本发明涉及短管兔耳草提取物其制备方法和应用、含其的皮肤外用剂。
背景技术：
1956年Harman提出了自由基衰老学说[Harman,D.Aging:A theory based on free radical and radiation chemistry.J.Gerontol.1956,11:289-300.]，认为过多的自由基是造成生物老化的重要原因。根据这一理论，体内过量的活性氧自由基与不饱和脂肪酸作用产生丙二醛等物质，丙二醛将与细胞膜上的蛋白质等作用生产褐色素，沉淀于皮肤便成为各种色斑。过量的自由基还能使皮肤内的胶原纤维、弹性纤维发生交联和变性、变脆、失去弹性，当皮肤水分不足时，容易使弹性纤维断裂，出现暗纹、细纹、皱纹等皮肤老化现象。此外，环境中的离子辐射以及诸如空气污染与化学物质等的环境污染物，也会使生物体内不断的产生自由基。例如环境中的紫外线会使皮肤真皮中的纤维母细胞及线粒体受到刺激，进而释放出超氧阴离子，而过量的超氧阴离子则会转换成其它破坏性更强的自由基。虽然人体内具有能够维持氧化与抗氧化之间平衡状态的抗氧化防御系统，用以减缓活性氧及自由基的产生，但若是长期过度的曝晒在阳光下，则人体内大量产生的自由基会导致皮肤的抗氧化防御能力降低，造成皮肤的伤害，例如光老化、表皮皱纹、皮肤免疫力失调等。抗氧化剂是具有捕捉自由基能力的物质，可以清除皮肤中的活性自由基，减轻自由基引起的皮肤氧化应激损伤，从而改善由氧化应激等造成的皮肤老化。目前已知有维生素E、维生素C等生物体内的清除自由基型抗氧化剂，另外也报道了植物来源的抗氧化剂如莲花、梅果提取物等(专利文献CN201110158540含有莲花提取物和乌梅提取物作为有效成分而具有抗氧化活性的皮肤外用剂组合物)。
关于皮肤黑色素的形成，目前研究表明主要是由于黑素细胞内的生物化 学反应引起，即酪氨酸在作为催化剂的酪氨酸酶的作用下，生成多巴醌，再通过酶的催化作用或非酶的氧化作用形成黑色素。关于抑制上述黑色素生成的美白活性物，通常以抑制酪氨酸酶活性为主要靶点。来源于植物提取物的酪氨酸酶抑制剂作为潜在的美白活性物，同时又具有安全性和对皮肤低刺激性的预期，目前已有各种开发的报道(专利文献CN201310411195白蔹提取物美白功效的检测方法；CN201310382406白木香果皮提取物在制备美白化妆品中的应用)。
皮肤胶原约占干燥皮肤重量的75％，是皮肤细胞外基质的重要组成成分，起着皮肤结构的支撑体功能，并提供皮肤的抗拉和弹力等重要功能。正常皮肤中胶原的生成和分解在生物调节作用下处于平衡状态，随着年龄增长，以及紫外线辐射等环境因素引起生物调节功能减弱，胶原的分解作用大于生成作用时，皮肤中胶原含量的下降，皮肤相应出现弹力减少、皱纹产生等皮肤老化现象。而通过合适的植物提取物调节胶原蛋白的生成，或者适当增加可以产生的胶原蛋白的成纤维细胞的数量，就可以期待会对皮肤老化的现象有所改善，目前已有报道红杉新芽、越桔新芽等来自植物提取物的抑制皮肤老化成分具有类似的改善皮肤老化机理(专利文献CN200980106591.8含有植物的新芽提取物的用于抑制皮肤老化的组合物)。
短管兔耳草Lagotis brevituba Maxim是玄参科兔耳草属植物，生于海拔3000～4850米的高山草甸及倒石堆、碎石带上。主要分布于青海、西藏、甘肃等省区。全草入药，具退热、降血压、调经解毒之功效；治疗全身发热、肾炎、肺病、阴道流黄黑色液物、湿热泻痢、高血压病、动脉粥样硬化症、月经不调、治痨热咳嗽、霍乱、伤寒、黄疸、目赤、综合性毒物中毒及“心热”等疾病，《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药》(第1册)载入的兔耳草(藏名洪连)为玄参科植物短管兔耳草Lagotis brevituba Maxim(藏名红林)或全缘兔耳草L.integra W.Smith(藏名洪连)的干燥全草。性味苦、甘、寒。具清热解毒，行血调经之功能。全身发热、肾炎、肺病、高血压病、动脉粥样硬化、月经不调、综合性毒物中毒及“心热”症。
