一种鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP的截断重组蛋白及应用的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，更具体地，涉及一种鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP的截断重组蛋白及应用。

背景技术：

鸭疫里默氏杆菌病是鸭、鹅、火鸡和其他鸟类的一种高致病性、接触性传染病之一，其病原体为鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)，主要侵害1～8 周龄（尤其2～3周龄）雏鸭、雏鹅及雏火鸡等。鸭疫里默氏杆菌病多呈急性或慢性败血症病程，主要以神经症状和纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征，发病率90%以上，死亡率高达75%，耐过的病鸭常长成残次鸭或僵鸭，饲料转化率降低，生长发育迟缓，且由RA引起的输卵管炎严重影响鸭成年后产蛋率。因此，鸭疫里默氏杆菌病的广泛流行，给养鸭业带来严重的经济损失。

目前已成功研制出弱毒疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗来控制鸭疫里默氏杆菌病。由于RA 的血清型多而复杂，国际公认有21 个血清型，我国也存在10 多个血清型，且各血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护，这给RA 的疫苗防治带来一定困难。比较有效的方法是针对当地主要流行血清型，选取相应菌株研制疫苗，以达到更有效的防治效果。

铁是生命系统所必需的分子，在脊椎动物体液中，铁绝大部分与转铁蛋白和乳铁蛋白结合在一起，致病菌要想在宿主体内建立感染，很大程度上依赖于其利用宿主铁复合物的能力，因此微生物的铁载体运输系统，是致病菌战胜宿主非特异性防御机制，并在宿主体内繁殖的关键。铁载体运输系统主要由铁载体、铁载体受体蛋白(Siderophore Receptor Protein, SRP)组成，其中，SRP在细菌铁离子摄取机制中起着至关重要的作用，是细菌重要的毒力因子和潜在的疫苗靶分子。

RA抗体的检测是评价RA疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的关键。目前未见RA血清1型SRP研究和应用的相关研究报道。因此，研制一种易于制备，不存在散毒危险的新型RA抗原，对建立特异敏感的RA抗体检测方法进而防控RA具有非常重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种RA血清1型铁载体受体蛋白SRP及其编码核苷酸序列，目的之二在于提供一种RA血清1型铁载体受体蛋白SRP的截断重组蛋白及其编码核苷酸序列，目的之三是提供RA血清1型铁载体受体蛋白SRP的截断重组蛋白的制备方法及其在特异性检测RA抗体的应用。

本发明所采取的技术方案是：

鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

编码权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP的核苷酸序列，优选的，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP的截断重组蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

编码鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP的截断重组蛋白的核苷酸序列，优选的，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

一种鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP截断重组蛋白在制备检测鸭疫里默氏杆菌抗体试剂中的应用，鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP截断重组蛋白能与鸭疫里默氏杆菌抗体产生特异性反应。

一种鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP的截断重组蛋白的方法，其步骤包括：

（1）将编码鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP的截断重组蛋白的核苷酸序列克隆入原核表达质粒pET43a(+)中，获得重组表达载体；

（2）将步骤（1）获得的重组表达载体转入大肠杆菌Rosetta工程菌株中，获得SRP截断重组蛋白Rosetta工程菌；

（3）将步骤（2）获得的SRP截断重组蛋白Rosetta工程菌按体积比1:50加入到含Amp的LB培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，进行诱导培养；

（4）诱导培养结束后，离心收集菌体，加入PBS重悬菌体，于冰浴中进行超声裂解，离心，收集上清；

（5）将上清液进行纯化，获得权利要求3所述的截断重组蛋白，即鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP的截断重组蛋白。

优选的，步骤（3）所述的IPTG诱导培养时间为3～5h。

进一步优选的，步骤（3）所述的IPTG诱导培养时间为5h。

本发明的有益效果是：

本发明制备得到的RA血清1型铁载体受体蛋白SRP的截断重组蛋白能够与血清1型RA多克隆抗体产生特异性反应，可作为血清1型RA抗体检测的理想抗原。

本发明的制备得到的RA血清1型铁载体受体蛋白SRP的截断重组蛋白非全细菌，不存在散毒的危险，并且该蛋白原核表达时的可溶性增加，可有效降低下游大规模生产成本，适于工业化大规模生产，亦利于实验室疫苗研究。

