本发明涉及食品安全与发酵酿造领域，尤其涉及一种利用竹叶提取物降低氨基甲酸乙酯含量的黄酒酿造方法。
背景技术：
氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，简称为EC)又名尿烷(urethane)，常存在于发酵食品(如面包、酸牛奶、酱油等)和酒精饮料(如葡萄酒、啤酒、中国黄酒和日本清酒等)中，由于发酵过程中含氮化合物的不完全代谢产生相应的前体物质，如氨甲酰类化合物尿素和瓜氨酸等，与乙醇自发反应而生成的一种2A类致癌物。
目前普遍认为形成EC的前体物主要有两种：一种是通过尿素循环途径产生的尿素，在酒类酿造过程中，酵母可降解精氨酸生成尿素和鸟氨酸。细胞中的尿素不会立即进行降解，而是根据细胞对氮代谢的调节，部分被释放到酒液中，与乙醇自发反应形成EC；另一种是通过精氨酸脱亚胺酶途径产生的瓜氨酸，精氨酸在精氨酸脱亚胺酶的作用下生成瓜氨酸，瓜氨酸在鸟氨酸氨甲酰基转移酶的作用下生成鸟氨酸，瓜氨酸也能与乙醇形成EC。
现阶段，对于酒类酿造过程中氨基甲酸乙酯含量的控制主要通过以下三种途径：一是优势菌株的选育，为了降低精氨酸代谢，可以采用基因敲除的原理，得到低产尿素的酵母菌株。清酒发酵就采用了缺失精氨酸酶基因的清酒酵母，在清酒酿制过程中未发现尿素的积累，但细胞生长速度受到显著抑制，且基因工程菌株的应用也因生物安全性问题而受到限制；二是酶法控制酒类成品中EC的前体物质，Liu等在成品黄酒中添加酸性脲酶以研究酸性脲酶对成品酒中尿素的降解情况，但此方法工艺步骤繁琐，费时费力且存在酶活损失的问题，使得酸性脲酶在实际生产使用过程中对氨基甲酸乙酯的抑制效果不稳定。而能够专一降解发酵液中EC的氨基甲酸乙酯降解酶也因难以获得而无法推广；三是体外调控黄酒酿造代谢降低氨基甲酸乙酯，在黄酒酿造过程中添加化学物质，通过抑制EC前体物的形成，从而降低EC的含量。
公布号为CN 104845811A的专利文献公开了一种利用酒酒球菌降解氨基甲酸乙酯的黄酒酿造方法，包括浸米、蒸饭、淋水、落缸搭锅、加曲加水、发酵和后处理，在发酵后第5-20天，向发酵液中接种酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066。该发明通过添加能产生EC降解酶的酒酒球菌CICC6066，来降解在酿酒过程中所产生的EC。但是酒酒球菌添加不当容易造成酒的酸败。
竹子是禾本科(Gramineae)竹亚科(Bambusoideae)多年生常绿植物，有着复杂的次生代谢。因竹叶含有许多对人体具有重要作用的活性物质，所以竹叶在中国具有悠久的食用和药用历史，《本草求真》、《本草逢原》等古代医学著作均有大量记载。竹叶提取物(Extract of Bamboo Leaves，简称Ebl)是我国新开发的一类天然植物资源，具有优良的抗氧化、抗衰老、抗自由基及保护心血管、防治老年退行性疾病等生物学功效。有研究表明竹叶提取物是具有天然多功能的食品添加剂，可添加到酒、饮料中，可以保持酒体原有的品质，而且赋予产品淡雅的竹香和醇厚的口感。目前，我国研发的竹叶黄酮保健药品、竹叶啤酒和竹叶饮料已经上市，受到国内外广泛关注。竹啤是在啤酒生产过程中添加一定量的竹叶黄酮制成的新型营养啤酒，富有和谐的竹叶原味和自然清香。