史高峰等对短管兔耳草的化学成分进行了系统的分析和研究，从中分离鉴定了5个已知化合物，分别为β-谷甾醇(β-sitosterol)，软脂酸单甘油脂(palmitic monloglycerol ester)，琥珀酸(succinicacid)，木犀草素(luteolin)，木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷(luteolin-7-O-β-D-glucoside)。现代药理学研究显示短管兔耳草水提物对大鼠血清性关节肿有明显的抑制作用，对大鼠头部急性充血性水肿(急性炎症)有显著的抑制作用。短管兔耳草对大鼠甲醛性关节炎(亚急性炎症)有明显地预防作用；另有研究显示短管兔耳草的总提取物对P388抑制率实验和小白鼠抗癌实验，发现短管兔耳草具有一定的抗肿瘤作用。此外，青海省药品检验药物研究所的姜平、杨娜等在1984年对大鼠进行了胃溃疡、镇静和毒性实验，将其分为短管兔耳草实验组、盐水对照组和胃膜素对照组。结果发现，以溃疡面积和溃疡容积为指标，短管兔耳草与盐水对照组比较，有显著差异，说明短管兔耳草水提物对大鼠慢性胃溃疡的愈合有明显的促进作用，且较胃膜素对照组的疗效为优。通过镇静实验，结果显示短管兔耳草水提物可显著延长戊巴比妥钠的睡眠时间，说明其对小鼠有较好的镇静作用。
综合短管兔耳草近年来的研究进展，在其化学成分、提取分离、药理活性方面的研究还处于初步研究阶段。对药效作用部位及作用机理方面的研究还只是一片空白。鉴于短管兔耳草在藏药中的广泛应用及其丰富的自然资源，对短管兔耳草进一步的研究及有效合理地开发利用是十分必要的。尤为重要的是，目前为止，未发现短管兔耳草在化妆品领域，尤其是抗衰老和美白的用途和报道。寻找安全有效、抗衰老和美白效果好的皮肤外用剂是目前急需解决的技术问题。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中化妆品抗衰老和美白效果差、安全性低等缺陷而提供了短管兔耳草提取物其制备方法和应用、含其的皮肤外用剂。本发明的含短管兔耳草提取物的组合物自由基清除率高、 酪氨酸酶抑制作用显著、弹性蛋白酶抑制作用显著、抗氧化和老化效果明显、同时表现出优良的美白性，并且天然、安全，可用作皮肤外用剂的美白活性成分和抗衰老活性成分。本发明的皮肤外用剂成分天然、安全，并具有美白、抗氧化和老化的功效，具有良好的市场应用前景。
本发明提供了一种短管兔耳草提取物的制备方法，其采用方法1或方法2：
所述的方法1包括如下步骤：将短管兔耳草粉末与体积浓度为50％～80％的乙醇水溶液形成的混合物，在10℃～35℃下提取0.5小时～5小时，固液分离得滤液，滤液脱除溶剂，即得短管兔耳草粗提物；其中，所述的短管兔耳草粉末与所述的乙醇水溶液的质量体积比为(1：8)g/mL～(1：15)mg/mL；所述的体积浓度是指乙醇的体积与乙醇水溶液总体积的百分比。
所述的方法2包括如下步骤：将方法1得到的短管兔耳草粗提物，上样到大孔树脂填充柱，依次用溶剂Ⅰ、溶剂Ⅱ和溶剂Ⅲ洗脱，分别收集洗脱液，并脱除溶剂后，相应地得到溶剂洗脱部位A、溶剂洗脱部位B和溶剂洗脱部位C。所述的溶剂I、所述的溶剂II和所述的溶剂III分别为体积浓度为20％～30％的乙醇水溶液、体积浓度为40％～50％的乙醇水溶液和体积浓度为60％～70％的乙醇水溶液。溶剂I对应溶剂洗脱部位A；溶剂II对应溶剂洗脱部位B；溶剂III对应溶剂洗脱部位C。
方法1中，所述的短管兔耳草(Lagotis brevituba Maxim或者L.integra W.Smith)为玄参科(Scrophulariaceae)兔耳草属(Lagotis)植物。
方法1中，所述的短管兔耳草粉末的粒度较佳地为20目～60目。