附图说明

图1：jSRP基因PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图【M: DNA Marker；1: jSRP基因PCR 产物】；

图2：重组表达质粒pET43a-jSRP双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图【M: DNA Marker；1: pET43a-jSRP重组表达质粒用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后的产物；2: pET43a-jSRP重组质粒未酶切】；

图3：pET43a-jSRP重组工程菌表达SRP截断重组蛋白的SDS-PAGE图 【M: 蛋白Marker；1～3: pET43a-jSRP重组工程菌诱导3h、4h、5h；4: pET43a-jSRP重组工程菌未诱导；5: pET-43a(+)空载体转化菌诱导5h】；

图4：pET43a-jSRP重组工程菌诱导裂解上清和沉淀SDS-PAGE电泳图 【M: 蛋白 Marker；1: pET43a-jSRP重组工程菌诱导裂解上清，2：pET43a-jSRP重组工程菌诱导裂解沉淀】；

图5：SRP截断重组蛋白Western blot图【1：pET-43 a (+)空载体蛋白印迹；2：pET43a-SRP蛋白印迹】。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步解释本发明，未详细描述的技术为本领域技的常规技术。

本发明涉及的RA血清1型铁载体受体蛋白(SRP)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码SRP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，命名为SRP基因，SRP基因片段长度2262bp，源至RA-GD全基因组(登录号为CP002562)。

1、RA血清1型SRP截断重组蛋白的选取

利用Signal P、TMHMM在线分析软件对SRP基因的信号肽序列、跨膜序列以及抗原性分析，选取RA血清1型SRP截断重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码该截断重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示(即SRP基因第600位至1112位核苷酸序列)，此处命名为jSRP基因，片段长度为513bp。

2、引物设计

根据jSRP基因序列设计引物，由上海英潍捷基生物技术公司合成。

上游引物P1：5'-CGGATCCACTTATGCAAGTTTTAATACTTACACG-3' (SEQ ID NO:5)

下游引物P2：5'-CCAAGCTTTTTATTCCCATATTGTTGCAGG-3' (SEQ ID NO:6)

3、RA全基因组提取及jSRP基因区段PCR扩增

参照天根细菌基因组DNA 试剂盒说明书步骤提取RA-GD菌株全基因组DNA，-20℃保存备用。以RA-GD菌株全基因组DNA为模板，采用上游引物P1、下游引物P2扩增jSRP基因区段。PCR反应体系如下：10×ExTaq buffer 5µL、dNTPs(2.5 mM) 4.0µL、P1(10 pmol/L) 2.0µL、P2(10 pmol/µL) 20µL、ExTaqDNA聚合酶(5 U/µL) 0.25µL、DNA 4µL，加双蒸水至50µL。PCR扩增反应为：首先94℃5min；然后94℃ 30s、53℃退火30s、72℃延伸30 s，循环35次；最后72℃延伸10min结束。

取5µL扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，结果如图1所示，获得一条与预期大小一致的特异性DNA条带片段。

4、重组表达质粒的构建与鉴定

按照天根凝胶回收试剂盒说明书，将jSRP基因区段PCR回收纯化产物与表达载体pET43a(+)分别用BamHⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切，16 ℃连接过夜后转化DH5α感受态细胞，将培养液涂布于含Amp (终浓度100 mg/ L)的平板上，37℃培养过夜，挑选阳性克隆，抽提质粒，获得重组质粒pET43a-jSRP。

重组质粒pET43a-jSRP采用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，结果如图2所示，其中DNA小片段与目的DNA片段大小相符，另外一条较大的DNA片段是pET43a (+)载体片段。将鉴定的阳性重组质粒pET43a-jSRP送上海生物工程技术有限公司测序，结果显示，所得的jSRP基因序列与目标序列完全一致。

