Val

210 215 220

Gly Gln Leu Asp Arg Ala Glu Met Leu Val Lys Ala Gly Val Asp Ala

225 230 235 240

Leu Val Leu Asp Ser Ala His Gly His Ser Ala Asn Ile Leu His Thr

245 250 255

Leu Glu Glu Ile Lys Lys Ser Leu Val Val Asp Val Ile Val Gly Asn

260 265 270

Val Val Thr Lys Glu Ala Thr Ser Asp Leu Ile Ser Ala Gly Ala Asp

275 280 285

Ala Ile Lys Val Gly Ile Gly Pro Gly Ser Ile Cys Thr Thr Arg Ile

290 295 300

Val Ala Gly Val Gly Met Pro Gln Val Ser Ala Ile Asp Asn Cys Val

305 310 315 320

Glu Val Ala Ser Lys Phe Asp Ile Pro Val Ile Ala Asp Gly Gly Ile

325 330 335

Arg Tyr Ser Gly Asp Val Ala Lys Ala Leu Ala Leu Gly Ala Ser Ser

340 345 350

Val Met Ile Gly Ser Leu Leu Ala Gly Thr Glu Glu Ser Pro Gly Asp

355 360 365

Phe Met Ile Tyr Gln Gly Arg Gln Tyr Lys Ser Tyr Arg Gly Met Gly

370 375 380

Ser Ile Gly Ala Met Thr Lys Gly Ser Ser Asp Arg Tyr Phe Gln Glu

385 390 395 400

Gly Val Ala Ser Glu Lys Leu Val Pro Glu Gly Ile Glu Gly Arg Val

405 410 415

Pro Tyr Arg Gly Lys Val Ser Asp Met Ile Phe Gln Leu Val Gly Gly

420 425 430

Val Arg Ser Ser Met Gly Tyr Gln Gly Ala Lys Asn Ile Leu Glu Leu

435 440 445

Tyr Gln Asn Ala Glu Phe Val Glu Ile Thr Ser Ala Gly Leu Lys Glu

450 455 460

Ser His Val His Gly Val Asp Ile Thr Lys Glu Ala Pro Asn Tyr Tyr

465 470 475 480

Gly

<210> 2

<211> 426

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Ⅱ型柠檬酸合酶

<400> 2

Met Ser Val Thr Leu Val Asn Asn Glu Asn Asn Glu Arg Tyr Glu Phe

1 5 10 15

Glu Thr Ile Glu Ser Thr Arg Gly Pro Lys Ala Val Asp Phe Ser Lys

20 25 30

Leu Phe Glu Thr Thr Gly Phe Phe Ser Tyr Asp Pro Gly Tyr Ser Ser

35 40 45

Thr Ala Gly Cys Gln Ser Lys Ile Ser Tyr Val Asn Gly Lys Lys Gly

50 55 60

Glu Leu Tyr Tyr Arg Gly His Arg Ile Glu Asp Leu Val Ala Lys Tyr

65 70 75 80

Lys Tyr Val Asp Val Cys Lys Leu Leu Leu Thr Gly Glu Leu Pro Lys

85 90 95

Asn Gln Asp Glu Ser Leu Glu Phe Glu Leu Glu Leu Arg His Arg Ser

100 105 110

Phe Val His Glu Ser Leu Leu Asn Met Phe Ser Ala Phe Pro Ser Asn

115 120 125

Ala His Pro Met Ala Lys Leu Ser Ser Gly Val Ser Ile Leu Ser Thr

130 135 140

Leu Tyr Ser Thr His Gln Asn Met His Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Thr

145 150 155 160

Met Ala Arg Arg Ile Val Ala Lys Ile Pro Thr Leu Ala Ala Ile Cys

165 170 175

Tyr Arg Asn Glu Val Gly Ala Pro Ile Ile Tyr Pro Asp Ile Ala Arg

180 185 190

Ser Tyr Val Glu Asn Ile Leu Phe Met Leu Arg Gly Tyr Pro Tyr Ser

195 200 205

Arg Leu Lys His Thr Thr Gln Gly Glu Val Glu Ile Thr Pro Leu Glu

210 215 220

Val Glu Ala Phe Asp Lys Ile Leu Thr Leu His Ala Asp His Ser Gln

225 230 235 240

Asn Ala Ser Ser Thr Thr Val Arg Asn Val Ala Ser Thr Gly Val His

245 250 255

Pro Tyr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Ile Ser Ala Leu Trp Gly His Leu

