鲍曼不动杆菌噬菌体SH‑Ab15519及其应用的制作方法

本发明涉及微生物医学领域，更具体地说，涉及到一种新型鲍曼不动杆菌噬菌体SH-Ab15519及其应用。

背景技术：

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，Ab)是临床常见的条件致病菌。近年来，我国Ab感染在医院感染中所占比例显著上升，其对抗菌药物的耐药性亦逐年上升，多重耐药菌的比例明显增加。根据研究，不同医院、不同科室之间，Ab对抗菌药的耐药率存在显著差异，多发生于心外科，且肺部感染较为常见，以引起死亡率较高的鲍曼肺炎。另外，Ab对常见抗菌药物耐药性均较高，如头孢哌酮/舒巴坦、氨苄西林/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦，而多粘菌素B在体外对多重耐药Ab仍具有较强的抗菌活性。国外方面，Ab感染及耐药率普遍呈上升趋势。且其感染毒性增强，一般抗菌药治愈率低。碳青霉烯是抗菌效果较好的抗生素，但关于其耐药菌的报道逐年增加，医院经常使用碳青霉烯类抗生素所造成的选择性压力，有利于鲍曼不动杆菌中耐药菌株的优势生长，给临床治疗带来许多困难。

噬菌体(Bacteriophage)是一种能感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，通过感染、增殖、成熟并释放子代等一系列的过程侵染病原体，达到裂解、杀灭宿主菌的作用。早在1915年和1917年，Twort和D,Herelle就已各自独立发现了噬菌体的存在。之后的一段时间里，许多科学家都针对噬菌体进行了各项研究并且应用于临床感染性疾病的治疗，也获得了一定的疗效。然而，自20世纪40年代青霉素等抗生素的发现并应用以来，抗生素在很长一段时间里都以其高效杀灭病原体，安全性高等特点获得了全世界范围内的广泛推广，这也使得大多数国家终止了对噬菌体制剂的研究，导致对噬菌体治疗的研究被搁置下来。但是，由于抗生素的滥用，出现了越来越多的耐药菌株，其耐药性也愈加广泛，甚至出现了泛耐药的“超级细菌”，新型抗生素的研发速度远不及细菌出现耐药性突变的速度，于是，针对噬菌体治疗的研究又重新引起人们的重视。

迄今为止，噬菌体应用于人体治疗的临床病例已有数千例；2006年美国食品和药品管理局首次批准，将噬菌体用作食品添加剂，用于杀灭肉制品中的李氏杆菌。然而噬菌体的应用却始终未得到推广，除上文述及的抗生素的发现与应用外，另一个原因是噬菌体对宿主菌特异性要求过高。噬菌体能对抗的病原菌包括葡萄球菌、链球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等，能治疗的疾病包括化脓性伤口感染、皮炎、肺炎、脓胸、肠胃炎、脓毒症、骨髓炎等。噬菌体治疗具有指数增殖、特异性强、易实时更新、副作用小、无残留及周期短、成本低等优点，因而具有广阔的开发前景。

Ab主要引起呼吸道感染，也可引发败血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎等。Ab在医院的环境中分布很广且可长期存活，对危重患者和CCU及ICU中的患者威胁很大，也将此类感染称做ICU获得性感染。

技术实现要素：

本发明所要解决的第一个技术问题是，提供鲍曼不动杆菌噬菌体SH-Ab15519。

本发明所要解决的第二个技术问题是，提供鲍曼不动杆菌噬菌体SH-Ab15519在制备杀灭鲍曼不动杆菌药物中的应用。

本发明所要解决的第三个技术问题是，提供鲍曼不动杆菌噬菌体SH-Ab15519在制备预防治疗由鲍曼不动杆菌感染的疾病的药物中的应用。

为了解决上述第一个技术问题，本发明提供了鲍曼不动杆菌噬菌体SH-Ab15519，其特征在于，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2016653。

为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了鲍曼不动杆菌噬菌体SH-Ab15519在制备杀灭鲍曼不动杆菌药物中的应用。

