一种基于微结构的细胞捕获芯片及制备方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于微结构的细胞捕获芯片及制备方法和应用。

背景技术：

进入21世纪，癌症已经成为影响人类健康的头号大敌，因为，它是目前最常见的致死因素。通常，这些疾病在早期时，大多无明显症状，难以发现，而等到身体已经出现明显不适再进行检查，往往癌症已经发展到了中晚期，这时已经错过了最佳治疗时机，基本上已经不可能完全治愈。研究表明,人体外周血液中癌症细胞的数量、种类和特性可以作为癌症的重要标志物,如果能够快速捕获血液中癌症细胞意味着有希望在早期发现癌症并改变护理治疗。目前,常见癌症检测的方法是X光、B超和CT等，还有就是直接手术或是做病变组织的穿刺活检，但很难进行早期诊断，且对人体有较大伤害。

近些年发展起来的微流控技术或芯片实验室技术为细胞操控及分析提供了新的发展思路。基于微尺度下不同的物理化学原理，科学家已发展出具有各种功能和不同应用的微流控细胞芯片。作为细胞后续分析及研究的基本前提，细胞的分离和捕获，尤其是单细胞尺度上，几乎在所有微流控细胞分析装置中都是重要一环。目前，用于芯片上细胞分离和捕获的手段涉及光、电、声、磁、流体力学、机械加工以及化学方法等众多领域。光学手段是激光光镊技术与芯片技术的结合，利用了多数芯片如玻璃、PDMS及其他高分子材料的透明特性，它可实现单细胞捕获和操控，但其涉及仪器复杂，操控单一，限制较多。电学方法是与微流控芯片最成功的结合手段，不仅有利于仪器集成，且有多种作用方式，如电渗、电泳、介电电泳(nDEP,pDEP)等方式，不仅可进行群体细胞的捕获和分离，还可实现单细胞捕获。但是这种方式往往需要在芯片上集成精细电极，需要复杂的电源控制；另外，电压对细胞活性及溶液体系都有不利的影响。声学和磁学是新兴的非接触式细胞控制手段，但其控制效果有限，很难实现单细胞捕获和操控。微机械加工技术结合流体力学控制用于整体及单个细胞样本的捕获是目前最有效的细胞固定方式。这种技术往往通过加工尺寸与细胞相匹配的微井、微孔、微坝、微狭缝及微管道等几何陷阱或障碍来捕获细胞，不仅可形成开放阵列体系，还可以在微通道中实现对细胞的控制。这种方法无需其他控制手段和仪器，对细胞无损伤，可兼容其他分析或控制方法，可在单细胞尺度上研究其刺激响应、相互作用以及迁移、分化、凋亡等生理过程，尤其适用于对悬浮细胞进行研究。其缺点是对微加工技术要求较高，在普通化学实验室中难以实现。

因此，探寻一种简单通用的，采用常规加工手段即可实现的芯片制作方法，及在普通实验室中即可实现的高效率、高分辨率的细胞捕获方法具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于避免昂贵设备及精细未加工手段的使用，而提供一种制作简单的、高效通用的微流控细胞捕获方法，用于拓展普通实验室中对细胞进行研究的有效手段。

一种基于微结构的细胞捕获芯片，由双层结构组成包括：上层液路通道结构和下层捕获微通道结构，上层液路通道结构包括细胞溶液入口、细胞溶液出口和液体通道；下层捕获微通道结构上设置有细胞捕获组件，其有不同尺寸及形状的微型通道沿边缘相互平行交错组成，液体通道中部与细胞捕获组件通过对准键合方法形成10±5μm的单个或多个封闭微结构，该微结构用于阻挡细胞形成对有限数量细胞的可控捕获。

