本发明属于造纸废弃物领用领域,特别涉及以造纸污泥为原料制备纤维素酶。
背景技术：
造纸污泥即造纸生产过程中（包括蒸煮、洗选、打浆、漂白、抄纸）各个工段产生的污水中所沉淀下的含有泥沙、造纸填料、细小纤维等（无机的、有机的）复杂物资的综合性污泥。造纸污泥具有量大、气味恶臭、随污水流动的特点，且成分复杂，含水量高，处理难度大，一直都是造纸污水处理中令环保人士最为无奈、最为头疼的事情。长期以来，绝大部分造纸污泥随意外运、简单填埋、被弃置填坑或焚烧等，不但占用大量土地，还造成严重的二次污染以及新的环境问题，给生态环境带来了隐患。对造纸污泥的处理只有投资没有效益，严重制约了很多企业的发展。
本发明根据造纸污泥独有的特性，开发一种造纸污泥资源化利用的新技术，对该领域具有重要意义；同时以造纸污泥作为底物生产纤维素酶，降低纤维素酶的生产成本，可以解决纤维素酶由于生产成本高限制其应用的局限性问题。
技术实现要素：
发明目的：本发明的目的是以造纸污泥为原料制备纤维素酶，解决造纸污泥处理难的问题，同时降低纤维素酶的生产成本。
技术方案：一种以造纸污泥为原料制备纤维素酶的方法，包括以下步骤：
（1）造纸污泥的预处理
用清水将造纸污泥配置成质量浓度在5%～10%的泥水；利用离心机，在2000～3000 转/分的转速下，将泥水分离10～20分钟后，除去上层清液和沉淀物底层的三分之一，得到沉淀物上层的三分之二混合物，常温挤压脱水，得到含水量为40%～60%的粗污泥；
（2）碳源底物的制备
利用质量浓度为15%～25%的磷酸溶液，在55～70℃温度下，与粗污泥搅拌反应1～2小时，反应过程物料配比为磷酸溶液20～40份、粗污泥20～40份，反应完成后常温挤压脱水得到含水量40%～60%的一段污泥；
利用质量浓度为1.0%～1.5%的硫酸溶液，在微沸的条件下消煮一段污泥30～60分钟，反应过程物料配比为硫酸溶液60～90份、一段污泥10～30份，反应完成后常温挤压脱水得到含水量40%～60%的二段污泥；
利用质量浓度为1.0%～1.5%的氢氧化钠溶液，在微沸的条件下消煮二段污泥30～60分钟，反应过程物料配比为磷酸溶液60～90份、二段污泥10～30份，反应完成后常温挤压脱水得到含水量40%～60%的三段污泥；
在抽滤的条件下，利用质量浓度为5%～10%的乙醇溶液清洗三段污泥，清洗过程物料配比为乙醇溶液60～90份、三段污泥5～10份，然后用清水清洗至pH值6.0～7.0范围，清洗后烘干，得到碳源底物；
（3）纤维素酶的培养
菌种的活化：将里氏木霉菌种转移至斜面培养基，置入生化培养箱中，在26℃环境下培养7天，得到活化菌种；
其中斜面培养基为综合马铃薯培养基
种子液的培养：用接种环将活化菌种转入装有50ml种子培养基的250ml种子瓶中，置于水浴恒温摇床上，在30℃、摇床转速180 r/min的环境下培养2天，得到种子液；
其中种子培养基为葡萄糖40g/L，示蛋白胨1g/L，硫酸铵2.2g/L，尿素0.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钙0.3g/L，Mandels 微量元素1ml，并用柠檬酸缓冲液调节pH值为5.0的混合溶液
产酶培养基的配置与灭菌：将碳源底物与氮源和无机营养物按比例配置成产酶培养基，配置过程碳源底物浓度为40～60 g/L，并用柠檬酸缓冲液调节pH值为5.0后，置于121℃的高温灭菌锅中灭菌30min；
其中氮源为示蛋白胨1g/L、硫酸铵2.2g/L和尿素0.5g/L的混合物
其中无机营养物为磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.3g/L、氯化钙0.3g/L、Mandels 微量元素1ml和T-80 1mL的混合物
纤维素酶的培养：将种子液接种到装有50ml产酶培养基的250ml三角瓶内，置于摇床上，在温度28～40℃下，通气培养6～7天，得到发酵液；发酵液经抽滤除去菌体及杂质，即为纤维素酶。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。
具体实施方式一：
步骤一：造纸污泥的预处理
用清水将造纸污泥配置成质量浓度在5%的泥水；利用离心机，在3000 转/分的转速下，将泥水分离20分钟后，除去上层清液和沉淀物底层的三分之一，得到沉淀物上层的三分之二混合物，常温挤压脱水，得到含水量为40%的粗污泥；
步骤二：碳源底物的制备利用质量浓度为15%的磷酸溶液，在55℃温度下，与粗污泥搅拌反应1小时，反应过程物料配比为磷酸溶液20份、粗污泥20份，反应完成后常温挤压脱水得到含水量40%的一段污泥；
利用质量浓度为1.0%的硫酸溶液，在微沸的条件下消煮一段污泥30分钟，反应过程物料配比为硫酸60溶液份、一段污泥10份，反应完成后常温挤压脱水得到含水量40%的二段污泥；
利用质量浓度为1.0%的氢氧化钠溶液，在微沸的条件下消煮二段污泥30分钟，反应过程物料配比为磷酸溶液60份、二段污泥10份，反应完成后常温挤压脱水得到含水量40%的三段污泥；
在抽滤的条件下，利用质量浓度为5%的乙醇溶液清洗三段污泥，清洗过程物料配比为乙醇溶液60份、三段污泥5份，然后用清水清洗至pH值6.0范围，清洗后烘干，得到碳源底物；