为了解决上述第三个技术问题，本发明提供了鲍曼不动杆菌噬菌体SH-Ab15519在制备预防治疗由鲍曼不动杆菌感染疾病的药物中的应用。

本发明所要保护的噬菌体命名为鲍曼不动杆菌噬菌体SH-Ab15519(Acinetobacter baumannii phage SH-Ab15519，下称SH-Ab15519)，保藏在中国典型培养物保藏中心(保藏地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学中国典型培养物保藏中心邮编430072)，保藏日期是2016年11月18号，保藏编号为CCTCC NO:M 2016653。

本发明的有益效果：本发明分离并纯化得到新型鲍曼不动杆菌噬菌体SH-Ab15519，能够特异有效地消灭鲍曼不动杆菌，对耐药性鲍曼不动杆菌具有良好的体内、外抗菌作用，为临床开发预防治疗耐药性鲍曼不动杆菌感染的制剂提供实验基础，具有极大的临床应用潜力。

附图说明

图1为SH-Ab15519在双层琼脂平板上的形态。

图2中A为不同温度对SH-Ab15519效价的影响，B为PH对于SH-Ab15519裂解能力的影响。C和D分别为SH-Ab15519吸附和一步生长图。

图3为SH-Ab15519在日立透射电子显微镜H-9500下的形态图。

图4为SH-Ab15519全基因组电泳图。

图5为SH-Ab15519酶切图。

图6为SH-Ab15519结构图。

图7为不同MOI下SH-Ab15519的裂解能力，由图可得，在MOI为1、0.1和0.01时，SH-Ab15519有较好的裂解能力。

图8-1为小鼠插管后解剖图，图8-2为插管装置。

图9-1为小鼠注射环磷酰胺体重变化图，图9-2为小鼠白细胞数量变化图。

图10为不同给菌剂量死亡率，分别为12.50％、36.36％、63.64％、84.21％。故采用1×10⁸CFU作为对照。

图11为滴鼻给药噬菌体存活率，给菌1h后，高达85％以上，而2h之后存活率下降，为66.7％。对照组仅为15.8％。

图12为给菌24h后小鼠肺部细菌载菌量和噬菌体量。致死组是治疗组细菌量的1000倍，治疗组噬菌体量是对照的10倍，可见治疗组噬菌体在体内增值，噬菌体在体内能有效裂解细菌。

图13不同组小鼠24h肺部病理情况。A.对照组加生理盐水B.只加SH-Ab15519噬菌体C.致死组(Ab+生理盐水)D.治疗组(Ab+SH-Ab15519)致死组的肺泡结构表现异常，大部分的肺泡空间被炎性渗出物和免疫细胞浸润并伴有出血和整合。而治疗组有明显的缓解，局部病变，大部分肺组织正常。两组对照都表现正常肺组织形态。

图14不同组小鼠24h之后TNF-а和IL-6细胞因子的含量。TNF-а致死组比治疗组是治疗组的三倍，而IL-6是治疗组的4.5倍。可见噬菌体能有效降低细胞因子的含量，减少炎症反映，提高小鼠存活率。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本发明采用上海交通大学附属瑞金医院污水，用双层平板法分离、筛选以及纯化得到一种新型鲍曼不动杆菌噬菌体SH-Ab15519，提取其DNA并进行测序，进行基因分析。之后，采用双层琼脂平板法测定噬菌体的效价，采用点滴法来分析噬菌体SH-Ab15519宿主谱，并通过热稳定实验、酸碱稳定性实验、吸附试验以及一步生长曲线测定其生物学特性。此外，还要对噬菌体进行电子显微镜下的观察，了解其形态结构。最后，通过构建鲍曼不动杆菌肺炎小鼠模型，进行噬菌体SH-Ab15519治疗效果的评估。鲍曼不动杆菌宿主菌液由复旦大学附属华山医院提供。

实施例1噬菌体SH-Ab15519的分离和筛选

取污水样本液离心10min；上清液经0.22μm孔径的滤膜过滤后，与培养至对数生长期的菌液混合，37℃培养过夜；加入少量氯仿，4℃离心10min，取上清液，与培养至对数生长期的菌株37℃孵育10min，双层琼脂法铺平板，37℃培养过夜；将获得的噬菌斑纯化3次，进一步研究。