上述的基于微结构的细胞捕获芯片，所述的通道微结构可以通过通道光刻胶两次曝光的方法及对准键合方法制得。

上述的基于微结构的细胞捕获芯片，所述的通道微结构长度及数量可以通过不同、通道组合和对准方法进行调控。

上述的基于微结构的细胞捕获芯片，可通过调整微结构的长度和大小对捕获细胞的数量进行控制，可形成从单个细胞到几十个细胞的有效捕获。

上述的基于微结构的细胞捕获芯片，可利用流体动力学原理对细胞进行捕获，并可在捕获后通过调整流体方向控制捕获细胞的释放操作。

一种基于微结构的细胞捕获芯片的制备方法，它包括下列步骤：

步骤1.上层液路通道结构制作：玻璃芯片通道采用标准光刻和化学湿法刻蚀技术制备。采用商品化匀胶铬板，根据通道设计图案进行光刻，蚀刻深度为30-50μm；

步骤2.下层捕获微通道结构制作：首先制作细胞捕获组件阳性模板，在需要制作细胞捕获微结构的衬底硅片上涂敷光刻胶层SU-8，并且对光刻胶层进行加热固胶，采用第一图形对光刻胶层进行第一次曝光，使对应区域内的光刻胶层的厚度为h1,h1厚度为8-15μm；对带有第一图形结构的光刻胶进行后烘并涂敷第二层光刻胶层SU-8，加热固胶后采用第二图形对光刻胶层进行第二次曝光，使对应区域内的光刻胶层的厚度为h2,h2厚度为15-30μm；最后，将两次曝光作业后的光刻胶执行显影，保留第一图形(a)和第二图形(b)重叠部分。以上述光刻胶为阳性模板，在其上浇铸一定量PDMS，加热固化，剥离后即得具有相应阳模结构的基体细胞捕获组件。

步骤3.双层结构制作与芯片键合：将制作好相应通道的前述玻璃芯片与PDMS芯片同时经等离子体处理，迅速在其上滴加数滴甲醇，然后将上片盖在下片上，此时由于甲醇的存在，两片芯片可相互顺利滑动，将两层上的微通道平行对准，用滤纸吸去大部分多余水分，保持上下两层芯片位置并置于烘箱中80℃烘干，约30min后即可键合稳固而得到细胞捕获芯片，微结构长度可根据对准管道部分进行调整，上片需预留上下两层通道的出入口以进行进样操作和压力调整。

上述的制作双层结构细胞捕获芯片的方法，所述的步骤2可以进行微结构尺寸调控：可采用第二图形不同尺寸微通道进行组合形成不同尺寸的狭缝，用于调控捕获细胞的大小和数量。

本发明的双层细胞捕获芯片可方便地对单个及多个细胞进行捕获和释放，其步骤为：

在上层通道入口处注入细胞悬液，由于液体静压力的差别，细胞跟随溶液流向出口并向下层管道形成分流，受微结构阻挡，细胞沿流动方向不断在微结构上排列聚集形成捕获，多余细胞随悬液从出口排出；保持压力作用，还可对捕获细胞进行清洗等操作。

将样品溶液自入口吸出，在上层通道出口注入缓冲溶液，使液体压力反向，即使溶液反向流过微结构，可释放捕获的细胞，并从上层通道入口排出，从而可对细胞进行释放。

本发明高效稀有细胞捕获芯片在用于捕获稀有细胞的应用方法，芯片包括一个基体和一个与基体平面吻合并密封固定连接的基片，方法包括下述步骤：

步骤1.高温灭菌：将制作好的细胞捕获集成芯片用紫外线光进行灭菌；

步骤2.表面修饰：在常温下将1-10％牛血清白蛋白溶液注入芯片中,修饰1小时后,用去离子水冲洗3次；

步骤3.细胞捕获：将含有细胞悬液以0.5微升/分钟通入样品通道；

步骤4.细胞固定：待进样5-10分钟后,停止进样,用一定浓度的多聚甲醛溶液注入芯片中将捕获在细胞捕获组件上的细胞固定；

步骤5.细胞染色：在上述步骤4完成后，对细胞进行染色；所述染色为免疫荧光染色；

步骤6.检测与分析：用荧光显微镜表征细胞捕获组件上捕获并分析捕获的悬浮细胞。

本发明的芯片适用于血液中循环肿瘤细胞的捕获、体外早期诊断、化疗药物评估、个体化治疗、肿瘤复发监测及肿瘤药物的开发等。

本发明的具体效果如下：本发明方法通过简单的芯片制作，利用光刻胶两次曝光和微通道对准键合方法制作可用于少量细胞捕获的微结构。与传统的利用流体动力原理和微结构的芯片上细胞捕获技术相比，该发明具有以下优点：1、制作方法简单、可靠，成本低廉，使用玻璃及PDMS材质，采用甲醇润滑键合方法，不需过多修饰步骤；2、无需超净室，无需精密微加工仪器及手段，仅利用传统刻蚀方法即可形成适用于细胞尺寸的微结构，普通化学实验室中即可实现，便于普及；3、该方法制得结构可方便调整，实现从单个细胞到数十个细胞的捕获和排列，捕获效率高，控制简便；4、该芯片为软质芯片，同时PDMS材质使得后续修饰及集成操作简单可行，还可制作集成微电极用于对细胞进行实时监控和分析检测。

附图说明

图1.细胞捕获芯片制作示意图；

图2.细胞捕获芯片最终结构示意图；(a)第一图形阳性模板；(b)第二图形阳性模板；(h1)第一图形阳性模板高度；(h2)第二图形阳性模板高度；

图3.为本发明微流控细胞捕获芯片平面结构示意图；a上层液路通道结构图：1细胞溶液入口，2细胞溶液出口，3液体通道；b下层捕获微通道结构图：4细胞捕获结构组件；c各层组合位置效果图；

