一种高通量自动捕获单细胞的微流控芯片及其制备方法与流程

本发明属于微流控技术和聚合物芯片的加工、制作等领域，具体涉及一种高通量自动捕获单细胞的微流控芯片及其制备方法。

背景技术：

微流控芯片实验室是把化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测及细胞培养、分离、分裂等基本操作单元集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规化学和生物实验室的各种功能的一种技术平台。微流控芯片的基本特征和最大优势是多种单元技术在整体可控的微小平台上灵活组合、规模集成。高通量是规模集成的一种形式，只是被集成的操作单元或单元群是相同的。

近几年的生物学和医学研究发现，针对单个细胞的细胞生物学研究有着重要的意义。同一种细胞，不同细胞个体之间也可能有很大的差异，而变异最显著的细胞往往能够揭示重要生物学现象或者提示重大疾病的发生，揭示癌症发病机制，懂得细胞分化与组织发育原理，识别基因表达特性与细胞特征。因此，准确捕获差异显著的单细胞群体并进行精确鉴定是生物医学研究中急需的关键技术。

近年来，随着微流控技术的迅速发展，为人们提供了一种操纵微米尺度流体的方法。同时微加工技术的发展也提供了制造与细胞尺度相似的微结构的方法，其在单细胞分析中的应用引起了越来越多的关注。芯片上的细胞单元作为单细胞微反应器，能够有效控制扩散，提高检测灵敏度，已被成功应用于多种单细胞分析中。此外，从大量的样本(例如血液)中准确捕获特定细胞并对其进行鉴定鉴定，也是传统技术(如流式细胞仪)难以实现的。

本发明利用微流控和聚合物芯片的加工、制作技术制备了一种高通量自动捕获单细胞的微流控芯片，整个装置结构简单，无需任何复杂和昂贵的设备，可实现高通量，操作方便自动化，可长期捕获悬浮培养单细胞、减少细胞损伤且便于加入药物刺激。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高通量自动捕获单细胞的微流控芯片及其制备方法，以解决以往单细胞捕获过程中存在的操作步骤繁琐复杂、容易造成细胞损伤、捕获效率低等局限，本发明制备过程稳定，操作简单，集成度高、可实现自动化。

一种高通量自动捕获单细胞的微流控芯片，所述芯片由两层组成，上层为流路出入口层；下层为流路控制层；

所述流路出入口层有液体流路通道入口和液体流路通道出口；

所述流路控制层由单细胞捕获流路通道、气路通道、液滴生成单元(单细胞捕获阱)组成；

所述单细胞捕获流路通道是一条由多个交互连接的U型通道构成的长通道，长通道两端分别连接液体流路通道入口和液体流路通道出口，每个U型通道的直通道均有与之平行的气体流路通道，每个U型通道的直通道上分布着数个圆柱形凹陷小坑结构的液滴生成单元。

所述芯片抽真空后，气路通道处于负压状态，由于PDMS的透气性，气路带动周围的液路通道形成负压，可自动将单细胞悬液从液路通道入口吸入，用于单细胞进液和捕获。

所述单细胞捕获流路通道宽100～300μm，U型通道的直通道长为40～50mm，直通道间距为0.5～1mm。

所述气路通道宽为200～500μm，长为40～50mm，间距为0.5～1mm。

所述单细胞捕获流路通道与气路通道间距为0.5～1.5mm。

所述液滴生成单元为圆柱形凹陷小坑结构，共有6000～10000个，小坑直径为15～45μm，高80～200μm，小坑间距80～150μm。

一种高通量自动捕获单细胞的微流控芯片的制备方法，所述芯片制备步骤如下：

(1)采用光刻和腐蚀方法制备出通道部分突起的SU-8模板：所述SU-8模板由双层结构组成，第一层由单细胞捕获流路通道和气路通道组成，第二层由液滴生成单元组成；SU-8模板的制备经过两次甩胶、前烘、曝光、后烘后，一次显影、坚膜得到；