实施例2噬菌体SH-Ab15519的纯化

将噬菌体和菌混合培养，翌日，加2％氯仿4℃静置1h，随后6500r/min，15min，4℃离心。上清加入终浓度为1ug/mL的DNA酶和RNA酶，室温放置30min。加入NaCl至终浓度为0.5M，冰浴1h后，4℃，11000g离心10min。取上清，加入固体PEG8000至终浓度为10％(w/v)，混匀后静置于4℃过夜。取前1日混合液，4℃，8500r/min，离心20min后，弃上清，沉淀用SM Buffer(NaCl 5.8g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，明胶0.1g/L，Tris·HCl 50mL)重悬。加等量氯仿轻混30秒，4000g离心10min，取上清。氯化铯密度梯度法纯化噬菌体。透析之后，过0.22μm滤膜，4℃保存并用于透射电子显微镜观察及DNA抽提。

实施例3噬菌体SH-Ab15519效价的测定

用双层琼脂平板法测定噬菌体效价——噬菌斑形成单位(plaque forming unit,pfu)。将扩增所得的噬菌体液进行连续10倍稀释至10³至10⁶密度范围。取400μL噬菌体稀释液混合于试管中，室温吸附10min后，双层琼脂平板法观察噬菌体并计算pfu，重复3次。噬菌体效价(pful/mL)＝平均噬菌斑数×稀释倍数×100。

SH-Ab 15519感染宿主菌形成的噬菌斑直径约为7-8mm。斑呈圆形透明，外有晕圈。参见图1。

另外，其体外裂解能力参见图7。

实施例4噬菌体SH-Ab15519宿主谱分析

采用点滴法。37℃，220r/min，将所有菌摇至对数期(OD＝0.6)，取菌400μL加0.7％琼脂LB培养基混匀，倒入固体琼脂平板制成双层平板。凝固后在琼脂表面滴加2μL噬菌体液，待板上液体变干后，37℃倒置培养过夜。通过噬菌斑产生情况判断噬菌体的裂解谱。见下表：

实施例5噬菌体SH-Ab15519生物学特性

(1)热稳定性实验

将高效价的噬菌体液用SM缓冲液稀释10倍后，分别置于4℃、37℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴中作用1h。作用时间结束后立即铺双层平板，确定噬菌体滴度。独立三次试验。

SH-Ab 15519热稳定性，如图2-A所示，横坐标表示不同的温度，纵坐标表示产生噬菌体效价的对数值。其在50℃作用1h后仍保持较高的活性，但当温度升至60℃时，效价降低，70℃时失去活性。

(2)酸碱稳定性实验

将高效价的噬菌体液用SM Buffer稀释10倍。取PH为1、2、3、4、5、6、7、7.45、8、9、10、11、12的SM Buffer各900μL，分别加入100μL稀释的噬菌体液。在37℃中放置1h后，取10μL与400μL宿主菌混合，37℃孵育5min后，用双层平板法铺板。次日，根据噬菌斑个数确定PH稳定性。每个PH实验重复3次。

通过酸碱稳定性试验发现，如图2-B所示，横坐标表示噬菌体处于不同的pH值，纵坐标表示相对于最初效价的百分比。SH-Ab 15519耐碱不耐酸，强酸情况下效价为0，其几乎完全失活。在强碱环境下作用1h后效价降低至原始效价的70％左右。而在pH＝7.45时作用1h后，其效价几乎不受影响，说明该噬菌体适合长期储存在在中性环境中。

(3)吸附实验

培养宿主菌至对数生长期，室温按MOI＝0.01的比例混合噬菌体液和菌液。于混合后0、1、2、3、4、5、10、15、20、25min各取100μL加至900uL SM缓冲液中，混匀。立即16000g离心30s，吸上清液100uL加至900uL SM缓冲液中，用双层琼脂平板法确定效价，计算吸附至宿主菌的噬菌体，重复3次。

