本发明涉及一种水凝胶，特别涉及一种3D水凝胶的制备及在细胞组织培养中的应用。
背景技术：
水凝胶具有可溶胀的三维网络结构，在水中能够吸收大量的水分，并能继续保持其原有结构而不被溶解。由于具有较高的含水量和柔软度，水凝胶与其他生物材料相比，可以更逼真的模拟体内组织。水凝胶作为生物材料的一种，必须满足高纯度、无毒、无刺激性。无免疫反应，能与组织相容等特点。基于多糖制备的水凝胶已经在食品、药物递送和组织工程学领域广泛使用。多糖水凝胶的形成是一个复杂的过程，其中物理交联是由聚合物分子通过分子间的非共价相互作用(如氢键作用、疏水作用、静电作用、π-π堆积作用)在水溶液中自聚集形成的。大多数天然多糖凝胶是依靠高分子链段间的氢键形成三维结构，但氢键受热会被破会，使凝胶变成溶胶。电荷交联是带不同电荷的高分子材料相互作用形成凝胶，但这种交联方式在pH或离子强度等破坏下，都会是凝胶转变成溶胶。
因此，需要构建一种物理交联的、制备方法简单的、稳定的水凝胶。通过平衡疏水与亲水作用力，使聚合物链有规则的组装可以实现多糖的物理凝胶化，该制备过程简单，制得的水凝胶可以高温湿热灭菌。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种3D水凝胶的制备及在细胞组织培养中的应用，本发明制备的3D水凝胶是通过物理作用形成，胶凝过程简单，可用于细胞培养使用。
本发明是这样实现的：一种3D水凝胶的制备方法，包括如下的步骤：
(1)、配制质量体积比为20％的泊洛萨姆188溶液，然后将配置好的溶液在25-30℃条件及80-100rpm/min速度下搅拌至完全溶解；
(2)、配制质量体积比为10％的壳聚糖溶液，将配置好的溶液在25-30℃条件及80-100rpm/min速度下搅拌均匀，然后加入质量体积比为2％的氢氧化钠搅拌至完全溶解；
(3)、将步骤(2)制备的溶液在搅拌条件下加入到步骤(1)制备的溶液中，缓慢搅拌混合均匀后将溶液放置在真空烘箱中，在50-60℃条件下干燥1-3小时去除部分水分，制备得3D水凝胶。
进一步优化方案为：所述壳聚糖分子量(Mw)是10000±250g/mol，乙酰度1.3±0.1％。
进一步优化方案为：所述步骤(1)中溶解后制备的溶液粘度为54-60cps
进一步优化方案为：所述步骤(3)中缓慢搅拌的速度为6-12rpm/min。
进一步优化方案为：所述步骤(3)中缓慢搅拌的时间为10-20min。
进一步优化方案为：所述步骤(3)中干燥去除5-10％水分。
一种3D水凝胶在细胞组织培养中的应用，上述制备的3D水凝胶可用于细胞组织培养。上述制备的3D水凝胶可用于小鼠间充质干细胞组织，小鼠间充质干细胞在3D水凝胶的水层中显示出很强的增殖效果。
本发明制备的3D水凝胶的制备方法具有如下优点：本发明通过混合高分子材料的使用、可控的物理凝胶方法，制备一种3D水凝胶，凝胶中的多孔结构可以用于细胞培养。本发明制备方法简单，制备的水凝胶稳定，制得的水凝胶可以高温湿热灭菌。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明进行详细的说明。
(一)具体实施方式如下：
一种3D水凝胶的制备方法，包括如下的步骤：
(1)、配制质量体积比为20％的泊洛萨姆188溶液，然后将配置好的溶液在25-30℃条件及80-100rpm/min速度下搅拌至完全溶解；
(2)、配制质量体积比为10％的壳聚糖溶液，将配置好的溶液在25-30℃条件及80-100rpm/min速度下搅拌均匀，然后加入质量体积比为2％的氢氧化钠搅拌至完全溶解；
(3)、将步骤(2)制备的溶液在搅拌条件下加入到步骤(1)制备的溶液中，缓慢搅拌混合均匀后将溶液放置在真空烘箱中，在50-60℃条件下干燥1-3小时去除部分水分，制备得3D水凝胶。
进一步优化方案为：所述壳聚糖分子量(Mw)是10000±250g/mol，乙酰度1.3±0.1％。
进一步优化方案为：所述步骤(1)中溶解后制备的溶液粘度为54-60cps
进一步优化方案为：所述步骤(3)中缓慢搅拌的速度为6-12rpm/min。
进一步优化方案为：所述步骤(3)中缓慢搅拌的时间为10-20min。
进一步优化方案为：所述步骤(3)中干燥去除5-10％水分。