260 265 270

His Gly Gly Ala Asn Glu Lys Val Leu Leu Gln Leu Glu Glu Ile Gly

275 280 285

Asp Val Lys Asn Val Asp Lys Tyr Ile Ala Arg Val Lys Asp Lys Asn

290 295 300

Asp Asn Phe Lys Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys Ser Tyr

305 310 315 320

Asp Pro Arg Ala Lys Ile Leu Lys Gly Leu Lys Asp Glu Leu His Gln

325 330 335

Lys Gly Val Lys Met Asp Glu Arg Leu Ser Glu Ile Ala Ala Lys Val

340 345 350

Glu Glu Ile Ala Leu Lys Asp Glu Tyr Phe Ile Glu Arg Asn Leu Tyr

355 360 365

Pro Asn Val Asp Phe Tyr Ser Gly Thr Ile Leu Arg Ala Leu Lys Ile

370 375 380

Pro Val Arg Phe Phe Thr Pro Val Phe Val Ile Gly Arg Thr Val Gly

385 390 395 400

Trp Cys Ala Gln Leu Leu Glu His Val Lys Ser Pro Gln Ala Arg Ile

405 410 415

Thr Arg Pro Arg Gln Val Tyr Val Gly Asp

420 425

<210> 3

<211> 569

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尿素酶B亚单位

<400> 3

Met Lys Lys Ile Ser Arg Lys Glu Tyr Ala Ser Met Tyr Gly Pro Thr

1 5 10 15

Thr Gly Asp Lys Val Arg Leu Gly Asp Thr Asp Leu Ile Ala Glu Val

20 25 30

Glu His Asp Tyr Thr Ile Tyr Gly Glu Glu Leu Lys Phe Gly Gly Gly

35 40 45

Lys Thr Leu Arg Glu Gly Met Ser Gln Ser Asn Asn Pro Ser Lys Glu

50 55 60

Glu Leu Asp Leu Ile Ile Thr Asn Ala Leu Ile Val Asp Tyr Thr Gly

65 70 75 80

Ile Tyr Lys Ala Asp Ile Gly Ile Lys Asp Gly Lys Ile Ala Gly Ile

85 90 95

Gly Lys Gly Gly Asn Lys Asp Met Gln Asp Gly Val Lys Asn Asn Leu

100 105 110

Ser Val Gly Pro Ala Thr Glu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Leu Ile Val

115 120 125

Thr Ala Gly Gly Ile Asp Thr His Ile His Phe Ile Ser Pro Gln Gln

130 135 140

Ile Pro Thr Ala Phe Ala Ser Gly Val Thr Thr Met Ile Gly Gly Gly

145 150 155 160

Thr Gly Pro Ala Asp Gly Thr Asn Ala Thr Thr Ile Thr Pro Gly Arg

165 170 175

Arg Asn Leu Lys Phe Met Leu Arg Ala Ala Glu Glu Tyr Ser Met Asn

180 185 190

Ile Gly Phe Leu Ala Lys Gly Asn Ala Ser Asn Asp Ala Ser Leu Ala

195 200 205

Asp Gln Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Leu Lys Ile His Glu Asp Trp

210 215 220

Gly Thr Thr Pro Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp Lys

225 230 235 240

Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr Leu Asn Glu Ala Gly

245 250 255

Cys Val Glu Asp Thr Met Ala Ala Ile Ala Gly Arg Thr Met His Thr

260 265 270

Tyr His Thr Glu Gly Ala Gly Gly Gly His Ala Pro Asp Ile Ile Lys

275 280 285

Val Ala Gly Glu His Asn Ile Leu Pro Ala Ser Thr Asn Pro Thr Ile

290 295 300

Pro Phe Thr Val Asn Thr Glu Ala Glu His Met Asp Met Leu Met Val

305 310 315 320

Cys His His Leu Asp Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Ala Asp

325 330 335

Ser Arg Ile Arg Pro Gln Thr Ile Ala Ala Glu Asp Thr Leu His Asp

340 345 350

Met Gly Ile Phe Ser Ile Thr Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg

355 360 365

Val Gly Glu Val Ile Thr Arg Thr Trp Gln Thr Ala Asp Lys Asn Lys

370 375 380

Lys Glu Phe Gly Arg Leu Lys Glu Glu Lys Gly Asp Asn Asp Asn Phe

385 390 395 400

Arg Ile Lys Arg Tyr Leu Ser Lys Tyr Thr Ile Asn Pro Ala Ile Ala

405 410 415

His Gly Ile Ser Glu Tyr Val Gly Ser Val Glu Val Gly Lys Val Ala

420 425 430

Asp Leu Val Leu Trp Ser Pro Ala Phe Phe Gly Val Lys Pro Asn Met

435 440 445

Ile Ile Lys Gly Gly Phe Ile Ala Leu Ser Gln Met Gly Asp Ala Asn

450 455 460

Ala Ser Ile Pro Thr Pro Gln Pro Val Tyr Tyr Arg Glu Met Phe Ala

465 470 475 480

His His Gly Lys Ala Lys Tyr Asp Ala Asn Ile Thr Phe Val Ser Gln

485 490 495

Ala Ala Tyr Asp Lys Gly Ile Lys Glu Glu Leu Gly Leu Glu Arg Gln

500 505 510

Val Leu Pro Val Lys Asn Cys Arg Asn Ile Thr Lys Lys Asp Met Gln

515 520 525

Phe Asn Asp Thr Thr Ala His Ile Glu Val Asn Ser Glu Thr Tyr His

530 535 540

Val Phe Val Asp Gly Lys Glu Val Thr Ser Lys Pro Ala Asn Lys Val

545 550 555 560

Ser Leu Ala Gln Leu Phe Ser Ile Phe

565

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 幽门螺杆菌16SrDNA上游引物

<400> 4

tttgttagag aagataatga cggtatctaa c 31

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 幽门螺杆菌16SrDNA下游引物

<400> 5

cataggattt cacacctgac tgactatc 28

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 荧光探针

<400> 6

cgtgccagca gccgcggt 18

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IFN-γ上游引物

<400> 7

gatcctttgg accctctgac tt 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IFN-γ下游引物

<400> 8

tgactgtgcc gtggcagtaa 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-17A上游引物

<400> 9

ctccagaagg ccctcagact ac 22

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-17A下游引物

<400> 10

gggtcttcat tgcggtgg 18