5、重组表达质粒pET43a-jSRP的诱导表达

把测序正确的阳性重组质粒pET43a-jSRP转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞，获得含重组质粒pET43a-jSRP的Rosetta工程菌，将其按体积比1 :50加入含Amp (100 mg/ L)的LB培养基中，37 ℃，180 r/min振荡培养，待OD600达到0.6~0.8时，加入终浓度为0.5 mmol/ L的IPTG，继续振荡培养，分别在诱导后3h、4h和5h 吸取1 mL菌液于4 ℃保存，12000 r/min 离心1 min，收集细菌沉淀进行SDS-PAGE分析。

如图3所示，第1～3泳道分别是pET43a-jSRP的Rosetta工程菌诱导3h、4h和5h情况，可见均在87 KDa左右出现特异性蛋白条带，与预期的蛋白分子量大小一致；第4泳道是pET43a-jSRP的Rosetta工程菌未诱导的情况，无特异性蛋白条带出现；第5泳道是pET43a (+)空载体转化菌IPTG诱导5 h的情况，只出现了载体自身表达的蛋白。从图3可以看出诱导5h的蛋白表达量最大，故选取5 h作为最佳诱导时间。

6、pET43a-jSRP的Rosetta工程菌表达产物的可溶性分析

将pET43a-jSRP的Rosetta工程菌按体积比1 :50加入含Amp (100 mg/ L)的LB培养基中，37 ℃，180 r/min振荡培养，待OD₆₀₀达到0. 6~0. 8时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，诱导培养5h，然后4℃，10000r/min离心10min收集菌体，加入20 mL PBS重悬菌体，于冰浴中进行超声裂解。超声完毕后于4℃，12000 r/min离心20 min分离超声产物的上清和沉淀，用10 mL PBS重悬沉淀。取50 μL的超声上清和沉淀，分别加入50 μL上样缓冲液，混匀，置沸水浴中煮10 min后12000 r/min离心1 min，最后分别取10 μL上清进行SDS-PAGE分析。

如图4所示，上清(第1泳道)中含有pET43a-jSRP的Rosetta工程菌表达的目的蛋白，表明该蛋白能以可溶的形式存在。

7、SRP截断重组蛋白的纯化及Western-blot检测

采用上述诱导条件进行大量蛋白表达，收集菌液，离心，菌体沉淀用pH 7.2的PBS进行重悬，冰水浴超声裂解菌体，离心后收集上清，按照Novagen公司的Ni-NTA His.Bind 树脂说明书对重组蛋白进行纯化，取10 μL上清进行 SDS-PAGE分析。

SRP截断重组蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，按如下操作进行电转印：将预先在转印缓冲液中浸泡后的滤纸、胶、NC膜，按以下顺序组装：平板阳极-三层滤纸-NC膜-凝胶-三层滤纸-平板阴极，15 mA转1.5 h。电转印结束后，NC膜用5%脱脂奶粉封闭1 h，用PBST洗涤3次，每次5 min，加入1:50稀释的RA阳性血清(血清1型)，37℃作用1 h后，再用PBST洗涤3 次，加入1:2000稀释的HRP标记的兔抗鸭IgG，37℃作用1 h后，用PBST洗涤3 次，用DAB显色，然后用双蒸水终止，拍照保存。

结果如图5所示，第1泳道为空载体pET43a(+)转化Rosetta菌的IPTG诱导产物与RA 血清无特异性的反应条带，第2泳道为SRP截断重组蛋白与RA阳性血清(血清1型)有特异性的反应条带，表明该截断重组蛋白具有良好的免疫反应原性，可作为血清1型RA的理想抗原。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 一种鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP的截断重组蛋白及应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 753