竹叶提取物有效成分含黄酮、多糖、酚酸、氨基酸、微量元素，有优良的抗氧化、抗衰老、增强免疫力等生物学功效。原儿茶酸及没食子酸是有存在于竹叶提取物中酚酸物质，Alberto等研究发现原儿茶酸、没食子酸等酚酸可以影响L.hilgardii X1B菌株生长及其对精氨酸分解代谢，该菌株能够产生EC的前体物，而原儿茶酸、没食子酸等酚酸可以通过抑制精氨酸脱亚胺酶途径(ADI)途径减少精氨酸的降解，从而减少EC的形成。公布号为CN105543033A、CN105505684A的专利文献也表明黄酒发酵过程中添加原儿茶酸或没食子酸有助于降低EC含量。而目前有关竹叶提取物在黄酒酿造中调控EC代谢的报道没有，本发明是发现了一种体外调控黄酒酿造代谢形成氨基甲酸乙酯的技术方法。
技术实现要素：
本发明提供了一种利用竹叶提取物降低氨基甲酸乙酯含量的黄酒酿造方法，该方法无需引入基因工程菌株，也无需后续处理，能有效抑制氨基甲酸乙酯的形成，对成品黄酒的风味影响较小，能有效克服目前降解氨基甲酸乙酯的途径所存在的弊端。
一种利用竹叶提取物降低氨基甲酸乙酯含量的黄酒酿造方法，包括浸米、蒸饭、淋水、落缸搭窝、加曲加水、发酵和后处理，落缸搭窝后第2-5天，向发酵液中添加竹叶提取物。
竹叶提取物是新开发的一类具有多种生物学功效的天然植物资源，本申请在研究中发现，在发酵阶段加入竹叶提取物可有效抑制黄酒酿造过程中氨基甲酸乙酯的前体物质瓜氨酸和尿素向氨基甲酸乙酯转化，从而降低黄酒中氨基甲酸乙酯的含量。虽然添加竹叶提取物会对黄酒的风味物质有一定影响，但影响很小，证明竹叶提取物在黄酒酿造中的应用具备可行性。
所述竹叶提取物可采用市售产品，作为优选，竹叶提取物的总黄酮含量大于30％，总内酯含量大于15％，酚酸含量大于7.5％，有利于黄酒风味保持、品质增效。所述竹叶提取物可采用浙江圣氏生物科技有限公司产品。竹叶提取物的提取原料选新鲜竹叶，最好是现用现取，可采用大孔树脂法提取。大孔树脂是近10年发展起来的有机高分子聚合物吸附剂，它具有物化稳定性高，吸附选择性好、不受无机物存在的影响、使用周期长、节省费用等优点，避免了用有机溶剂提取分离所致的有机溶剂损耗大、环境污染等缺点，广泛用于黄酮类物质的提取。冯涛等选用12种大孔树脂，分别测定了竹叶黄酮的洗脱情况，筛选出对竹叶黄酮有较好吸附分离效果的树脂ADS-17，吸附率可达70.16％，解吸率达71.72％，最终产品中黄酮含量可达28.04％。其他如超临界CO，提取法、微波法、高速逆流色谱法(HSCCC)等常见的竹叶黄酮提取方法，由于竹叶本身条件的限制以及成本等因素目前尚难进行规模化生产。
所述浸米为将米置于水中浸泡。所述的米可以为糯米、粳米和籼米中的至少一种。以每千克米计，水的用量为1.0-1.5L；浸米温度为25-30℃，具体浸米时间根据米质、水温不同有所差异，一般在1-2天。本发明的选取的酿造原料是糯米。
所述蒸饭为保留附着在米上的水进行蒸煮，得到米饭。
所述淋水为使用洁净的冷水从蒸熟的米饭上淋下，使其降温至适合微生物繁殖的发酵温度，一般为25-30℃。
所述落缸搭窝为落缸时加入酒药，是酒药粉与糯米充分拌匀后达成凹形窝。作为优选，所述酒药的添加量为米重量的0.1-0.5％。酒药添加过多会大量消耗营养物质，以至于不足以支持微生物完成完整的发酵过程，添加过少达不到发酵效果。