(2)基于SU-8模板制得得的PDMS模块：将PDMS与引发剂以体积比10：1混合均匀，浇注于SU-8模板，75～85℃烘箱固化30～60min，将PDMS与SU-8模板剥离，得到带有结构的上层芯片；将上层芯片与带有流路出入口的下层芯片经过等离子体处理1～4min后封接。

一种高通量自动捕获单细胞的微流控芯片的应用，所述微流控芯片可用作高通量自动单细胞捕获，可进行单细胞原位培养、给药、增殖、诱导分化等研究。

所述微流控芯片可作为高通量自动单细胞捕获，可进行单细胞原位培养、给药、增殖、诱导分化等研究。

本发明的优点在于：

1、操作简便、快捷；

2、细胞与试剂用量少，实验成本低廉；

3、高度集成化、自动化；

4、应用范围广泛；

附图说明

图1：芯片结构示意图；(a)整体结构图，(b)为局部放大图；

图2：微流控芯片侧面局部放大图。

其中：1为液体流路通道入口，2为液体流路通道出口，3为单细胞捕获流路通道，4为气体流路通道，5为液滴生成单元(单细胞捕获阱)，6为单细胞；

图3：微流控芯片实物图。

具体实施方式

一种高通量自动捕获单细胞的微流控芯片，如图1、图2、图3所示；所述芯片由两层组成，上层为流路出入口层；下层为流路控制层；

所述流路出入口层有液体流路通道入口1和液体流路通道出口2；

所述流路控制层由单细胞捕获流路通道3、气路通道4、液滴生成单元(单细胞捕获阱)5组成；

所述单细胞捕获流路通道3是一条由多个交互连接的U型通道构成的长通道，长通道两端分别连接液体流路通道入口1和液体流路通道出口2，每个U型通道的直通道均有与之平行的气体流路通道4，每个U型通道的直通道上分布着数个圆柱形凹陷小坑结构的液滴生成单元5。

所述单细胞捕获流路通道宽100～300μm，U型通道的直通道长为40～50mm，直通道间距为0.5～1mm。

所述气路通道宽为200～500μm，长为40～50mm，间距为0.5～1mm。

所述单细胞捕获流路通道与气路通道间距为0.5～1.5mm。

所述液滴生成单元为圆柱形凹陷小坑结构，共有6000～10000个，小坑直径为15～45μm，高80～200μm，小坑间距80～150μm。

当芯片抽真空后，气体流路通道4处于负压状态，由于PDMS的透气性，气路带动周围的液体流路通道3形成负压，MCF-7单细胞悬液6在负压作用下经通道入口1进入单细胞捕获流路通道3，通过液滴生成单元5后，单细胞6截留于生成的液滴中，剩余单细胞悬液经通道入口2流出，实现单细胞自动捕获。实施例1

高通量自动捕获单细胞的微流控芯片SU-8模板的制备

微流控芯片采用光刻和腐蚀方法制备出通道部分突起的SU-8模板；首先，第一层甩SU-8胶厚度为100μm，95℃前烘20min，自然降温，将掩膜置于SU-8胶平板上面，紫外曝光30s，95℃后烘20min，自然降温；其次，基于第一层SU-8胶的基础，第二层甩SU-8胶厚度为150μm，95℃前烘30min，自然降温，将掩膜置于SU-8胶平板上面，紫外曝光40s，95℃后烘40min，自然降温；最后，采用乳酸乙酯将上述SU-8胶显影10min，180℃坚膜2h，自然降温备用。实施例2

高通量自动捕获单细胞的PDMS芯片的制备

将PDMS与引发剂以体积比10：1混合均匀，浇注于前期制备的SU-8模板，80℃烘箱固化30min，将PDMS与SU-8模板剥离，得到带有结构的微流控芯片(1)；将PDMS与引发剂以体积比10：1混合均匀，浇注于空白玻璃板，80℃烘箱固化30min，将PDMS与SU-8模板剥离，得到空白PDMS芯片(2)；用打孔器在芯片(2)上打两个孔，分别对应流路出入口，将芯片1与芯片2经过等离子体处理120s后封接备用。