<212> PRT

<213> Riemerella anatipestifer

<400> 1

Met Lys Lys Asn His Phe Tyr Gln Arg Asn Gly Tyr Tyr Leu Ser Thr

1 5 10 15

Met Leu Leu Lys Ala Cys Asn Ile Ala Leu Leu Thr Ala Pro Leu Phe

20 25 30

Ser Asn Ala Gln His Lys Glu Arg Ile Lys Asp Ile Gln Glu Val Glu

35 40 45

Leu Val Lys Arg Lys Leu Glu Ala Phe Glu Ser Arg Lys Leu Arg Glu

50 55 60

Val Glu Gly Thr Ser Ile Phe Ala Ala Lys Lys Thr Glu Val Val Leu

65 70 75 80

Met Asp Leu Lys Leu Ala Asn Lys Ala Leu Asn Asn Pro Arg Gln Val

85 90 95

Phe Ser Gln Val Ser Gly Val Asn Val Phe Asp Ser Asn Asp Gly Gly

100 105 110

Leu Gln Leu Asn Ile Gly Gly Arg Gly Leu Asn Pro Asn Arg Ser Ala

115 120 125

Asn Phe Asn Thr Arg Gln Asn Gly Tyr Asp Ile Ser Ala Asp Val Leu

130 135 140

Gly Tyr Pro Glu Ser Tyr Tyr Thr Pro Pro Ala Glu Ala Leu Glu Glu

145 150 155 160

Ile Gln Val Val Arg Gly Ala Ala Ser Leu Gln Tyr Gly Thr Gln Phe

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Asn Phe Lys Leu Lys Thr Pro Thr Lys Thr Gln Pro

180 185 190

Leu Glu Leu Ile Ser Arg Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Thr Tyr Thr

195 200 205

Ser Phe Ser Ala Leu Ser Gly Thr Val Gly Lys Trp Ser Tyr Tyr Thr

210 215 220

Phe Phe Asn Tyr Lys Gln Gly Asp Gly Phe Gln Glu Asn Ser Glu Tyr

225 230 235 240

Asn Ala Arg Asn Phe Tyr Val His Leu Asn Tyr Glu Ile Thr Pro Gln

245 250 255

Thr Ser Ile Ser Thr Glu Phe Thr Arg Phe Asn Tyr Leu Ala His Gln

260 265 270

Pro Gly Gly Leu Thr Asp Phe Gln Phe Tyr Gln Asn Pro Tyr Gln Ser

275 280 285

Asn Arg Ala Arg Asn Trp Phe Lys Val Asp Trp Asn Leu Trp Asn Val

290 295 300

Ser Leu Lys His Gln Phe Thr Pro Arg Ala Lys Leu Ser Leu Ser Gly

305 310 315 320

Phe Gly Leu Gly Ala Ser Arg Tyr Ser Leu Lys Val Ser Ser Ile His

325 330 335

Val Ala Asp Val Asp Tyr Glu Gly Ala Thr Arg Asp Leu Ile Thr Gly

340 345 350

Asp Phe Lys Asn Trp Gly Val Glu Ala Arg Phe Leu Gln Gln Tyr Gly

355 360 365

Asn Lys Asn His Thr Phe Leu Val Gly Gly Lys Tyr Tyr Lys Ala Gln

370 375 380

Asn Ser Gly Lys Gln Gly Pro Gly Ser Ala Phe Ser Gly Ala Asp Phe

385 390 395 400

Asn Phe Asp Gln Thr Asn Lys Asn Tyr Phe Phe Gln Ser Asn Tyr Ser

405 410 415

Tyr Pro Asn Arg Asn Ile Ala Val Phe Ser Glu Asn Ile Phe Lys Leu

420 425 430

Gly Ala Pro Trp Ser Val Val Pro Gly Val Arg Trp Glu Phe Ile Asp

435 440 445

Thr Gly Ala Asp Gly Ala Tyr Gln Arg Val Ile Glu Asp Asn Ala Gly

450 455 460

Asn Val Ile Tyr Asn Lys Arg Phe Glu Glu Gln Glu Lys Arg Gln Arg

465 470 475 480

Asn Phe Ala Leu Phe Gly Leu Gly Val Ser Tyr Lys Pro Thr Lys Ala

485 490 495

Phe Glu Phe Tyr Thr Asn Leu Ser Gln Asn Tyr Arg Ser Val Thr Phe

500 505 510

Ser Asp Ile Arg Val Glu Asn Asn Ser Gln Val Ile Asp Pro Asn Ile

515 520 525

Lys Asp Glu Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Leu Gly Ile Arg Gly Asn Trp