图4双层结构细胞捕获芯片制作示意图。(a)下层细胞捕获微通道；(b)上层液体流动微通道；(1)细胞溶液入口；(2)细胞溶液出口；

图5乳腺癌MCF-7荧光表型鉴定结果图谱。荧光鉴定结果为EpCAM阳性，DAPI阳性，CD45阴性的即为CTCs。

具体实施方式

下面结合附图和实例对本发明作进一步说明。

实验过程中使用的水均为二次蒸馏水，实验所用试剂包括磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钾，氯化钠，甲醇等均为分析纯。所用细胞为人乳腺胃癌细胞株(MCF-7)。

一种基于微结构的细胞捕获芯片，如图2、图3所示；由双层结构组成包括：上层液路通道结构和下层捕获微通道结构。其中，上层液路通道结构包括细胞溶液入口1、细胞溶液出口2和液体通道3；下层捕获微通道结构上设置有细胞捕获组件4。两层结构部分有不同尺寸及形状的微型通道沿边缘相互平行交错组成，液体通道中部与细胞捕获组件通过对准键合方法形成10±5μm的单个或多个封闭微结构，该微结构用于阻挡细胞形成对有限数量细胞的可控捕获。

实施例1

双层结构细胞捕获芯片的制作如图1图4所示，包括如下步骤

步骤1.上层液路通道结构：玻璃芯片通道采用标准光刻和化学湿法刻蚀技术制备。采用商品化匀胶铬板，根据通道设计图案进行光刻，蚀刻深度为30-50μm；

步骤2.下层捕获微通道结构制作：首先制作细胞捕获组件阳性模板，在需要制作细胞捕获微结构的衬底硅片上涂敷光刻胶层SU-8，并且对光刻胶层进行加热固胶，采用第一图形(1)对光刻胶层进行第一次曝光，使对应区域内的光刻胶层的厚度为h1,h1厚度为8-15μm；对带有第一图形结构的光刻胶进行后烘并涂敷第二层光刻胶层SU-8，加热固胶后采用第二图形(2)对光刻胶层进行第二次曝光，使对应区域内的光刻胶层的厚度为h2,h1厚度为15-30μm；最后，将两次曝光作业后的光刻胶执行显影，保留第一图形和第二图形重叠部分。以上述光刻胶为阳性模板，在其上浇铸一定量PDMS，加热固化，剥离后即得具有相应阳模结构的基体细胞捕获组件。

步骤3.双层结构制作与芯片键合：将制作好相应通道的前述玻璃芯片(b)与PDMS芯片(a)同时经等离子体处理，迅速在其上滴加数滴甲醇，然后将上片盖在下片上，此时由于甲醇的存在，两片芯片可相互顺利滑动，将两层上的微通道平行对准，用滤纸吸去大部分多余水分，保持上下两层芯片位置并置于烘箱中80℃烘干，约30min后即可键合稳固而得到细胞捕获芯片(c)，微结构长度可根据对准管道部分进行调整，上片需预留上下两层通道的出入口以进行进样操作和压力调整。

上述的制作双层结构细胞捕获芯片的方法，所述的步骤2可以进行微结构尺寸调控：可采用第二图形不同尺寸微通道进行组合形成不同尺寸的狭缝，用于调控捕获细胞的大小和数量。

实施例2

采用双层结构细胞捕获芯片，对人乳腺癌细胞MCF-7细胞的捕获和释放：

在上层通道入口处注入细胞悬液，由于液体静压力的差别，细胞跟随溶液流向出口并向下层管道形成分流，受微结构阻挡，细胞沿流动方向不断在微结构上排列聚集形成捕获，多余细胞随悬液从出口排出；保持压力作用，还可对捕获细胞进行清洗等操作。

将样品溶液自入口吸出，在上层通道出口注入缓冲溶液，使液体压力反向，即使溶液反向流过微结构，可释放捕获的细胞，并从上层通道入口排出，从而可对细胞进行释放。

实施例3

采用双层结构细胞捕获芯片，对实施例2捕获的人乳腺癌细胞MCF-7细胞进行免疫荧光鉴定:

步骤1.细胞固定：待进样5-10分钟后,停止进样,用一定浓度的多聚甲醛溶液注入芯片中将捕获在细胞捕获组件上的细胞固定；

步骤2.细胞染色：在上述步骤2完成后，对细胞进行染色。所述染色为免疫荧光染色，免疫荧光染色抗体包括EpCAM-FITC,CD45-PE,DAPI。

步骤3.检测与分析：用荧光显微镜表征细胞捕获组件上捕获悬浮细胞。

如图5所示，捕获后细胞经过固定和免疫荧光抗体EpCAM，CD45和核染料4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色后鉴定，EpCAM阳性，DAPI阳性，CD45阴性的即为CTCs。