本发明属于微生物菌剂技术领域，特别涉及一种改善土壤重金属污染的真菌菌剂的制备方法。
(二)
背景技术：
重金属在土壤中大量堆积导致土壤性质发生变化，直接影响土壤营养元素的供应和肥力特性。重金属污染土壤的氮元素矿化明显降低，土壤供氮能力下降；重金属污染的土壤对磷的吸持固定作用增强，土壤磷有效性下降；重金属污染的土壤对钾的吸附能力下降，交换钾含量下降，水溶态钾含量上升，加速钾的流失，最终影响到土壤中氮、磷、钾的保持和供应。
外生菌根真菌的菌丝可以在植物营养根表面形成一层紧密交织的菌套，它不仅有助于促进宿主植物对矿物质形式的磷酸盐和氮的吸收，更重要的是，菌根真菌可以“钝化”土壤中的重金属，减少植物对重金属的吸收。目前，对于重金属污染或高铬、高铅土壤，尚未有有效改善土壤中重金属污染的肥料或菌剂，导致生长于上述土壤中的宿主植物根系被重金属侵染，影响植物生长和土壤品质的提升。
(三)
技术实现要素：
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种制备科学、成本低廉、改善土壤重金属污染的真菌菌剂的制备方法，该制备方法制得的菌剂施用于高铬、高铅土壤中，肥效显著，能有效避免上述土壤中植物根系的重金属侵染，降解重金属，提高土壤品质，促进植物生长，解决了现有技术中存在的问题。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种改善土壤重金属污染的真菌菌剂的制备方法，包括如下操作步骤：
(1)分别挑取褐环乳牛肝菌、美味牛肝菌及红绒盖牛肝菌的斜面菌种的边缘菌丝接种于PDA固体培养基中，28℃条件下暗培养48h，得活化菌种；
(2)取步骤(1)经活化培养的各菌种的菌丝体培养基，分别切成菌丝体小块，备用；
(3)在无菌条件下，将步骤(2)得到的褐环乳牛肝菌菌丝体小块转接到褐环乳牛肝菌液体培养基中，26-30℃条件下摇床振荡暗培养5-6d，得褐环乳牛肝菌种子液；
在无菌条件下，将步骤(2)得到的红绒盖牛肝菌菌丝体小块转接到红绒盖牛肝菌液体培养基中，28-32℃条件下摇床振荡暗培养5-6d，得红绒盖牛肝菌种子液；
在无菌条件下，将步骤(2)得到的美味牛肝菌菌丝体小块转接到美味牛肝菌液体培养基中，24-28℃条件下摇床振荡暗培养5-6d，得美味牛肝菌种子液；
(4)按(4-6)：(1-3)：(2-4)：(0.5-1)：(1-3)的重量比，将菌剂承载物：玉米芯、麸皮、棉籽壳、壳聚糖、木屑依次投入到混合搅拌机中，充分混合，混匀后经粉碎机粉碎过筛，得0.5-1mm粉末，再经120℃高温灭菌30min，得混合菌剂承载物，备用；
(5)按与无菌水重量比为(10-12):25的比例，将步骤(4)灭菌的混合菌剂承载物和无菌水加入到发酵罐中，得混合培养基；
(6)按照占发酵培养基重量5％的接种量，分别将三种菌的种子液接种到步骤(5)的混合培养基中，在26-30℃条件下搅拌暗培养6-8天，得发酵菌液；
(7)将步骤(6)的发酵菌液过滤，得含有菌丝体的滤饼，经干燥降低水分至不高于15％，粉碎滤饼至60目-100目，分装即得。
步骤(3)的褐环乳牛肝菌液体培养基为葡萄糖20g/L、麦芽汁10mL/L、酵母膏6g/L、磷酸二氢钾0.25g/L、硫酸镁0.3g/L、氯化钙0.19g/L、柠檬酸0.1g/L、氯化铁0.15g/L、VB12mg/L，自然pH值：步骤(3)的红绒盖牛肝菌液体培养基为：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L、VB1 10mg/L，自然pH值；步骤(3)的美味牛肝菌液体培养基为：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、麸皮100g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸镁3g/L、VB115mg/L，自然pH值。
步骤(3)摇床振荡频率为120r/min-180r/min。
用法用量：该改善土壤重金属污染的真菌菌剂的制备方法制得的菌剂针对树龄大小施用，按300g-500g/棵穴施或者沟施，尽量靠近树根施用。
本发明改善土壤重金属污染的真菌菌剂的制备方法的有益效果为：
1、本发明制备方法使用的褐环乳牛肝菌、美味牛肝菌和红绒盖牛肝菌取自于内蒙古农业大学经筛选保存的菌种，通过本发明方法的培养，这三种菌可发挥对土壤中重金属的“过滤”作用，避免重金属对植物组织造成伤害，其菌丝对重金属有较强的吸持能力，使重金属积聚于真菌中，当土壤中重金属达到毒害水平时，真菌细胞壁分泌的粘液和真菌组织中的聚磷酸、有机酸等能结合过量的重金属元素，减少重金属向地上部的转移、达到解毒作用，对降低植物根系侵染和降解重金属表现突出。