530 535 540

Lys Asn Thr Leu Ser Tyr Asp Ile Asn Met Phe Gly Leu Trp Tyr Asn

545 550 555 560

Asn Arg Ile Asp Asn Val Phe Arg Lys Arg Glu Gly Leu Phe Ser Asp

565 570 575

Val Ala Lys Val Arg Thr Asn Val Gly Ala Ala Phe Ile Ala Gly Leu

580 585 590

Glu Ser Leu Val Asp Val Asn Ile Asn Lys Leu Leu Leu Gly Asn Leu

595 600 605

Gln His Trp Lys Trp Asn Leu Phe Phe Asn Thr Ala Leu Thr His Ser

610 615 620

Gln Tyr Val Lys Ser Glu Ile Pro Gly Ile Lys Gly Asn Arg Val Glu

625 630 635 640

Tyr Val Pro Lys Val Asn Leu Lys Ser Gly Leu Asn Phe Gly Tyr Arg

645 650 655

Asn Phe Leu Gly Ser Leu Leu Phe Thr Tyr Met Ser Glu Gln Phe Thr

660 665 670

Thr Ala Thr Asn Glu Pro Thr Asp Lys Thr Asp His Leu Trp Gly Ile

675 680 685

Arg Gly Ser Ile Pro Ala Tyr Lys Leu Leu Asp Ala Ser Phe Ser Tyr

690 695 700

Arg Ile Thr Pro Asn Ile Arg Leu Glu Thr Gly Val Asn Asn Val Leu

705 710 715 720

Asn Glu Val Tyr Phe Thr Arg Arg Ala Thr Gly Tyr Pro Gly Pro Gly

725 730 735

Ile Ile Pro Ser Ala Pro Arg Gln Tyr Tyr Phe Thr Leu Glu Met Lys

740 745 750

Leu

<210> 2

<211> 2262

<212> DNA

<213> Riemerella anatipestifer

<400> 2

atgaagaaga atcattttta ccaaagaaat ggctattacc tttcaacgat gttattaaag 60

gcttgtaaca ttgcattgct taccgcacca ttattttcga atgctcaaca caaagaaaga 120

atcaaggata tacaggaggt agaactggtt aaaagaaagt tggaagcctt tgaatccaga 180

aaattgaggg aagtggaagg caccagcatc tttgccgcta aaaaaacgga agtggtgcta 240

atggatttaa agttggctaa taaagccctt aataatccca gacaggtctt ttcccaagta 300

tcgggcgtta atgtttttga tagtaacgac ggggggcttc agctcaacat aggagggcga 360

gggcttaacc ctaaccgttc agctaacttt aacaccagac agaatgggta cgatattagt 420

gccgatgtat tgggttatcc agagagctat tatacaccac ccgcagaggc attggaggag 480

attcaggtgg tgagaggagc ggcttcgttg caatacggaa cacagttcgg agggttgctt 540

aattttaaac taaaaacgcc aactaaaaca caaccgttgg agcttatcag caggaatact 600

tatgcaagtt ttaatactta cacgagtttc agtgctttga gcggaacggt gggcaagtgg 660

tcttattata ctttttttaa ttataagcaa ggggacggat ttcaagaaaa ttcggaatat 720

aatgccagaa acttttatgt tcatttaaac tatgagataa cgcctcaaac aagtatcagt 780

acggagttta cccgttttaa ttatttggca catcaacctg gggggcttac cgattttcag 840

ttctaccaaa atccttatca aagcaaccga gcaagaaatt ggtttaaagt ggactggaac 900

ctttggaatg tgtcattaaa gcatcagttt acccctcgtg ccaaattaag tttaagtggg 960

tttggcttgg gagcgtcccg ttattcttta aaagtctcgt ctatccatgt cgcagatgtg 1020

gattatgaag gggctacacg ggatttgatt acaggagatt ttaagaattg gggagtagaa 1080

gcaaggttcc tgcaacaata tgggaataaa aaccatactt ttttggtagg aggtaaatat 1140

tataaagctc aaaactcggg gaagcaagga ccgggaagtg ctttttctgg ggcagatttt 1200

aactttgacc agactaataa aaactatttc tttcagtcga attatagcta tcctaaccga 1260

aatatagcgg tgttttcaga gaatatattt aagttgggag ctccttggtc ggtagttcct 1320

ggtgtgcgtt gggagtttat agatactggt gcagatgggg cgtaccaaag ggtgatagaa 1380

gataatgcag gaaatgtaat ctataacaaa cgctttgaag aacaagagaa acgccaaagg 1440

aatttcgcac tatttgggtt gggtgtttct tataagccta ccaaagcgtt tgaattttac 1500