步骤三：纤维素酶的培养
菌种的活化：将里氏木霉菌种转移至斜面培养基，置入生化培养箱中，在26℃环境下培养7天，得到活化菌种；
其中斜面培养基为综合马铃薯培养基种子液的培养：用接种环将活化菌种转入装有50ml种子培养基的250ml种子瓶中，置于水浴恒温摇床上，在30℃、摇床转速180 r/min的环境下培养2天，得到种子液；
其中种子培养基为葡萄糖40g/L，示蛋白胨1g/L，硫酸铵2.2g/L，尿素0.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钙0.3g/L，Mandels 微量元素1ml，并用柠檬酸缓冲液调节pH值为5.0的混合溶液产酶培养基的配置与灭菌：将碳源底物与氮源和无机营养物按比例配置成产酶培养基，配置过程碳源底物浓度为40g/L，并用柠檬酸缓冲液调节pH值为5.0后，置于121℃的高温灭菌锅中灭菌30min；
其中氮源为示蛋白胨1g/L、硫酸铵2.2g/L和尿素0.5g/L的混合物其中无机营养物为磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.3g/L、氯化钙0.3g/L、Mandels 微量元素1ml和T-80 1mL的混合物纤维素酶的培养：将种子液接种到装有50ml产酶培养基的250ml三角瓶内，置于摇床上，在温度28℃下，通气培养6天，得到发酵液；发酵液经抽滤除去菌体及杂质，即为纤维素酶。
具体实施方式二：具体实施方式二区别于实施方式一在于步骤一中造纸污泥质量浓度为10%，离心转速3000 转/分，离心时间20分钟。步骤二中一段污泥工艺段，磷酸溶液质量浓度为25%，反应过程物料配比为磷酸溶液40份、粗污泥40份，反应温度为70℃，反应时间为2小时；二段污泥工艺段，硫酸溶液质量浓度为1.5%，反应过程物料配比为硫酸溶液90份、一段污泥30份，反应温度为微沸，反应时间为60分钟；三段污泥工艺段，氢氧化钠溶液质量浓度为1.5%，反应过程物料配比为氢氧化钠溶液90份、二段污泥30份，反应温度为微沸，反应时间为60分钟；清洗工艺段，乙醇溶液质量浓度为10%，清洗过程物料配比为乙醇90份、三段污泥10份，然后用清水清洗至pH值7.0范围。步骤三中产酶培养基的配置时，碳源底物浓度为60 g/L；纤维素酶的培养在温度40℃下，通气培养7天。
具体实施方式三：具体实施方式三区别于实施方式一在于步骤一中造纸污泥质量浓度为7.5%，离心转速2500 转/分，离心时间15分钟。步骤二中一段污泥工艺段，磷酸溶液质量浓度为20%，反应过程物料配比为磷酸溶液30份、粗污泥30份，反应温度为62.5℃，反应时间为1.5小时；二段污泥工艺段，硫酸溶液质量浓度为1.25%，反应过程物料配比为硫酸溶液75份、一段污泥20份，反应温度为微沸，反应时间为45分钟；三段污泥工艺段，氢氧化钠溶液质量浓度为1.25%，反应过程物料配比为氢氧化钠溶液75份、二段污泥20份，反应温度为微沸，反应时间为45分钟；清洗工艺段，乙醇溶液质量浓度为7.5%，清洗过程物料配比为乙醇60～90份、三段污泥7.5份，然后用清水清洗至pH值6.5范围。步骤三中产酶培养基的配置时，碳源底物浓度为50 g/L；纤维素酶的培养在温度34℃下，通气培养6.5天。
具体实施方式四：具体实施方式四区别于实施方式一在于步骤一中造纸污泥质量浓度为6.25%，离心转速3000 转/分，离心时间12.5分钟。步骤二中一段污泥工艺段，磷酸溶液质量浓度为17.5%，反应过程物料配比为磷酸溶液25份、粗污泥20份，反应温度为58℃，反应时间为1.25小时；二段污泥工艺段，硫酸溶液质量浓度为1.1%，反应过程物料配比为硫酸溶液65份、一段污泥15份，反应温度为微沸，反应时间为35分钟；三段污泥工艺段，氢氧化钠溶液质量浓度为1.1%，反应过程物料配比为氢氧化钠溶液65份、二段污泥15份，反应温度为微沸，反应时间为35分钟；清洗工艺段，乙醇溶液质量浓度为6%，清洗过程物料配比为乙醇65份、三段污泥6份，然后用清水清洗至pH值7.0范围。步骤三中产酶培养基的配置时，碳源底物浓度为45 g/L；纤维素酶的培养在温度30℃下，通气培养7天。
具体实施方式五：具体实施方式五区别于实施方式一在于步骤一中造纸污泥质量浓度为8.75%，离心转速2500 转/分，离心时间17.5分钟。步骤二中一段污泥工艺段，磷酸溶液质量浓度为22.5%，反应过程物料配比为磷酸溶液35份、粗污泥30份，反应温度为65℃，反应时间为1.75小时；二段污泥工艺段，硫酸溶液质量浓度为1.4%，反应过程物料配比为硫酸溶液85份、一段污泥25份，反应温度为微沸，反应时间为55分钟；三段污泥工艺段，氢氧化钠溶液质量浓度为1.4%，反应过程物料配比为氢氧化钠溶液85份、二段污泥25份，反应温度为微沸，反应时间为55分钟；清洗工艺段，乙醇溶液质量浓度为9%，清洗过程物料配比为乙醇85份、三段污泥9份，然后用清水清洗至pH值6.5范围。步骤三中产酶培养基的配置时，碳源底物浓度为55 g/L；纤维素酶的培养在温度38℃下，通气培养6.5天。