方法1中，所述的提取为本领域中该类操作的常规方法，较佳地为超声提取。所述的超声提取的功率较佳地为500w～1000w。
方法1中，所述的提取的温度较佳地为20℃～25℃。
方法1中，所述的提取的时间较佳地为0.5小时～1小时。
方法1中，所述的提取的次数较佳地为1～2次。
方法1中，所述的短管兔耳草粉末与所述的乙醇水溶液的质量体积比较 佳地为(1:10)g/mL～(1:15)g/mL，更佳地为(1:10)g/mL～(1:12)g/mL。
方法1中，所述的乙醇的体积浓度较佳地为70％。
方法1中，所述的固液分离的方法为本领域中该类操作的常规方法，较佳地为过滤、压滤或离心。
方法1中或方法2中，所述的滤液脱除溶剂的方法为本领域中该类操作的常规方法，较佳地为减压旋蒸。所述的减压旋蒸的操作条件为本领域中该类操作的常规条件。
方法1中所述的“滤液脱除溶剂”，可以为脱除全部溶剂或者仅脱除乙醇。当方法1中所述的“滤液脱除溶剂”为脱除全部溶剂时，方法2中所述的“将方法1得到的短管兔耳草粗提物，上样到大孔树脂填充柱”需要将方法1得到的短管兔耳草粗提物用水溶解后，再上样到大孔树脂填充柱。当方法1中所述的“滤液脱除溶剂”为仅脱除乙醇时，得到的短管兔耳草粗提物中含有水，方法2中所述的“将方法1得到的短管兔耳草粗提物，上样到大孔树脂填充柱”就可以直接将方法1得到的短管兔耳草粗提物，上样到大孔树脂填充柱，而不需要将方法1得到的短管兔耳草粗提物用水溶解后，再上样到大孔树脂填充柱。
方法2中，所述的大孔树脂填充柱为本领域常规的大孔树脂填充柱，较佳地为D101、AB-8或ADS-8树脂填充柱，更佳地为AB-8树脂填充柱。
方法2中，所述的溶剂Ⅰ较佳地为体积浓度为30％的乙醇。所述的溶剂Ⅱ较佳地为体积浓度为50％的乙醇。所述的溶剂Ⅲ较佳地为体积浓度为70％的乙醇。
方法2中，所述的溶剂Ⅰ、溶剂Ⅱ、溶剂Ⅲ的用量分别较佳地为500mL～800mL。所述的溶剂Ⅰ、溶剂Ⅱ或溶剂Ⅲ的用量可以相同或不同，较佳地所述的溶剂Ⅰ、溶剂Ⅱ或溶剂Ⅲ的用量相同。
方法2中，所述的脱除溶剂的方法为本领域中该类操作的常规方法，较佳地为减压旋蒸。所述的减压旋蒸的操作条件为本领域中该类操作的常规条件。
本发明还提供了所述的制备方法制得的短管兔耳草提取物。所述的短管兔耳草提取物包括方法1制得的短管兔耳草粗提物、方法2制得的溶剂洗脱部位A、方法2制得的溶剂洗脱部位B和方法2制得的溶剂洗脱部位C中的一种或多种。所述的短管兔耳草提取物较佳地为方法2制得的溶剂洗脱部位C。
本发明还提供了所述的短管兔耳草提取物在制备皮肤外用剂中的应用。
本发明中，所述的短管兔耳草提取物在制备皮肤外用剂时作为美白活性成分、抗老化活性成分和抗氧化活性成分中的一种或多种，较佳地作为抗氧化活性成分。
本发明中，所述的皮肤外用剂包括本领域常规的具备疾病治疗用途的药物，或者不具备疾病治疗用途的化妆品。
本发明还提供了一种包括所述的短管兔耳草提取物的皮肤外用剂。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的短管兔耳草提取物具有较好的美白、抗老化和抗氧化的功效，有良好的市场化前景。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1以体积浓度为50％的乙醇水溶液为提取溶剂(方法1)
短管兔耳草干燥粉末20g(短管兔耳草粉末的粒度为20目)，室温下(25℃)下以体积浓度为50％的乙醇水溶液200ml、超声提取2次，每次30min(功率500W)，取滤液合并，减压(50℃)回收溶剂至干，取提取物适量，加DMSO(二甲亚砜)配制成0.05mg/ml的溶液备用，测定其自由基清除作 用，其自由基清除率为15％。
实施例2以体积浓度为60％的乙醇水溶液为提取溶剂(方法1)