actaacttgt cccaaaatta ccgctctgta acctttagtg atattagagt agaaaataat 1560

tcccaagtga tagaccccaa cattaaggac gaaacaggct atacgggaga tttggggata 1620

agagggaatt ggaaaaatac actgtcttac gacatcaata tgtttggatt gtggtataat 1680

aacagaatag ataatgtttt tagaaaaagg gaaggcttgt tctccgatgt agcaaaggta 1740

cgaactaatg taggagcggc atttattgcg gggttagaat cgttggtaga cgtaaatatc 1800

aacaaacttc ttttagggaa tttgcaacat tggaaatgga atttgttttt taatacagca 1860

ctcacgcatt ctcaatatgt aaagtccgag atacctggga ttaagggcaa ccgtgtggaa 1920

tatgtaccta aagtcaattt aaaatcgggg cttaactttg ggtaccgtaa ctttttagga 1980

agccttttgt ttacctatat gtcggagcaa tttaccacgg caactaatga acctacggat 2040

aaaacagacc atctgtgggg gatacgaggg agcataccag cttataagct attagatgcc 2100

tctttttcgt accgcatcac acctaatatc cgattggaaa caggcgtgaa taatgtactg 2160

aatgaagtct attttacccg aagagccaca gggtatccag gaccggggat tattccttcc 2220

gctcctcgcc aatattattt cactttggaa atgaagctgt ag 2262

<210> 3

<211> 171

<212> PRT

<213> Riemerella anatipestifer

<400> 3

Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Thr Tyr Thr Ser Phe Ser Ala Leu Ser Gly

1 5 10 15

Thr Val Gly Lys Trp Ser Tyr Tyr Thr Phe Phe Asn Tyr Lys Gln Gly

20 25 30

Asp Gly Phe Gln Glu Asn Ser Glu Tyr Asn Ala Arg Asn Phe Tyr Val

35 40 45

His Leu Asn Tyr Glu Ile Thr Pro Gln Thr Ser Ile Ser Thr Glu Phe

50 55 60

Thr Arg Phe Asn Tyr Leu Ala His Gln Pro Gly Gly Leu Thr Asp Phe

65 70 75 80

Gln Phe Tyr Gln Asn Pro Tyr Gln Ser Asn Arg Ala Arg Asn Trp Phe

85 90 95

Lys Val Asp Trp Asn Leu Trp Asn Val Ser Leu Lys His Gln Phe Thr

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Pro Arg Ala Lys Leu Ser Leu Ser Gly Phe Gly Leu Gly Ala Ser Arg

115 120 125

Tyr Ser Leu Lys Val Ser Ser Ile His Val Ala Asp Val Asp Tyr Glu

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Gly Ala Thr Arg Asp Leu Ile Thr Gly Asp Phe Lys Asn Trp Gly Val

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Glu Ala Arg Phe Leu Gln Gln Tyr Gly Asn Lys

165 170

<210> 4

<211> 513

<212> DNA

<213> Riemerella anatipestifer

<400> 4

acttatgcaa gttttaatac ttacacgagt ttcagtgctt tgagcggaac ggtgggcaag 60

tggtcttatt atactttttt taattataag caaggggacg gatttcaaga aaattcggaa 120

tataatgcca gaaactttta tgttcattta aactatgaga taacgcctca aacaagtatc 180

agtacggagt ttacccgttt taattatttg gcacatcaac ctggggggct taccgatttt 240

cagttctacc aaaatcctta tcaaagcaac cgagcaagaa attggtttaa agtggactgg 300

aacctttgga atgtgtcatt aaagcatcag tttacccctc gtgccaaatt aagtttaagt 360

gggtttggct tgggagcgtc ccgttattct ttaaaagtct cgtctatcca tgtcgcagat 420

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gaagcaaggt tcctgcaaca atatgggaat aaa 513

<210> 5

<211> 34

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<213> 人工序列

<400> 5

cggatccact tatgcaagtt ttaatactta cacg 34

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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