本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及肿瘤抑制蛋白变体。
背景技术：
SFRP，分泌型Frz相关蛋白(secreted frizzled-related proteins)，含有一个富含半胱氨酸的结构域(cysteine rich domain，CRD)，但缺少七次跨膜域，它可能与卷曲蛋白(frizzled，Frz)竞争结合Wnt蛋白，从而抑制Wnt蛋白的过量表达。Wnt是一类分泌型糖蛋白，对人体正常细胞增殖起调整促进作用。近期实验发现，抑制这种蛋白质作用的基因SFRP发生异常时，Wnt蛋白质的机能会随之出现异常，使得癌细胞不断增殖，导致发生大肠癌。当把正常的SFRP基因注入癌细胞后，就会控制癌细胞增殖和杀死癌细胞。研究表明，90％的大肠癌患者与SFRP基因异常有关。
在现有技术中，为了提高蛋白的活性，针对蛋白的活性位点进行特异性的突变和取代，从而寻找活性更高的变体是常规的做法。为了进一步提高该蛋白的生物活性，申请人通过大量的实验，针对SFRP1氨基酸序列中特定的位点进行了点突变，从而获得了比SFRP1蛋白本身具有更高抑制活性的变体。
发明详述
本发明涉及亲本蛋白的分离的变体，其在至少一个对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置34Y、39F、42D、50R、58C、63A、89E、100L、122L、137R、151W、174A、198I、220N、242D、271M、286K或293E的位置包含修饰。具体而言，本发明的变体具有改善的抑制活性。
优选地，应用于本发明的方法、呈现改善的抑制活性的蛋白变体为以下任一修饰：34Y/A、39F/D、42D/R、50R/S、58C/G、63A/H、89E/A、100L/D、122L/R、137R/S、151W/G、174A/R、198I/A、220N/S、242D/G、271M/D、286K/R或293E/L。
本发明还涉及产生本发明的蛋白变体的方法，包括(a)培养宿主细胞；和(b)回收所述蛋白变体。
在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。
本发明的多肽用于制备相应的药物，去用于治疗癌症。
具体实施方式
1.SFRP1基因的获得
PCR扩增SFRP1的ORF区共314个氨基酸，模板为含有人类基因组的样本。两端引入酶切位点BamHI和EcoRI，酶切后与用同样的酶消化的pET载体连接，转化大肠杆菌后挑单克隆，测序。测得其氨基酸序列如序列1所示。
所用的引物序列如下，SFRP1的引物为(不去除终止密码不含his-myc)：
Sfrpl 3.1B(-)：F：5’-CGGGATCCATGGGCATCGGG-3’：
R：5’-CGGAATTCCGTCACTTAAACACGGACT-3’。
2.SFRP1变体的构建
突变点的引入
(1)根据相应的突变位点设计相应的诱变引物，采用PCR定点突变法在SFRP1基因上把野生型对应的氨基酸位点进行突变；
(2)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶进行酶切，与经过相同酶切的质粒PCDNA3.1片段连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；
3.2.鉴定重组质粒：用酶切、PCR方法对重组质粒进行鉴定，并测序检验，由此得到突变后的核苷酸序列。
4.PCDNA3.1-SFRP1变体质粒构建
将第二步构建获得的SFRP1变体基因的两端引入酶切位点BamHI和EcoRI，酶切后与用同样的酶消化的PCDNA3.1连接，鉴定后，将质粒转染细胞株：7721肝癌细胞，检验SFRP1变体能的抑制肝癌细胞生长的效果。具体结果如下：
表1 SFRP1变体过表达抑制细胞生长情况
通过上述结果可以看出，一些突变体对肝癌细胞生长的抑制活性相对于野生型SFRP1蛋白有了大幅度的提高，可以进一步应用于肝癌治疗。
序列表
<110>李露青
〈120〉人SFRP1变体及其应用
〈160〉1
〈210〉1
〈211〉314
〈212〉PRT
〈213〉智人(Homo sapiens)
〈400〉1
1 MGIGRSEGGR RGAALGVLLA LGAALLAVGS ASEYDYVSFQ SDIGPYQSGR
51 FYTKPPQCVD IPADLRLCHN VGYKKMVLPN LLEHETMAEV KQQASSWVPL
101 LNKNCHAGTQ VFLCSLFAPV CLDRPIYPCR WLCEAVRDSC EPVMQFFGFY
151 WPEMLKCDKF PEGDVCIAMT PPNATEASKP QGTTVCPPCD NELKSEAIIE
201 HLCASEFALR MKIKEVKKEN GDKKIVPKKK KPLKLGPIKK KDLKKLVLYL
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