短管兔耳草干燥粉末20g(短管兔耳草粉末的粒度为30目)，室温(25℃)下以体积浓度为60％的乙醇水溶液200ml、超声提取2次，每次30min(功率500W)，取滤液合并，减压(50℃)回收溶剂至干，取提取物适量，加DMSO(二甲亚砜)配制成0.05mg/ml溶液备用，测定其自由基清除作用，其自由基清除率为17％。
实施例3以体积浓度为70％的乙醇水溶液为提取溶剂(方法1)
短管兔耳草干燥粉末20g(短管兔耳草粉末的粒度为40目)，室温(25℃)下以体积浓度为70％的乙醇水溶液200ml、超声提取2次，每次30min(功率500W)，取滤液合并，减压(50℃)回收溶剂至干，取提取物适量，加DMSO(二甲亚砜)配制成0.05mg/ml溶液备用，测定其自由基清除作用，其自由基清除率为48％。
实施例4以体积浓度为80％的乙醇水溶液为提取溶剂(方法1)
短管兔耳草干燥粉末20g(短管兔耳草粉末的粒度为50目)，室温(25℃)下以体积浓度为80％乙醇200ml、超声提取2次，每次30min(500W)，取滤液合并，减压(50℃)回收溶剂至干，取提取物适量，加DMSO(二甲亚砜)配制成0.05mg/ml溶液备用，测定其自由基清除作用，其自由基清除率为23％。
实施例5短管兔耳草与所述的乙醇水溶液的质量体积比为(1:8)g/mL进行提取
短管兔耳草干燥粉末20g(短管兔耳草粉末的粒度为60目)，室温(25℃)下以体积浓度为70％的乙醇水溶液160ml、超声提取2次，每次30min(功率500W)，取滤液合并，减压(50℃)回收溶剂至干，取提取物适量，加DMSO(二甲亚砜)配制成0.05mg/ml溶液备用，测定其自由基清除作用，其自由基清除率为28％。
实施例6短管兔耳草与所述的乙醇水溶液的质量体积比为(1:10)g/mL 进行提取
短管兔耳草干燥粉末20g(短管兔耳草粉末的粒度为60目)，室温(25℃)下以体积浓度为70％的乙醇水溶液200ml冷浸、超声提取2次，每次30min(功率500W)，取滤液合并，减压(50℃)回收溶剂至干，取提取物适量，加DMSO(二甲亚砜)配制成0.05mg/ml溶液备用，测定其自由基清除作用，其自由基清除率为48％。
实施例7短管兔耳草与所述的乙醇水溶液的质量体积比为(1:12)g/mL进行提取
短管兔耳草干燥粉末20g(短管兔耳草粉末的粒度为60目)，室温(25℃)下以体积浓度为70％乙醇水溶液240ml、超声提取2次，每次30min(500W)，取滤液合并，减压(50℃)回收溶剂至干，取提取物适量，加DMSO(二甲亚砜)配制成0.05mg/ml溶液备用，测定其自由基清除作用，其自由基清除率为48％。
实施例8短管兔耳草与所述的乙醇水溶液的质量体积比为(1:15)g/mL进行提取
短管兔耳草干燥粉末20g(短管兔耳草粉末的粒度为60目)，室温(25℃)下以体积浓度为70％的乙醇水溶液300ml、超声提取2次，每次30min(功率500W)，取滤液合并，减压(50℃)回收溶剂至干，取提取物适量，加DMSO(二甲亚砜)配制成0.05mg/ml溶液备用，测定其自由基清除作用，其自由基清除率为39％。
实施例1-8的结果表明：选取以体积浓度为70％的乙醇溶液为提取溶剂，短管兔耳草与乙醇水溶液的质量体积比为1:10g/mL提取效果最佳。
实施例9
取短管兔耳草干燥粉末50g(短管兔耳草粉末的粒度为60目)，室温(25℃)下以体积浓度为70％的乙醇水溶液500ml、超声提取2次，每次30min(功率500W)，滤液合并(约900ml)，减压(50℃)回收溶剂至无醇味(即仅除去乙醇)，过AB-8树脂，依次以500ml体积浓度为30％的乙醇水溶液， 500ml体积浓度为50％的乙醇水溶液和500ml体积浓度为70％的乙醇水溶液洗脱，分别收集各洗脱液(各约400ml)，蒸干，分别得到洗脱部位A(对应体积浓度为30％的乙醇水溶液的洗脱剂，1.85g)、溶剂洗脱部位B(对应体积浓度为50％的乙醇水溶液的洗脱剂，1.05g)和溶剂洗脱部位C(对应体积浓度为70％的乙醇水溶液的洗脱剂，0.78g)。
