一种肺炎支原体的滚环恒温扩增快速检测引物及试剂盒的制作方法

文档序号:11126273阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种肺炎支原体的滚环恒温扩增快速检测引物,其特征在于,所述的引物根据肺炎支原体P1基因的特异性保守靶序列设计的,所述引物包括四条引物,前端内引物SIP,后端内引物ASIP,外引物S或AS;所述的一对外引物S和AS,其中S引物位于ASIP上游,AS引物位于SIP下游;各引物的核苷酸序列如下:

外引物S:SEQ ID NO:2: CGC TGC GCC ACA CCA ATG;

外引物AS:SEQ ID NO:3: AGC GGC TTT GAC CGC ATC;

内引物SIP:SEQ ID NO:4:TGA ATC CGT TAG TTT TTC TCC CGC TCT CCC AAC CCG CGC TTA ACC CCG TG;

内引物ASIP:SEQ ID NO:5:AAT AAG GAG GCG GCT GCT GGT CGG GTG GGA TCA TAC GTG GT;

还包括一个桥式引物,核苷酸序列如下:

桥式引物BP:SEQ ID NO:6:CTA ACG GAT TCA AAT AAG GAGG。

2.如权利要求1所述的引物,其特征在于,可以用于检测肺炎支原体。

3.如权利要求1所述用于检测肺炎支原体的引物制作的试剂盒,其特征在于,试剂盒配方中组份包括权利要求1所述的4个引物、Bst DNA聚合酶缓冲液、MgSO4溶液、连接酶缓冲液、肺炎支原体基因组DNA、DNA连接酶、Bst聚合酶大片段、钙黄绿素指示剂和水。

4.如权利要求3所述用于检测肺炎支原体的引物制作的试剂盒,其特征在于,所述的检测方法包括如下步骤:

(1)提取肺炎支原体的的基因组 DNA;

(2)按试剂盒配方制作肺炎支原体滚环扩增检测反应体系;

(3)反应结束后进行结果判定:在反应液中加入钙黄绿素指示剂,颜色变为绿色表示待测样品中存在肺炎支原体,表示结果为阳性,颜色变为橙色表示待测样品中不存在肺炎支原体,表示结果为阴性。

5.如权利要求4所述用于检测肺炎支原体的引物制作的试剂盒的检测方法,其特征在于,所述的提取肺炎支原体的基因组DNA的OD260/OD280 为1.6-2.0, 浓度在10 -100ng/μL。

6.如权利要求5所述用于检测肺炎支原体的引物制作的试剂盒的检测方法,其特征在于,所述的提取肺炎支原体的基因组DNA 的OD260/OD280优选1.8。

7.如权利要求4-6任一所述的用于检测肺炎支原体的引物制作的试剂盒的检测方法,其特征在于,所述的反应体系中原料组份体积含量如下:2µl 10×Bst DNA 聚合酶缓冲液(200 mm Tris-HCl、100 mm (NH4)2SO4、100 mm KCl、20 mm MgSO4、1% Triton® X -100);2µl MgSO4 (100 mm);2µl 10×DNA连接酶缓冲液(400 mm Tris-HCl、100 mm MgCl2、100mm DTT、 5mm ATP);1µl dNTP(10mm each);1µl外引物S(10 µm);1µl外引物AS(10 µm);1µl内引物SIP(10 µm);1µl内引物ASIP(10 µm);1µl桥式引物BP(10 µm);1µl Bst DNA聚合酶大片段(NEB 1600 U/mL);0.5µl DNA连接酶(Thermo 1000 U/mL)和2.5µl水。

8.如权利要求4所述的用于检测肺炎支原体的引物制作的试剂盒的检测方法,其特征在于,所述的钙黄绿素指示剂为终浓度25µM钙黄绿素和400 µM 氯化锰。

9.如权利要求4所述的用于检测肺炎支原体的引物制作的试剂盒对痰液、咽试纸的样品进行肺炎支原体的检测。

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