2、本发明制备方法所用的菌剂承载物为玉米芯、麸皮、木屑、壳聚糖和稻壳粉等，取材便宜，能使菌体迅速繁殖，菌丝的含量高，对植物的效用高。
3、本发明制备方法采用对菌根真菌进行液体深层发酵，菌丝的形成速度快，大大节省了发酵时间和成本，最终制得的菌剂效用高，提升了土壤品质。
(四)具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于此。
实施例1：
该改善土壤重金属污染的真菌菌剂的制备方法，采用如下操作步骤：
(1)分别挑取褐环乳牛肝菌、美味牛肝菌及红绒盖牛肝菌的斜面菌种的边缘菌丝接种于PDA固体培养基中，28℃条件下暗培养48h，得活化菌种；
(2)取步骤(1)经活化培养的各菌种的菌丝体培养基，分别切成1cm菌丝体小块，备用；
(3)在无菌条件下，将步骤(2)得到的褐环乳牛肝菌菌丝体小块转接到褐环乳牛肝菌液体培养基中，28℃条件下摇床120r/min振荡暗培养5d，得褐环乳牛肝菌种子液；
在无菌条件下，将步骤(2)得到的红绒盖牛肝菌菌丝体小块转接到红绒盖牛肝菌液体培养基中，30℃条件下摇床120r/min振荡暗培养5d，得红绒盖牛肝菌种子液；
在无菌条件下，将步骤(2)得到的美味牛肝菌菌丝体小块转接到美味牛肝菌液体培养基中，26℃条件下摇床180r/min振荡暗培养5d，得美味牛肝菌种子液；
(4)将菌剂承载物：玉米芯200g、麸皮80g、棉籽壳120g、壳聚糖40g、木屑80g依次投入到混合搅拌机中，充分混合，混匀后经粉碎机粉碎过筛，得0.5mm粉末，再经120℃高温灭菌30min，得混合菌剂承载物，备用；
(5)将步骤(4)灭菌的混合菌剂承载物和1000g无菌水加入到发酵罐中，得混合培养基；
(6)按照均占混合培养基重量5％的接种量，分别将三种菌的种子液接种到步骤(5)的发酵培养基中，在28℃条件下搅拌暗培养7天，得发酵菌液；
(7)将步骤(6)的发酵菌液过滤，得含有菌丝体的滤饼，经干燥降低水分至14％，粉碎滤饼至80目，分装即得。
步骤(1)的PDA固体培养基为：马铃薯汁1000mL、葡萄糖20g、琼脂18-20g。
步骤(3)的褐环乳牛肝菌液体培养基为：葡萄糖20g/L、麦芽汁10mL/L、酵母膏6g/L、磷酸二氢钾0.25g/L、硫酸镁0.3g/L、氯化钙0.19g/L、柠檬酸0.1g/L、氯化铁0.15g/L、VB12mg/L，自然pH值：
步骤(3)的红绒盖牛肝菌液体培养基为：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L、VB1 10mg/L，自然pH值；
步骤(3)的美味牛肝菌液体培养基为：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、麸皮100g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸镁3g/L、VB115mg/L，自然pH值。
以上褐环乳牛肝菌、美味牛肝菌和红绒盖牛肝菌均来源于内蒙古农业大学经筛选保存的菌种。
用法用量：该制备方法制得的真菌菌剂针对树龄大小施用，按300g-500g/棵穴施或者沟施，尽量靠近树根施用。
本发明制备的菌剂按照3g菌剂/kg土样的用量在烟台地区选择高铬、高铅的土壤进行实验，以柳树苗为实验对象，实验效果如下表所示：
表1对高铬土壤作用的影响
表2对高铅土壤作用的影响
实施例2：
该改善土壤重金属污染的真菌菌剂的制备方法，采用如下操作步骤：
(1)分别挑取褐环乳牛肝菌、美味牛肝菌及红绒盖牛肝菌的斜面菌种的边缘菌丝接种于PDA固体培养基中，28℃条件下暗培养48h，得活化菌种；
(2)取步骤(1)经活化培养的各菌种的菌丝体培养基，分别切成2cm菌丝体小块，备用；
(3)在无菌条件下,将步骤(2)得到的褐环乳牛肝菌菌丝体小块转接到褐环乳牛肝菌液体培养基中，26℃条件下摇床120r/min振荡暗培养6d，得褐环乳牛肝菌种子液；
在无菌条件下，将步骤(2)得到的红绒盖牛肝菌菌丝体小块转接到红绒盖牛肝菌液体培养基中，28℃条件下摇床120r/min振荡暗培养6d，得红绒盖牛肝菌种子液；
在无菌条件下，将步骤(2)得到的美味牛肝菌菌丝体小块转接到美味牛肝菌液体培养基中，24℃条件下摇床160r/min振荡暗培养6d，得美味牛肝菌种子液；
(4)将菌剂承载物：玉米芯200g、麸皮50g、棉籽壳100g、壳聚糖25g、木屑50g依次投入到混合搅拌机中，充分混合，混匀后经粉碎机粉碎过筛，得1mm粉末，再经120℃高温灭菌30min，得混合菌剂承载物，备用；