效果实施例1
本效果实施例考察的是短管兔耳草提取物的抗氧化活性。按照实施例1-9制备的短管兔耳草提取物，测定其清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力。
测定步骤为：将短管兔耳草提取物分别用去离子水配制成水溶液，移取2mL于10mL具塞试管中，加入2mL DPPH乙醇溶液(2×10-4mol/L)，充分混匀，室温静置，30min后用分光光度计测定517nm波长的吸光度A517；同时测定2mL提取物溶液与2mL乙醇混合后的吸光度A0，2mL水与2mL DPPH乙醇溶液混合后的吸光度C以及2mL水与2mL乙醇溶液混合后的吸光度C0。平行测定三次，取平均值，根据以下公式计算自由基清除率，清除率越大，说明提取物的抗氧化能力越强。
自由基清除率(％)＝[1-(A517-A0)/(C-C0)]×100％。
表1 DPPH法自由基清除活性的测定结果
由表1可见，短管兔耳草提取物具有很强清除自由基的能力，经大孔吸附树脂分离后得到的短管兔耳草体积浓度为70％的乙醇水溶液洗脱部位清除自由基的活性最强。
效果实施例2
本效果实施例考察的是短管兔耳草提取物对于酪氨酸酶的抑制活性。按照实施例9制备的短管兔耳草提取物，溶于去离子水，配制成水溶液，用于测定酪氨酸酶抑制活性。测定步骤为：磷酸盐缓冲溶液(pH6.8，30mM)70μL、1.66mM酪氨酸溶液80μL、样品溶液80μL混合均匀，在37℃恒温水槽中温育5分钟，加入酪氨酸酶溶液(125U/mL)10μL，在37℃恒温10min后，用酶标仪测定475nm波长的吸光度A475。用去离子水替换样品水溶液，作为参比溶液同样测定吸光度，结果见表2。
酪氨酸酶活性抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(A0-(A475-B))/A0×100％，其中A0是参比溶液的吸光度，A475是样品溶液的吸光度，B是样品空白水溶液的吸光度。
表2 酪氨酸酶抑制活性的测定结果
由表2可知，在本发明中使用的各短管兔耳草提取物都具有酪氨酸酶活性抑制作用。其中，经大孔吸附树脂分离后得到的短管兔耳草体积浓度为70％的乙醇水溶液洗脱部位抑制酪氨酸酶作用较强，可以将其配合在外用剂中，作为防止肌肤色素沉着的美白活性物使用。
效果实施例3
本效果实施例考察的是短管兔耳草提取物的抗老化活性。按照实施例9制备的短管兔耳草提取物，溶于去离子水，配制成水溶液，用于测定弹性蛋白酶抑制活性。测定方法按照文献(Am.J.Pharmacol.Toxicol.,2009,4,127-129)方法进行，测定步骤为：在96孔板中加入10μL样品溶液和130μL含有1.015mM反应底物Succ-Ala-Ala-Ala-p-硝基酰替苯胺的0.1M Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)，在25℃下温育5分钟，加入15μL弹性蛋白酶溶液(0.5U/mL)，继续在25℃下温育30min，然后用酶标仪测定410nm波长的吸光度A410。用去离子水替换样品水溶液，作为参比溶液同样测定吸光度，结果见表3。
弹性蛋白酶活性抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(A0-(A410-B))/A0×100％，其中A0是参比溶液的吸光度，A410是样品溶液的吸光度，B是样品空白溶液的吸光度。
表3 弹性蛋白酶活性抑制的测定结果
由表3可知，在本发明中使用的短管兔耳草提取物均具有抑制弹性蛋白酶作用，其中，经大孔吸附树脂分离后得到的短管兔耳草体积浓度为70％的乙醇水溶液洗脱部位抑制弹性蛋白酶作用最强，可以将其配合在外用剂中，作为防止肌肤老化、维持年轻健康的肌肤状态的抗老化剂使用。