作为优选，所述加曲加水为落缸搭窝30-40h后，加入麦曲和水。酒药与糯米混合后，需要一段时间增殖形成优势菌株，用于后续发酵产酒精，有利于抑制麦曲中的其他菌体繁殖。更为优选，落缸36h后加麦曲和水，组成发酵液进行发酵。
作为优选，所述麦曲的添加量为米重量的5-15％。麦曲的添加量要保证发酵过程的正常进行。以每千克米计，水的添加量为1-1.5L。
在发酵初期添加竹叶提取物，配合整个发酵过程，可有效抑制氨基甲酸乙酯的生成。竹叶提取物添加量过少，达不到抑制效果，同时，研究结果表明，在一定范围内，添加量越多，对氨基甲酸乙酯的生成抑制效果越好。
作为优选，在加曲加水时，同时向发酵液中添加竹叶提取物。
作为优选，以每升水计，所述竹叶提取物的添加量为200-500mg。本申请研究证明，竹叶提取物浓度在200-500mg/L时，可有效抑制氨基甲酸乙酯的产生；更为优选，以每升水计，所述竹叶提取物的添加量为350-500mg；最优选，以每升水计，所述竹叶提取物的添加量为500mg。在此添加浓度下酿制的黄酒中氨基甲酸乙酯的含量最少。
所述的发酵包括糖化阶段和发酵阶段，控制糖化阶段的温度为25-30℃，发酵阶段的温度为15-20℃，有利于产生较多的高级醇。整个发酵过程持续30-40天。
所述后处理包括榨酒、澄清、煎酒。
本发明具备的有益效果为：(1)本发明通过在发酵初期添加竹叶提取物，有效抑制在酿酒过程中前体物向氨基甲酸乙酯转化，进而降低产生的氨基甲酸乙酯的含量；(2)相比于单独添加原儿茶酸或没食子酸，竹叶提取物内质成分更丰富，用于黄酒酿造其产品的主要风味物质更丰富，更能保持黄酒品质，提升口感；(3)竹叶提取物是天然多功能的食品添加剂，具有多种生物学活性，可添加到酒、饮料中，可以保持酒体原有的品质，它的添加无需后续处理，能有效克服目前降解氨基甲酸乙酯的途径所存在的弊端。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例来阐释本发明。
实施例1利用竹叶提取物降解氨基甲酸乙酯的黄酒酿造方法
1、黄酒的酿造
选取糯米作为酿造原料。
将糯米与水按1∶1.2的比例，即糯米1kg，洁净水1.2L，在28℃下浸米2天；待米粒松软后，保留附着在大米上的水进行蒸煮；取煮熟后的糯米淋水；待淋水后糯米的品温下降到30℃后，落缸搭锅，落缸时加入0.2％的酒药，使酒药粉与糯米充分拌匀后搭成凹形窝。
落缸36h养窝结束后，加入10％麦曲和1.2L水进行发酵，以加入的水体积计，加入0.6g竹叶提取物(购于浙江圣氏生物科技有限公司)使其终浓度为500mg/L。前发酵温度控制在28℃，后发酵温度控制在18℃。
实验组为在加曲加水时加入竹叶提取物；对照组为未进行任何处理。
2、EC浓度的测定：采用反相液相色谱法(HPLC)。
色谱条件：色谱柱为C18反相柱(250×4.6mm，4μm)；
流动相为甲醇和水；
激发波长233nm，发射波长600nm；
柱温35℃；
进样量20μl；
跑样时间55min，梯度洗脱。
绘制标准曲线：取1ml标准品进样，在色谱检测条件下测定对应的峰面积值(A)，以峰面积值A为纵坐标，氨基甲酸乙酯浓度C为横坐标，绘制标准曲线，经统计处理求得氨基甲酸乙酯浓度与峰面积的线性回归方程为：A＝102683C-50645(R2＝0.9957)。