(5)按与无菌水重量比为12:25的比例，将步骤(4)灭菌的混合菌剂承载物和无菌水加入到发酵罐中，得混合培养基；
(6)按照均占混合培养基重量5％的接种量，分别将三种菌的种子液接种到步骤(5)的发酵培养基中，在26℃条件下搅拌暗培养6天，得发酵菌液；
(7)将步骤(6)的发酵菌液过滤，得含有菌丝体的滤饼，经干燥降低水分至8％，粉碎滤饼至60目，分装即得。
步骤(1)的PDA固体培养基为：马铃薯汁1000mL、葡萄糖20g、琼脂18-20g。
步骤(3)的褐环乳牛肝菌液体培养基为：葡萄糖20g/L、麦芽汁10mL/L、酵母膏6g/L、磷酸二氢钾0.25g/L、硫酸镁0.3g/L、氯化钙0.19g/L、柠檬酸0.1g/L、氯化铁0.15g/L、VB12mg/L，自然pH值：
步骤(3)的红绒盖牛肝菌液体培养基为：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L、VB1 10mg/L，自然pH值；
步骤(3)的美味牛肝菌液体培养基为：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、麸皮100g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸镁3g/L、VB115mg/L，自然pH值。
以上褐环乳牛肝菌、美味牛肝菌和红绒盖牛肝菌均来源于内蒙古农业大学经筛选保存的菌种。
用法用量同实施例1。
本发明制备的菌剂按照4g菌剂/kg土样的用量在烟台地区选择高铬、高铅的土壤进行实验，以柳树苗为实验对象，实验效果如下表所示：
表3对高铬土壤作用的影响
表4对高铅土壤作用的影响
实施例3：
该改善土壤重金属污染的真菌菌剂的制备方法，采用如下操作步骤：
(1)分别挑取褐环乳牛肝菌、美味牛肝菌及红绒盖牛肝菌的斜面菌种的边缘菌丝接种于PDA固体培养基中，28℃条件下暗培养48h，得活化菌种；
(2)取步骤(1)经活化培养的各菌种的菌丝体培养基，分别切成1cm菌丝体小块，备用；
(3)在无菌条件下,将步骤(2)得到的褐环乳牛肝菌菌丝体小块转接到褐环乳牛肝菌液体培养基中，30℃条件下摇床120r/min振荡暗培养5d，得褐环乳牛肝菌种子液；
在无菌条件下,将步骤(2)得到的红绒盖牛肝菌菌丝体小块转接到红绒盖牛肝菌液体培养基中，32℃条件下摇床120r/min振荡暗培养5d，得红绒盖牛肝菌种子液；
在无菌条件下,将步骤(2)得到的美味牛肝菌菌丝体小块转接到美味牛肝菌液体培养基中，28℃条件下摇床180r/min振荡暗培养5d，得美味牛肝菌种子液；
(4)将菌剂承载物：玉米芯300g、麸皮150g、棉籽壳75g、壳聚糖50g、木屑150g依次投入到混合搅拌机中，充分混合，混匀后经粉碎机粉碎过筛，得0.8mm粉末，再经120℃高温灭菌30min，得混合菌剂承载物，备用；
(5)按与无菌水重量比为10:25的比例，将步骤(4)灭菌的混合菌剂承载物和无菌水加入到发酵罐中，得混合培养基；
(6)按照均占发酵培养基重量5％的接种量，分别将三种菌的种子液接种到步骤(5)的混合培养基中，在30℃条件下搅拌暗培养8天，得发酵菌液；
(7)将步骤(6)的发酵菌液过滤，得含有菌丝体的滤饼，经干燥降低水分至10％，粉碎滤饼至100目，分装即得。
步骤(1)的PDA固体培养基为：马铃薯汁1000mL、葡萄糖20g、琼脂18-20g。
步骤(3)的褐环乳牛肝菌液体培养基为：葡萄糖20g/L、麦芽汁10mL/L、酵母膏6g/L、磷酸二氢钾0.25g/L、硫酸镁0.3g/L、氯化钙0.19g/L、柠檬酸0.1g/L、氯化铁0.15g/L、VB12mg/L，自然pH值：
步骤(3)的红绒盖牛肝菌液体培养基为：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L、VB1 10mg/L，自然pH值；
步骤(3)的美味牛肝菌液体培养基为：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、麸皮100g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸镁3g/L、VB115mg/L，自然pH值。
以上褐环乳牛肝菌、美味牛肝菌和红绒盖牛肝菌均来源于内蒙古农业大学经筛选保存的菌种。
用法用量同实施例1。
本发明制备的菌剂按照5g菌剂/kg土样的用量在烟台地区选择高铬、高铅的土壤进行实验，以柳树苗为实验对象，实验效果如下表所示：
表5对高铬土壤作用的影响
表6对高铅土壤作用的影响