一种3D水凝胶在细胞组织培养中的应用，上述制备的3D水凝胶可用于细胞组织培养。上述制备的3D水凝胶可用于小鼠间充质干细胞组织，小鼠间充质干细胞在3D水凝胶的水层中显示出很强的增殖效果。
(二)实施例如下：
实施例1：一种3D水凝胶的制备方法，将2g泊洛萨姆188分散在10ml水中，在25℃条件下搅拌至完全溶解，测定粘度为60cps。将1g壳聚糖分散至10mL水中搅拌均匀，然后加入0.2g氢氧化钠搅拌至全部溶解。将上述制备的壳聚糖溶液在搅拌下加入到上述制备的泊洛萨姆溶液中，在6rpm/min速度下缓慢搅拌10min混合均匀后，将混合后的溶液放置在真空烘箱中，55℃除去水分，减重7％，停止干燥，得凝胶。
实施例2：一种3D水凝胶的制备方法，将2g泊洛萨姆188分散在10ml水中，在30℃条件下搅拌至完全溶解，测定粘度为55.4cps。将1g壳聚糖分散至10mL水中搅拌均匀，然后加入0.2g氢氧化钠搅拌至全部溶解。将上述制备的壳聚糖溶液在搅拌条件下加入到上述制备的泊洛萨姆溶液中，在6rpm/min速度下缓慢搅拌15min混合均匀后，将混合后的溶液放置在真空烘箱中，55℃除去水分，减重5％，停止干燥，得凝胶。
实施例3：一种3D水凝胶的制备方法，将2g泊洛萨姆188分散在10ml水中，在25℃条件下搅拌至完全溶解，测定粘度为60cps。将1g壳聚糖分散至10mL水中搅拌均匀，然后加入0.2g氢氧化钠搅拌至全部溶解。将上述制备的壳聚糖溶液搅拌下加入到上述制备的泊洛萨姆溶液中，在12rpm/min速度下缓慢搅拌10min混合均匀后，将混合后的溶液放置在真空烘箱中，55℃除去水分，减重10％，停止干燥，得凝胶。
实施例4：一种3D水凝胶的制备方法，将2g泊洛萨姆188分散在10ml水中，在28℃条件下搅拌至完全溶解，测定粘度为59.3cps。将1g壳聚糖分散至10mL水中搅拌均匀，然后加入0.2g氢氧化钠搅拌至全部溶解。将上述制备的壳聚糖溶液搅拌下加入到上述制备的泊洛萨姆溶液中，在10rpm/min速度下缓慢搅拌10min混合均匀后，将混合后的溶液放置在真空烘箱中，55℃除去水分，减重3.5％，停止干燥，得凝胶。
实施例5：一种3D水凝胶的制备方法，将2g泊洛萨姆188分散在10ml水中，在30℃条件下搅拌至完全溶解，测定粘度为56cps。将1g壳聚糖分散至10mL水中搅拌均匀，然后加入0.2g氢氧化钠搅拌至全部溶解。将上述制备的壳聚糖溶液搅拌下加入到上述制备的泊洛萨姆溶液中，在6rpm/min速度下缓慢搅拌20min混合均匀后，将混合后的溶液放置在真空烘箱中，55℃除去水分，减重2.5％，停止干燥，得凝胶。
实施例6：一种3D水凝胶的制备方法，将2g泊洛萨姆188分散在10ml水中，在30℃条件下搅拌至完全溶解，测定粘度为55.7cps。将1g壳聚糖分散至10mL水中搅拌均匀，然后加入0.2g氢氧化钠搅拌至全部溶解。将上述制备的壳聚糖溶液搅拌下加入到上述制备的泊洛萨姆溶液中，在9rpm/min速度下缓慢搅拌15min混合均匀后，将混合后的溶液放置在真空烘箱中，55℃除去水分，减重4％，停止干燥，得凝胶。
实施例7：一种3D水凝胶应用于培养细胞组织：
将水凝胶湿热灭菌除热源，放在培养基中，加入5ml L-DMEM完全培养液预培养12h。
使用注射器将小鼠骨髓间充质干细胞(MSC)，按照5×106/ml浓度,注射入3D凝胶的水层中，体积为400μL。
细胞在37℃，5％CO2条件下培养，2天后换液去除非贴壁细胞，以后每3～4天半量换液1次，培养7天后，L-DMEM完全培养液加入1×10-8mol/L地塞米松，诱导分化，继续培养45天。
小鼠间充质干细胞在3D水凝胶的水层中显示出很强的增殖效果，MSC成骨细胞诱导培养第l-3天的细胞增殖旺盛,3-5d即融合成单层。随着诱导培养时间的延长,细胞逐渐堆积并矿盐沉积,形成矿化结节。培养14d和21d后，矿化结节形成率分别为(70.5±3.5)％和(87.5±3.5)％，ALP染色阳性率分别为(41.5±1.5)％和(85.2±1.7)％。结论:骨髓MSC在本技术方案制备的3D水凝胶中可诱导分化为具有含矿化结节及ALP阳性特征的骨样细胞。
上述具体实施方式只是对本发明的技术方案进行详细解释，本发明并不只仅仅局限于上述实施例，凡是依据本发明原理的任何改进或替换，均应在本发明的保护范围之内。