3、风味物质的检测：气相质谱联用仪，质谱仪Agilent Technologies 5977A；气相色谱仪：Agilent Technologies 7890B。
4、发酵液中EC含量的测定
对实验组和对照组样品，每隔7天左右取样分析，测定发酵液中EC的含量，结果见表1。
由结果可知，添加竹叶提取物的实验组氨基甲酸乙酯的含量一直低于自然发酵的对照组，EC含量变化略有起伏，对照组与实验组之间的差值在发酵第19天时最低，在发酵第33天后实验组的EC含量仍然低于对照组，且达到了最大差值，对照组的EC含量高于实验组0.62mg/L。可见竹叶提取物的加入起到了抑制EC产生的作用。
表1添加竹叶提取物对黄酒发酵中EC含量的影响
5、发酵液中瓜氨酸含量的测定
对实验组和对照组样品，每隔7天左右取样分析，测定发酵液中瓜氨酸的含量，结果见表2。
由结果可知，添加竹叶提取物的实验组中瓜氨酸的含量始终显著高于自然发酵的对照组，到发酵第33天已高于对照组20.148mg/L。表明添加了竹叶提取物以后可以有效抑制EC前体物瓜氨酸的转化，可见竹叶提取物的加入起到了抑制EC产生的作用。
表2添加竹叶提取物对黄酒发酵中瓜氨酸含量的影响
6、发酵液中尿素含量的测定
对实验组和对照组样品，每隔7天左右取样分析，测定发酵液中尿素含量，结果见表3。
由结果可知，添加竹叶提取物的实验组中尿素的含量显著高于自然发酵的对照组，且变化平稳，到发酵第33天已高于对照组5.831mg/L。表明添加了竹叶提取物以后可以显著抑制EC前体物尿素的转化，可见竹叶提取物的加入起到了抑制EC产生的作用。
表3添加竹叶提取物对黄酒发酵中尿素含量的影响
7、发酵液中风味物质含量的测定
对实验组和对照组样品，每隔7天左右取样分析，测定发酵液中风味物质含量，结果见表4。从表中数据可以看出，造成黄酒主要芳香物质的苯乙醇、琥珀酸二乙酯存在于实验组和对照组，差异较小。异戊醇同样作为重要的风味物质，在实验组中未见存在。但是实验组的芳香物质种类明显多于对照组，且酯类物质含量显著高于对照组。可见添加竹叶提取物会对黄酒的风味物质有一定影响。添加了竹叶提取物的实验组的主要风味物质总量为77.2％，而添加了原儿茶酸的公布号为CN105543033A的专利文献中的实验组主要风味物质总量为70.53％、而添加了没食子酸的公布号为CN105505684A的专利文献中的实验组主要风味物质总量为69.28％。可见相较于原儿茶酸和没食子酸，竹叶提取物更能保持黄酒品质，提升口感。
表4添加竹叶提取物对黄酒发酵中风味物质的影响
实施例2利用竹叶提取物降解氨基甲酸乙酯的黄酒酿造方法
参照实施例1的黄酒酿造工艺，在加曲加水阶段，以加入的水体积计，向发酵液中添加0.3g竹叶提取物(购于浙江圣氏生物科技有限公司)使其浓度为250mg/L，其他条件同实施例1。
EC浓度的检测方法同实施例1。
按照本实施例的方法，发酵33天后检测到发酵液中的EC浓度为1.40mg/L。
根据实施例1-2的结果可知，添加竹叶提取物酿造的黄酒中EC含量均低于自然发酵的对照组，竹叶提取物的浓度在200～500mg/L时可以抑制EC的产生，且浓度为500mg/L时效果最好，即在该浓度范围内，竹叶提取物的添加量越多，对氨基甲酸乙酯的生成抑制效果越好。