通过SH-Ab 15519对其本身宿主吸附实验研究发现，如图2-C所示，横坐标表示噬菌体和细菌共同孵育时间，纵坐标表示未被宿主菌吸附的噬菌体百分比。当SH-Ab 15519和宿主混合孵育5min就有80％的噬菌体吸附到宿主上，10min时90％左右的噬菌体和宿主结合。

(4)一步生长曲线测定

培养宿主菌至对数期，按MOI＝0.005的比例加入噬菌体液，37℃水浴1min，3000g离心1min，弃上清液，沉淀重悬于液体LB培养基。重悬后每10min取样，用双层琼脂平板法测定效价，重复3次。

通过噬菌体一步生长曲线试验发现，如图2-D所示，横坐标表示细菌和噬菌体共同孵育时间，纵坐标表示产生噬菌体效价的对数值。SH-Ab 15519在其宿主菌中生长一代噬菌体的时间为50min，其潜伏期为10min，裂解期为40min，之后进入稳定期。根据裂解量计算公式：裂解量＝爆发末期噬菌体总数/感染初期宿主菌个数，所以平均每个宿主菌被该噬菌体裂解产生234个子代噬菌体。

实施例6噬菌体SH-Ab15519电子显微镜观察

将上述CsCl不连续密度梯度离心纯化后的噬菌体经2％戊二醛固定，磷钨酸负染，透射电子显微镜下观察期形态结构。

观察结果如图3所示，可知鲍曼噬菌体SH-Ab 15519属于短尾噬菌体，头部呈多面体立体对称结构，直径约为60nm，尾长18nm，尾部宽度13nm。

实施例7噬菌体SH-Ab15519的DNA提取和测序

采用酚-氯仿-异戊醇法抽提噬菌体519的基因。酶切确定其酶切位点，由晶能公司测序。

该噬菌体基因的限制性内切酶位点有Xba I，无EcoR I，Sal I，Kpn I，Pst I，Sma I酶切位点。基因全长40493bp，GC含量39.5％。共有50个开放阅读框。SH-Ab15519全基因组电泳图、酶切图及结构图，参见图4、5、6。

实施例8噬菌体SH-Ab15519肺炎小鼠治疗效果评估

(1)实验动物

实验动物均为清洁级BALB/c雌性小鼠，6-7周。经上海交通大学医学院实验动物中心购自上海斯莱克实验动物有限公司。全部小鼠饲养环境为常温，自由饮水供食。

(2)鲍曼不动杆菌肺炎小鼠的构建

给菌前4天和前1天分别小鼠腹腔注射200mg/kg和150mg/kg，构建小鼠中性粒减少模型。小鼠直视插管50μL 1×10⁸CFU鲍曼不动杆菌。每只小鼠插管前用2％戊巴比妥80mg/kg腹腔麻醉，待小鼠麻醉后固定在倾斜的手术板上，头部朝上，将50μL不同菌量事先注入静脉留置针，进行插管。待小鼠主动快速吸完菌液，拔出即可。将小鼠立起5min,放回饲养笼。观察小鼠生存情况。小鼠插管后解剖见图8-1，插管装置见图8-2。小鼠注射环磷酰胺体重变化见图9-1，白细胞数量变化见图9-2。

不同细菌给菌剂量死亡率分别为12.50％、36.36％、63.64％、84.21％。故采用1×10⁸CFU作为对照。见图10。

(3)应用SH-Ab 15519治疗肺炎小鼠

给菌1h后小鼠滴鼻给予30μL噬菌体治疗(MOI＝10)，解剖检测肺、血、肝、脾载菌量和噬菌体含量，并检测小鼠白细胞的数量，从而反映小鼠炎症的发生情况。将对照组和治疗组组织浸泡在4％多聚甲醛，病理切片，确定小鼠感染情况。与此同时，取肺泡灌洗液，检测细胞因子变化。

给菌1h后，滴鼻给药噬菌体存活率高达85％以上，而2h之后存活率下降，为66.7％。对照组仅为15.8％。见图11。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。